大豆磷酸烯醇式丙酮酸磷酸酯酶(PEPP)研究:Ⅰ. 对非生物胁迫的反应

对缺磷、铝毒、盐、干旱、Fe、Mn、Cu、Zn胁迫下大豆根系和叶片磷酸烯醇式丙酮酸磷酸酯酶(PEPP)活性进行了测定，结果表明：(1)长期缺磷和铝毒胁迫可显著提高大豆根系的PEPP活性，并表现出加成效应；(2)长期铝毒、缺磷和铝毒耦合胁迫也显著提高大豆敏感品种BL2叶片的PEPP活性；(3)盐胁迫、干旱以及长期Fe、Mn、Cu、Zn过量都显著提高大豆根系的PEPP活性，Fe、Cu、Zn缺乏则对根系和叶片的PEPP活性影响不大，长期缺Mn显著降低大豆根系及叶片的PEPP活性。     

大豆磷酸烯醇式丙酮酸磷酸酯酶(PEPP)研究:I.对非生物胁迫的反应

对缺磷、铝毒、盐、干旱、Fe、Mn、Cu、Zn胁迫下大豆根系和叶片磷酸烯醇式丙酮酸磷酸酯酶(PEPP)活性进行了测定,结果表明:(1)长期缺磷和铝毒胁迫可显著提高大豆根系的PEPP活性,并表现出加成效应;(2)长期铝毒、缺磷和铝毒耦合胁迫也显著提高大豆敏感品种BL2叶片的PEPP活性;(3)盐胁迫、干旱以及长期Fe、Mn、Cu、Zn过量都显著提高大豆根系的PEPP活性,Fe、Cu、Zn缺乏则对根系和叶片的PEPP活性影响不大,长期缺Mn显著降低大豆根系及叶片的PEPP活性。     

拟南芥5-烯醇式丙酮酰-莽草酸-3-磷酸合成酶基因(EPSPS)的定点突变及抗草甘膦转基因拟南芥获得

目前商业化种植的抗草甘膦转基因作物中使用的基因主要是来自土壤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)CP4和大肠杆菌(Escherichia coli)的5-烯醇式丙酮酰-莽草酸-3-磷酸合成酶(5-enolpyruvyshikimate-3-phosphate synthase,EPSPS)基因,抗性基因资源过于狭窄,有必要拓宽可用基因种类。本研究通过PCR方法克隆了拟南芥(Arabidopsis thaliana)EPSPS基因,对其进行定点突变,并将野生型基因(AtEPSPS)和突变基因(AtTIPS)分别转化EPSPS基因缺陷型大肠杆菌菌株ER2799。草甘膦抗性鉴定结果表明,含AtTIPS基因的重组菌株在20 mmol/L草甘膦胁迫条件下长势良好(P0.01),而含AtEPSPS基因的重组菌株在5 mmol/L的草甘膦胁迫条件下即受明显抑制(P0.01)。同时将两个基因分别构建到植物表达载体中,并转化野生型拟南芥。对T1代转基因植株进行PCR验证和转录水平分析,证明外源基因已整合到拟南芥基因组中并正常表达。对转基因拟南芥进行草甘膦抗性分析结果表明,在0.5 mmol/L草甘膦处理下,转AtTIPS基因拟南芥相比转AtEPSPS拟南芥有更高的植株鲜重和存活率(P0.05),表明转AtTIPS基因拟南芥有更高的草甘膦抗性。以上结果表明AtTIPS具有较高的草甘膦抗性能力,可以用于抗草甘膦转基因作物的培育。     

高粱5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶基因(EPSPS)叶绿体转运肽(CTP)的克隆及其在转基因玉米中的功能验证

5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)催化莽草酸-3-磷酸(S3P)与磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)合成5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸(EPSP),具有与草甘膦结合的活性位点,且结合后会抑制EPSPS的活性,在植物抗除草剂基因工程中具有重要的应用价值.为了培育抗草甘膦玉米(Zea mays),本研究通过对高粱(Sorghum bicolor)EPSPS基因的结构分析,克隆了该基因5'端的叶绿体转运肽(chloroplast transit peptide,CTP).将该转运肽与来源于农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株CP4 EPSPS基因整合,以Ubiquitin为启动子,35S polyA为终止子,构建表达载体,同时以不含有转运肽的CP4 EPSPS基因为对照,遗传转化玉米得到稳定转基因株系;用PCR、Southern blot、ELISA等方法检测转基因玉米CP4 EPSPS基因的表达量并对其进行草甘膦抗性检测,研究发现,不含转运肽的转化事件虽然CP4 EPSPS基因表达量与含有转运肽的基本一致但却不具有草甘膦抗性,而含有转运肽的转化事件则抗性明显.说明转运肽并不影响CP4 EPSPS基因的表达,但对转基因植株草甘膦抗性起着重要作用,说明本研究克隆的叶绿体转运肽能够正常行使其生物学功能.研究结果为利用EPSPS基因培育抗草甘膦作物提供了重要参考资料.     

转5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)基因抗草甘膦烟草和棉花的获得

以从抗草甘膦的荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)G2中克隆的、并按双子叶植物偏爱密码子改造的5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)基因aroAG2M为目的基因,用菊花Rubisco小亚基的启动子驱动,在基因的5'端加叶绿体定位信号肽,构建植物表达载体。用根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的叶盘法转化烟草(Nicotiana tabacum)获得转基因植株,PCR检测表明,外源基因已整合到烟草基因组中。转基因和非转基因植株6～8叶龄苗的叶片涂抹不同浓度的草甘膦异丙胺盐,表明转基因植株可抗4‰浓度的草甘膦,而非转基因对照植株则在2‰草甘膦时即死亡。花粉管通道法转化棉花(Gossypium hirsutum),得到3株具有草甘膦抗性的转基因植株,PCR和Southern检测显示,外源基因已整合到棉花基因组中,田间喷洒草甘膦异丙胺盐水剂,表明T1代转基因植株具有草甘膦抗性。     

广东大豆地方种质磷效率特性研究Ⅰ.大豆基因型磷效率特性差异及其与土壤有效磷含量的关系

在低磷红壤上,对原产广东省的大豆基因型磷效率与其来源地土壤有效磷含量的关系进行研究。结果表明：植株磷素吸收量相对值不仅可以反映大地低磷红一长适应性,而且可以反映大豆基因型磷效率特性,ＲＶＰＰＵ是较大的大豆基因型。     

广东大豆地方种质磷效率特性研究Ⅰ.大豆基因型磷效率特性差异及其与土壤有效磷含量的关系

在低磷红壤上,对原产广东省的大豆(Glycine max (L.) Merrill)基因型磷效率与其来源地土壤有效磷含量的关系进行研究.结果表明:植株磷素吸收量相对值(RVPPU)不仅可以反映大豆对低磷红壤生长适应性,而且可以反映大豆基因型磷效率特性,RVPPU是衡量田间生长适应性和磷效率特性的较好指标.RVPPU较大的大豆基因型,其对低有效磷红壤环境适应性较好,磷效率特性较佳;反之,亦然.不同大豆基因型,具有不同的磷效率特性.磷效率特性的形成与土壤有效磷含量有关.土壤中低有效磷含量与较佳的磷效率特性形成有关,长期生长在有效磷含量较低的砖红壤、赤红壤、红壤和紫色土上的大豆基因型具有较佳的磷效率特性;而长期生长在有效磷含量较高的水稻土、潮土上的大豆基因型其磷效率特性较差.大豆基因型较佳的磷效率特性是其长期在低有效磷土壤环境下进化形成的.     

两个低植酸大豆突变体中肌醇-3-磷酸合成酶MIPS1基因表达特性的研究

肌醇-3-磷酸合成酶(MIPS)基因是植酸合成代谢途径中重要的功能基因.本研究以两个大豆低植酸突变体Gm-lpa-TW-1、Gm-lpa-ZC-2以及其野生型亲本台湾75和浙春3号为材料,分析了MIPS1基因在其根、茎、叶、花和发育种子中转录水平上的表达特性.结果表明:在大豆发育的种子中MIPS1基因的表达表现为由弱到强再逐渐减弱的表达特性,在开花后22d的种子内,基因的表达达到高峰,此后逐渐减弱.突变体Gm-lpa-TW-l和野生型亲本台湾75的根、茎、叶和花中MIPS1基因的表达均较弱,但突变体Gm-lpa-TW-1的表达量略高于野生型亲本.与野生型亲本相比较,在开花后的22d,突变体Gm-1pa-TW-l发育种子中MIPS1基因的表达峰极显著的降低,仅为野生型的25％左右,而且在整个种子发育期间MIPS1基因的表达均较弱.突变体Gm-lpa-ZC-2和浙春3号的根、茎、叶和花中MIPS1基因的表达较弱,突变型和野生型之间没有显著的差异,但在种子发育的各个时期突变体Gm-lpa-ZC-2的表达量显著的高于野生型亲本浙春3号.在两个低植酸突变体发育的种子中MIPS1基因的表达与野生型亲本相比均发生了显著的变化,表明基因突变对MIPS1基因的表达均造成了显著的影响,在Gm-lpa-TW-1中表现为MIPS1基因表达的下调,而Gm-lpa-ZC-2中则表现为上调.     

屎肠球菌M-2所产细菌素的分离纯化与特性研究

本文以前期从内蒙古传统干酪中分离到的一株产细菌素的屎肠球菌M-2为试材,对其所产细菌素进行提取纯化和理化特性研究。经80%硫酸铵盐析及SP Sepharose Fast Flow阳离子交换树脂层析得到纯化的细菌素,其比活力可达411.204AU/mg;Tricine SDS-PAGE电泳结果显示其分子量约为3400Da;特性研究发现该细菌素有很好耐热、耐酸碱、抗表面活性剂及蛋白酶敏感特性,且抑菌谱较广,不仅对李斯特氏菌、金黄色葡萄球菌、芽孢杆菌等革兰氏阳性菌有较强的抑制作用,还对大肠杆菌、假单胞菌等阴性菌表现出抑菌活性,有作为天然食品防腐剂的良好应用前景。     

Leafy启动子控制下5-烯醇式丙酮酰-莽草酸-3-磷酸合酶基因(CP4EPSPS)的表达增强芽对草甘膦的抗性

抗草甘膦基因在转基因植物体内持续高效表达,不但增加植物代谢压力,有的甚至改变植物形态造成植物的生长发育畸形。为了减少转基因植株的代谢负担和能源浪费,从拟南芥菜(Arabidopsis thaliana)基因组中克隆了Leafy组织特异性启动子替代CaMV35S启动子,用其驱动改造后加二磷酸核酮糖羧化酶(rubisco)小亚基引导肽的5-烯醇丙酮酰-莽草酸-3-磷酸合酶(CP4EPSPS)基因,同时调控报告基因gus的编码区构建植物表达载体p3300-Leafy-gus和p3300-Leafy-CP4EPSPS,嵌合基因经农杆菌(Agrobacterium)介导转化烟草。稳定表达后经GUS组织染色分析表明,Leafy驱动的gus表达仅局限在植物茎尖和幼叶部分,转基因植株成熟的叶片、茎部和根系均未能检测到GUS活性。草甘膦试验分析表明,Leafy驱动的CP4EPSPS的转基因植株幼芽部位有草甘膦抗性。结果表明,Leafy启动子驱动CP4EPSPS表达增强植株芽端对草甘膦的抗性。     

还原型谷胱苷肽(GSH)作用下土壤磷酸酶动力学特性研究

采用室内培养方法研究还原型谷胱苷肽(GSH)对黑土和棕壤磷酸酶动力学特性的影响。结果显示480mgkg-1(以风干土重计)的GSH处理的黑土磷酸单酯酶、三酯酶和棕壤的二酯酶、三酯酶Vmax值显著大于对照,证明GSH是通过增大酶量实现Vmax值的增大。试验中GSH处理的棕壤磷酸单酯酶及黑土的磷酸二酯酶Km值显著低于对照,说明GSH改变了酶结构,增强了酶与底物的亲和力。     

重组甘蔗1-氨基环丙烷-1-羧基(ACC)氧化酶的纯化及其特性

在IPTG诱导下,重组甘蔗(Sacharum sinensis)1-氨基环丙烷-1-羧基(ACC)氧化酶在体外以包涵体蛋白形式表达。包涵体蛋白经Ni2+-NTA金属螯合层析柱纯化和复性后,获得酶活力高达132.58 nmolC2H4/ mg/h 蛋白。该蛋白在pH 5.5 ~ 8.0 和20 ~ 45 ℃温度范围内比较稳定,最适pH 6.7,最适温度33 ℃;米氏常数(Km )61.77 μmol/L,酶动力学参数（Vm）值0.9647 μmol/min,被一定浓度的CO2和底物ACC所激活,受Mg2+、Cu2+、Zn2+和EDTA抑制。     

抗病性不同大豆品种根面及根际微生物区系的变化 Ⅱ.连作大豆(重茬)根面及根际微生物区系的变化

采用平板计数法测定了两个抗根腐病连作大豆品种生育期间根面和根际微生物区系动态变化。结果表明,两个品种大豆根面细菌随生育期增加呈递减趋势,品种间无差异。合丰25(H25)的根际细菌数量随生育期呈递减趋势,绥农10号(S10)根际细菌数量从三叶期到鼓粒初期不断增加,到成熟期又急剧减少。感病品种H25根瘤重明显低于抗病品种S10。H25根面真菌和镰孢霉总数在三叶期和成熟期均高于S10,苗期是根腐病的主要发病期。总之,在连作条件下,无论抗病品种还是感病品种大豆成熟期其根面和根际细菌减少,真菌和主要病原菌(镰孢霉Fusarium)都会大量富集,表明根系分泌物对根面和根际的微生物种群有选择性地促进或抑制作用。     

长江三角洲地区土壤环境质量与修复研究 Ⅱ.典型污染区农田生态系统中二(口恶)英/呋喃(PCDD/Fs)的生物积累及其健康风险

对长江三角洲地区某典型污染区农田生态系统和部分农产品中多氯代二苯并二(口恶)英(PCDDs)/呋喃(PCDFs)的污染特征、生物富集及潜在健康风险进行了初步研究.结果表明,该地区局部农田土壤中PCDD/Fs含量及毒性当量平均达556 pg g-1dw和TEQ 20.2pg g-1 dw,已在不同农产品中明显积累,其中稻米中PCDD/Fs含量及毒性当量为50.7pg g-1 dw和TEQ 6.4 pg g-1 dw,蔬菜茎叶中为35.2 pg g-1 dw和TEQ 6.7 pg g-1 dw;当地家禽鸡肉中PCDD/Fs含量及毒性当量为30.9pg g-1 ww和TEQ 5.7pg g-1 ww.日允许摄入量(TDI)计算结果表明,经稻米-蔬菜、稻米-蔬菜-鱼腥草、稻米-蔬菜-鱼腥草-鸡肉三种暴露途径至人体的PCDD/Fs日摄入量分别为TEQ 67.4、72.1、83.5 pg kg-1 d-1,均远远超过世界卫生组织(WHO)制定的TDI标准(TEQ 1～4pg kg-1 d-1).该地区局部农田生态系统及部分农产品中存在二(口恶)英类(PCDD/Fs)污染,已构成较大的人体健康风险.     

红壤交换性碱和交换性酸的研究 Ⅱ.与中性盐NaCl和Ba(NO3)2的关系

提出一个测定Cl- —交换性碱的方法。用自动控制pH的滴定装置定量地研究了一个砖红壤胶体和一个红壤胶体在NaCl和Ba(NO3) 2 溶液中的交换性酸的变化。结果发现 ,砖红壤和红壤胶体在两种盐溶液中 ,在测定pH范围内只出现交换性酸 ,红壤胶体的交换性酸量比砖红壤胶体的大。随着盐浓度的增高 ,交换性酸量的增幅由大变小 ,明确地出现一折点 ,NaCl在 30 0mmolkg- 1左右 ,Ba(NO3) 2 在 1 2 0mmolkg- 1左右。pH对交换性酸有显著影响 ,在Ba(NO3) 2 溶液中随pH升高而增大 ,在NaCl溶液中则出现一峰值。     

四年磨剑成果斐然 深入凝练重在推广——公益性行业(农业)科研专项“大宗农产品加工特性研究与品质评价技术200903043”2012年度科研工作总结会在京召开

2012年11月6日,中国农业科学院农产品加工研究所王强研究员主持的公益性行业(农业)科研专项"大宗农产品加工特性研究与品质评价技术"2012年度科研工作总结会