42种中草药提取物对产气荚膜梭菌体外抑菌作用比较

观察杜仲叶、黄连、地锦草、地榆和地丁等42种常见中草药提取物对产气荚膜梭菌的体外抑菌活性。采用牛津杯方法测定42种中草药提取物对产气荚膜梭菌的抑菌作用,筛选出对产气荚膜梭菌抑菌效果好的提取物,进一步采用试管二倍稀释法测定其对产气荚膜梭菌的最小抑菌浓度(MIC)。42种中草药提取物中黄柏、黄连、地锦草、大黄、厚朴、诃子、地榆和洋槐花的抑菌效果最好(抑菌圈直径≥20 mm)。MIC结果显示,黄连提取物的抑菌效果最强,MIC值为0.47 mg/mL。厚朴、诃子和洋槐花MIC值分别为3.75 mg/mL、15 mg/mL和3.75 mg/mL。42种中草药提取物中,黄连提取物对产气荚膜梭菌抑菌效果最强,同时厚朴、诃子和洋槐花3种药食同源的中药提取物具有较好的抑菌效果,有望开发为中草药添加剂应用于预防和治疗产气荚膜梭菌引起的畜禽肠道感染。     

不同抗生素对产气荚膜梭菌的抑菌效果研究

本文旨在研究不同抗生素对产气荚膜梭菌的抑菌试验,筛选出对产气荚膜梭菌抑菌敏感性强的药物,帮助饲料、养殖企业选择抗生素控制产气荚膜梭菌提供理论依据。试验选择恩拉霉素、维吉尼亚霉素、杆菌肽锌、金霉素、阿维拉霉素、那西肽、林可霉素等7种生产中较常用的抗生素,采用试管稀释法对鸡源产气荚膜梭菌CVCC52标准株和猪源产气荚膜梭菌CVCC2038标准株进行抑菌试验。试验结果表明：（1）除金霉素外,其他药物对鸡源和猪源产气荚膜梭菌均有不同程度的抑制作用。（2）恩拉霉素的抑制作用最强,对CVCC52的MIC为0.6μg/mL,对CVCC2038的MIC为0.2μg/mL;（3）其次为阿维拉霉素,对CVCC2038的MIC为0.25μg/mL;（4）维吉尼亚霉素次之,对CVCC52的MIC为0.8μg/mL,对CVCC2038的MIC为0.8μg/mL。通过对以上7中抗生素对产气荚膜梭菌的抑菌试验结果表明,恩拉霉素对产气荚膜梭菌的抑菌效果最佳。     

羊梭菌病快速鉴别PCR方法的建立及初步应用

根据GenBank已公布的产气荚膜梭菌和腐败梭菌的α毒素基因序列,分别设计并合成针对2种α毒素基因的特异性引物,通过扩增条件的优化,建立快速鉴别产气荚膜梭菌和腐败梭菌的双重PCR方法。特异性试验显示,产气荚膜梭菌和腐败梭菌参考菌株均扩增出了相应的预期目的条带,而大肠埃希菌、沙门菌、金黄色葡萄球菌和链球菌则均未能扩增出相应条带。灵敏度试验结果显示,产气荚膜梭菌和腐败梭菌基因组DNA最低检测量分别为17.95pg/μL和1.261pg/μL。应用该方法对样品进行检测,其中5份为产气荚膜梭菌阳性。成功建立了特异性强、敏感性高的双重PCR方法,可以有效进行产气荚膜梭菌和腐败梭菌的快速鉴别,对羊梭菌病病原快速鉴定及流行病学调查具有重要意义。     

细菌敏感精油的筛选及与乳化剂组合的抑菌效果研究

为了筛选常见病原菌敏感的精油和乳化剂,首先采用牛津杯法测定了12种精油对产气荚膜梭菌、大肠埃希氏菌和鼠伤寒沙门氏菌的抑菌作用,然后将筛选出的5种抑菌效果较好的精油与吐温系列乳化剂分别按不同比例互作,测定对上述3种细菌的最小抑菌浓度(MIC),最后根据MIC结果,测定产气荚膜梭菌在低于精油MIC下的生长曲线以及在MIC下的菌体形态变化。结果显示,肉桂醛对产气荚膜梭菌最敏感,且10%吐温40乳化肉桂醛可显著降低对产气荚膜梭菌的MIC;生长曲线表明1/2、1/4、1/8MIC的肉桂醛对产气荚膜梭菌的生长均有明显抑制作用;扫描电镜显示肉桂醛作用后的产气荚膜梭菌形态发生明显改变。肉桂醛对产气荚膜梭菌的抑菌效果优于其他精油。试验结果为临床防治产气荚膜梭菌引发的梭菌性肠炎提供了科学依据。     

多种饲料添加剂类抗生素对猪源产气荚膜梭菌的抑菌效果研究

本试验目的在于研究多种不同饲料添加剂类抗生素对产气荚膜梭菌的抑菌试验,筛选出对产气荚膜梭菌抑菌效果强的药物,为饲料、养殖业临床上控制产气荚膜梭菌提供理论依据。试验选用喹乙醇、4%恩拉霉素、盐霉素、硫酸黏霉素、15%杆菌肽锌、黄霉素、吉他霉素和盐酸金霉素八种饲料常用抗生素添加剂,采用试管稀释法对猪源产气荚膜梭菌野毒株进行抑菌试验。试验结果表明:(1)恩拉霉素抑菌作用最强,其MIC为1.6μg/m L;(2)喹乙醇和15%杆菌肽锌抑菌作用较强,它们的MIC分别为4μg/m L和6μg/m L;(3)黄霉素、硫酸黏霉素、吉他霉素抑菌作用较弱,它们的MIC分别为40μg/m L、200μg/m L、300μg/m L;(4)盐霉素及盐酸金霉素对该产气荚膜梭菌野毒株几乎没有抑菌作用。由以上八种抗生素对产气荚膜梭菌的抑菌试验结果得出,八种抗生素对该产气荚膜梭菌野毒株均有不同程度的抑菌作用,而恩拉霉素对产气荚膜梭菌抑菌效果最强。     

绵羊大肠杆菌与A型产气荚膜梭菌混合感染的病原分离鉴定

试验旨在对宁夏一绵羊场疑似大肠杆菌与A型产气荚膜梭菌混合感染的死亡病例进行确诊并提出相应的防治方案。采用产气荚膜梭菌显色培养基及伊红美蓝固体培养基进行病原分离培养,对分离菌株进行16S rRNA基因序列PCR检测,依据16S rRNA序列构建分离株分子进化树;之后对大肠杆菌分离株毒素因子进行PCR检测,对产气荚膜梭菌分离株进行毒素分型鉴定。结果显示,分离株PCR检测获得了16S rRNA特异性条带;分子进化树结果显示,大肠杆菌分离菌株NXDC001与大肠杆菌在同一分支,产气荚膜梭菌分离菌株NXSJ001与产气荚膜梭菌在同一分支。大肠杆菌分离株检测出毒素因子HPI (irp2)及LEE (eae);产气荚膜梭菌分离株携带毒素因子cpa,证明分离株为A型产气荚膜梭菌。研究表明,试验成功分离鉴定大肠杆菌及A型产气荚膜梭菌各一株,证明病死羊为大肠杆菌及A型产气荚膜梭菌混合感染。     

规模化养鸡场A型产气荚膜梭菌的分离鉴定及其对海南霉素敏感性的测定

为探究海南霉素对产气荚膜梭菌的敏感性,在某大型养鸡场采集了209份鸡肠道样本,采用选择性培养基和MALDI-TOF质谱仪微生物鉴定仪鉴定,并对鉴定的菌株进行分型。采用琼脂稀释法测定了海南霉素、恩拉霉素、盐霉素、丁酸甘油酯对临床分离的产气荚膜梭菌的抗菌活性,以期为当前限抗禁抗后养殖场选择合适的药物控制产气荚膜梭菌提供理论依据。试验结果表明：共分离出61株产气荚膜梭菌,分离率为29.2%;通过多重PCR对所分离的产气荚膜梭菌进行分型,结果分离株均为A型产气荚膜梭菌;4种药物均有不同程度的抑菌效果,其中海南霉素与恩拉霉素对鸡源产气荚膜梭菌的抑菌效果最好,且MIC值范围均为0.004～0.06μg/mL。海南霉素具有很好的抗梭菌效果。     

安徽部分地区冷鲜鸡产气荚膜梭菌的污染分析

产气荚膜梭菌是动物肠道中的条件致病菌,是引起畜禽及人类多种重要疾病的主要病原,是一种人畜共患性疾病,在禽类会引起鸡最重要的肠炎性疾病,给全世界带来巨大损失。本试验从安徽各地区的市场和超市分批进行采购冷鲜鸡,随后,对其进行产气荚膜梭菌的分离培养,进行生化试验、分子分型试验并研究青霉素等药物的抑菌效果,为产气荚膜梭菌的诊断和预防提供理论和实践基础,对防控人的产气荚膜梭菌性疾病和鸡的坏死性肠炎提供参考。     

犬A型产气荚膜梭菌灭活疫苗的制备及免疫学评价

产气荚膜梭菌是引起犬猝死症的主要病原菌,目前临床上还没有预防犬猝死症的疫苗。本试验以分离自犬的A型产气荚膜梭菌为制苗菌株,首先对利用甲醛进行产气荚膜梭菌培养液脱毒的浓度和时间进行了优化,然后利用脱毒后的产气荚膜梭菌培养液对小鼠和犬进行免疫,并对不同佐剂(铝佐剂和油佐剂)和不同免疫途径(皮下注射和腹腔注射)的免疫效果进行评价。结果显示,产气荚膜梭菌灭活疫苗具有良好的免疫保护效果,免疫后小鼠体内可产生高水平的血清抗体,抗体效价最高可达6.25×104。产气荚膜梭菌铝胶灭活疫苗对犬具有良好的安全性,单次免疫(4mL/只)或2次免疫(2mL/只)均可产生良好的免疫保护效果(5/5)。结果表明,本试验制备的犬A型产气荚膜梭菌灭活疫苗可用于预防犬产气荚膜梭菌感染。     

C、D型二价产气荚膜梭菌抗毒素血清的制备及保护效果评价

为治疗产气荚膜梭菌感染引起的疾病,研究制备了产气荚膜梭菌多价高效抗毒素血清。试验采用C、D型产气荚膜梭菌标准菌株,制备了高浓度外毒素和灭活疫苗,作为免疫原多次免疫绵羊,通过间接ELISA法监测绵羊抗体水平变化,采用小鼠中和试验检验绵羊抗毒素血清保护效果。结果表明:制备的高效价抗C、D型产气荚膜梭菌毒素血清每0.1 m L血清能中和400个C型毒素对小鼠的MLD和600个D型毒素MLD,有良好的应用前景。     

1株阿尔巴斯绒山羊源产气荚膜梭菌的毒素型鉴定和16S rRNA基因的遗传进化分析

为了了解1例经诊断为产气荚膜梭菌病而死亡的阿尔巴斯种绒山羊感染的产气荚膜梭菌的毒素型和16S rRNA基因的遗传进化特性,试验设计5对特异性毒素引物,采用PCR方法进行毒素型的鉴定,对16S rRNA基因扩增和测序,对测序结果进行遗传进化分析。结果表明：只有α毒素引物扩增出约475 bp长的目的条带,阿尔巴斯绒山羊梭菌性肠炎的致病菌毒素为α毒素,为A型产气荚膜梭菌,其16S rRNA基因序列与天津地区产气荚膜梭菌(登录号为KP944160.1)位于同一分支,亲缘关系最近,核苷酸相似性为98.53%。说明此次阿尔巴斯绒山羊感染的产气荚膜梭菌的毒素型是A型,且鉴定菌株与天津地区产气荚膜梭菌(登录号为KP944160.1)起源于共同的祖先。     

羊源产气荚膜梭菌不同毒素型多重PCR检测方法的建立及初步应用

根据GenBank中已发布的产气荚膜梭菌α,β,ε,ι毒素基因序列,设计并合成4对特异性引物,经过优化多重PCR反应条件,建立了检测产气荚膜梭菌不同毒素型多重PCR方法。特异性试验表明,该方法对A,B,C,D,E型产气荚膜梭菌标准菌株均扩增出了相应的目的条带,而对诺维氏梭菌和腐败梭菌扩增为阴性;灵敏性试验表明,该方法对A,B,C,D,E型标准菌株基因组DNA最低检测量分别为9.0,17.8,12.2,13.8,18.5pg;重复性试验表明,该方法有很好的重复性。应用所建立的方法从21份羊临床病料中检测出9株A型和1株C型产气荚膜梭菌。本试验建立的多重PCR方法可以进行产气荚膜梭菌的快速检测及5种毒素型的鉴别。     

一例小尾寒羊魏氏梭菌的分离鉴定

本实验从一例被魏氏梭菌感染的小尾寒羊体内分离纯化得到的致病菌,经生化试验、动物致病性试验、微生物学诊断及分子生物学试验,来证明该致病菌为C型产气荚膜梭菌。并通过药敏试验筛选出对梭菌有良好治疗效果的药物。本试验的结果为今后小尾寒羊感染产气荚膜梭菌的预防及诊断提供了一定的科学依据。     

产气荚膜梭菌cpe~+菌株的筛选与鉴定

参考相关资料,针对产气荚膜梭菌肠毒素基因(cpe)设计合成1对特异性引物,对34株贵州分离株进行PCR扩增,并将扩增产物连接到pMD18-T载体,转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞,提取质粒进行PCR和双酶切鉴定后测序和分析。结果在34株产气荚膜梭菌贵州分离株中有1株C型菌株扩增出与预期大小相一致的目的片段,经克隆测序后,该片段大小为233 bp,其与产气荚膜梭菌参考株肠毒素基因序列的核苷酸同源性为99.6%~100%,推导氨基酸同源性为98.7%~100%,表明所扩增产物为产气荚膜梭菌的肠毒素基因片段。本试验筛选鉴定出1株产气荚膜梭菌cpe+菌株,为今后进一步探讨产气荚膜梭菌性食物中毒机制奠定了基础。     

犬产气荚膜梭菌的分离和PCR检测方法的建立

从12头疑似产气荚膜梭菌感染的猝死警犬中分离获得了18株病原菌，经生化试验及毒素中和试验，确定为A型和C型产气荚膜梭菌。参考GenBank中登录的基因序列，设计合成了针对产气荚膜梭菌α、β、ε、ι、CPE和β2共6对分型毒素基因的引物，对以前昆明地区分离的1株产气荚膜梭菌进行了PCR扩增，结果扩增出了与预期大小相同的6个基因片段，分别为233、196、324、446、567和665 bp。建立的PCR方法能同时用于产气荚膜梭菌鉴定和毒素分型，较细菌毒素检测方法快速，与细菌分离鉴定的结果一致。     

羊毒素型产气荚膜梭菌临床症状及病理变化

产气荚膜梭菌可引起绵羊、山羊和其他动物的肠道疾病,不同毒素型的产气荚膜梭菌可引起羊肠毒血症、羊猝狙、羊肠毒血症等。产气荚膜梭菌对宿主通常具有破坏性影响,根据发病羊群的以往病史、临床病变和剖检病例变化是羊产气荚膜梭菌病初步诊断的基础,而该病的确诊还需实验室检测后方可确认。确定羊产气荚膜梭菌病最广泛被接受的方法是从患有典型临床症状的病羊肠内容物检测到产气荚膜梭菌毒素。此外,大脑的组织病例理学检查对于由D型产气荚膜梭菌引起的疾病诊断中十分有用。本文对各种类型产气荚膜梭菌引起疾病的临床病变和组织病变进行综述。     

环介导等温扩增技术检测产气荚膜梭菌α毒素方法的建立及应用

建立快速检测产气荚膜梭菌的环介导等温扩增(LAMP)方法。针对GenBank发布的产气荚膜梭菌α毒素基因序列,应用Primer explorer V5软件在线设计了LAMP引物。通过对扩增条件包括反应时间、反应温度、Mg~(2+)浓度、dNTPs浓度、内外引物浓度比、Bst DNA聚合酶浓度进行优化,建立了产气荚膜梭菌LAMP检测方法。特异性试验显示除产气荚膜梭菌外其他细菌检测结果均为阴性,灵敏度试验显示LAMP方法对该菌DNA最低检测量为10 ng/L,菌液的最低检出量为3.7×10~1 CFU/mL,分别是PCR方法的100倍和10倍。用建立的LAMP方法对牛粪便、饲料和饮水共计102份样品进行检测,产气荚膜梭菌阳性率为19.61%(20/102),与PCR检测及细菌分离鉴定结果一致,且样品增菌时间缩短2～4 h。本试验成功建立了快速、灵敏、特异、操作简便和结果可视的产气荚膜梭菌的LAMP检测方法。     

A型产气荚膜梭菌小鼠感染模型的建立

近年来,我国许多牛场暴发产气荚膜梭菌病,同时产气荚膜梭菌病疫苗及其致病机制的研究不断深入.本试验以牛源A型产气荚膜梭菌强毒株C987株为基础,通过灌胃或皮下注射方式接种小鼠,记录其发病和死亡情况,并剖检观察小鼠内脏各器官病变及组织学变化,建立小鼠感染模型.结果表明,灌胃和皮下注射接种方式,A型产气荚膜梭菌对小鼠的半数致死量分别为4.35×109 CFU和8.0×106 CFU.感染小鼠腹部明显膨大,剖检内脏器官均出现明显病变,组织化学染色显示内脏器官大多出现淋巴细胞浸润及不同组织学变化.皮下注射方式在接种细菌数量、试验平行性、小鼠死亡率上均优于灌胃接种方式,因此皮下注射接种方式更适合作为A型产气荚膜梭菌小鼠感染模型的接种途径.本试验为牛A型产气荚膜梭菌疫苗的评价及其致病机制的研究提供了一种合适的动物模型.     

一例兔产气荚膜梭菌的分离与鉴定

从滨州某兔场送检的病料中分离到1株兔产气荚膜梭菌,经细菌培养、形态学检查、生化特性鉴定、毒素中和试验鉴定为A型产气荚膜梭菌,易感试验兔接种试验能够复制出典型的病例。     

麋鹿产气荚膜梭菌分离鉴定方法的建立与初步应用

探索了产气荚膜梭菌在营养琼脂、甘露醇卵黄琼脂和血琼脂平板上的菌落形态和培养特点,优化了产气荚膜梭菌的分离方法,并对分离菌株进行生化鉴定;在此基础上对北京南海子麋鹿苑和江苏大丰麋鹿国家级自然保护区的麋鹿自然感染情况进行了调查。结果发现,粪样中的产气荚膜梭菌在营养琼脂上生长呈半透明边缘不整的白色菌落,接种甘露醇卵黄琼脂和血琼脂平板,分别出现伴有卵磷脂酶乳光浑浊带的粉红色火山口状菌落和伴有双溶血环的灰绿色勋章样菌落。生化试验结果确认这些分离株均为产气荚膜梭菌。对北京南海子麋鹿苑和江苏大丰麋鹿国家级自然保护区麋鹿粪样检测发现,阳性率分别为13.04%(3/23)和19.51%(8/41)。说明本研究建立的麋鹿产气荚膜梭菌分离鉴定方法简便快速,确实可行;麋鹿产气荚膜梭菌自然感染率较高,应加强麋鹿产气荚膜梭菌病的防控。