伪狂犬病病毒Ea株UL18基因的克隆、序列分析及表达

本研究以伪狂犬病病毒Ea株基因组DNA为模板,PCR扩增含ULl8全长基因的片段并克隆至pMDl8-T载体,采用双脱氧末端终止法测序.序列分析显示ULl8全长891 bp,可编码297个氨基酸.将该基因亚克隆到原核表达栽体pQE.82L的6×His标签下游,获得原核表达质粒pQE-UL18,转化大肠杆菌DH5α,经IPTG诱导在大肠杆菌中成功表达,表达的融合蛋白6 × His-UL18的分子量约为33 ku.Western blot证实,表达的融合蛋白能与抗6×His的单抗发生特异性反应.进一步将UL18基因插入真核表达栽体pEGFP-N1中EGFP基因的5'端,获得与EGFP融合表达的真核表达质粒pEGFP-UL18,转染HeLa细胞,通过激光共聚焦显微镜观察发现,转染后24 h融合蛋白EGFP-UL18主要定位于细胞浆,仅有部分定位于细胞核,而48 h时则主要定位在细胞核.但对照载体pEGFP.N1转染细胞的荧光一直呈弥散型分布于整个细胞中.     

伪狂犬病病毒Ea株UL6基因的克隆、序列分析及表达

以伪狂犬病病毒Ea株基因组DNA为模板,通过PCR扩增UL6全长基因,将PCR产物克隆于pMD18-T载体,并采用双脱氧终止法进行序列测定.序列分析显示UL6全长1 938 bp,可编码646个氨基酸.将该基因克隆到插入原核表达载体pET28a的6×His下游,获得原核表达质粒pET28a-UL6,转化大肠埃希菌BL21,经IPTG诱导在大肠埃希菌中成功表达获得分子质量约70 ku的融合表达蛋白6×His-UL6,Western blot证实,表达的融合蛋白能与抗6×His的单克隆抗体发生特异性反应.根据测定的序列,设计一对能扩增UL6基因完整编码区的引物,PCR扩增UL6基因并将其插入真核表达载体pEGFP-C2中EGFP基因的3'端,获得与EGFP融合表达的真核表达质粒pEGFP-UL6,转染Hela细胞,通过激光共聚焦显微镜观察发现,转染48 h,融合蛋白EGFP-UL6主要定位在胞浆,为进一步研究伪狂犬病病毒Ea株UL6基因的结构和功能奠定了基础.     

伪狂犬病病毒Ea株gE基因的克隆、序列分析及其表达

对含伪狂犬病病毒（Pseudorabies Virus,PrV）Ea株gD基因部分编码序列，gI、gE和11k基因全序列、28k基因部分序列的质粒pSKB4.5进行亚克隆，构建了只含完整gE基因（长1.78kb）的重组质粒pSDM1.78 ，并采用双脱氧末终止法对全序列进行了分析，发现同国外标准毒株Rice株相比较，在核苷酸和氨基酸水平均存在一定程度的差异。进一步将gE基因克隆到高效真核表达载体pcNDA3.1 的Kpn1和BamH1位点之间，构建了gE基因的真核表达质粒pcDNA-gE。体外转染IBRS-2细胞，经间接免疫荧光法检测证实了gE基因在IBRS-2细胞中得到了表达，表达的蛋白具有生物学活性。     

伪狂犬病病毒Ea株UL31基因克隆、序列分析及其在大肠杆菌中的表达

以伪狂犬病病毒Ea株基因组DNA为模板,通过PCR扩增含UL31基因的1 000bp片段,扩增产物克隆于pMD18-T中,双脱氧末端终止法序列测定.通过OM1GA2.0软件包分析发现,Ea株UL31基因编码271个氨基酸,蛋白质分子量为30.38 kD,与Ka株UL31基因核苷酸与氨基酸序列同源性均在98%以上.将α-疱疹病毒亚科9个不同成员UL31同源基因编码的氨基酸序列进行多重比对分析,发现4个保守的功能性结构域.将该片段插入原核表达载体pGEX-KG中GST下游,构建的原核表达质粒pGEX-UL31在大肠杆菌BL32(DE3)中获得了高效表达,SDS-PAGE结果显示,表达的融合蛋白质分子量为56 kD.     

伪狂犬病病毒Ea株gD基因的克隆及序列分析

本研究从含有伪狂犬病毒（Pseudorabies virus,PRV)Ea株gD基因BamHI 6.6Kb片段的重组质粒pUCB7中分别亚克隆gD基因的上，下游片段，并对上游片段进一步改造，去掉gD基因上游的非编码序列，构建了含完整gD基因编码区的重组质粒，pBRgDI，并利用基因内部的限制性内切酶位点，用内切酶KpnI和SalI酶切分析，证实了 gD基因的可靠性和完整性，同时构建了测序质粒pSKgDSB,pSKgDS，并用双脱氧终止法进行测序，将测序结果与国外的Rice毒株进行比较，发现Ea株gD基因核苷酸序列有多处点突变和一处插入突变，在编码氨基酸残苦水平上也有差异。     

伪狂犬病毒Ea株UL38基因的克隆、序列分析及表达

以伪狂犬病毒Ea株基因组DNA为模板,通过PCR扩增UL38全长基因,将PCR产物克隆于pMD18-T载体,并采用双脱氧终止法进行序列测定.序列分析显示UL38基因全长1 107 bp,可编码369个氨基酸.将该基因克隆到原核表达载体pQE-82L的6×His下游,获得原核表达质粒pQE-UL38,IPTG诱导在大肠杆菌中成功表达并获得相对分子质量约40 000的融合表达蛋白6×His-UL38,Western blot试验证实表达的融合蛋白能与抗6×His的单抗发生特异性反应.进一步将UL38基因插入真核表达载体pEGFP-N1中EGFP基因的5′端,获得与EGFP融合表达的真核表达质粒pEGFP-UL38,转染Hela细胞,24、48 h通过激光共聚焦显微镜观察显示pEGFP-UL38,24 h荧光主要分布在胞浆,有部分分布在核内,但随时间延长,荧光逐渐向细胞核中转移,在转染后48 h几乎完全定位于核内.但对照载体pEGFP-N1转染细胞的荧光一直呈弥散型分布于整个细胞.     

伪狂犬病病毒Bartha-K61株UL49基因的克隆和序列分析

根据已经发表的伪狂犬病病毒(PRV)国内Ea株UL49基因序列,设计并合成了1对引物,通过PCR方法扩增到了PRV Bartha-K61株UL49基因的编码区,并克隆到pMD18-T载体中.重组质粒pMD-UL49经XhoI酶切和PCR鉴定后,进行了序列测定和分析.结果表明,重组质粒pMD-UL49含有PRV Bartha-K61株UL49基因的编码区.同源性分析显示,PRV Bartha-K61株UL49基因序列与国外Kaplan株、国内Ea株相应基因的核苷酸同源性分别为98.9 %和94.1 %,推导的氨基酸序列同源性分别为96.7 %和87.2 %.     

伪狂犬病病毒Min-A株gD基因的克隆及其真核表达质粒的构建

参考GeneBank收录的伪狂犬病病毒gD基因的序列设计了一对引物,对PRV Min-A株进行了PCR扩增,扩增产物克隆于pGEM-T Easy载体.对重组质粒PGTE-gD进行限制性内切酶分析和基因测序,证实了克隆片段的可靠性.测序结果表明目的片段包含一个1203bp的开放性阅读框(ORF),编码400个氨基酸组成的多肽.将gD基因亚克隆至真核表达载体pcDVA3.1-的CMV启动子下游,构建了真核表达质粒pcDNA-gD,为下一步基因免疫奠定了基础.     

伪狂犬病病毒Ea株Us9基因的克隆与序列分析

对含伪狂犬病病毒Ea株BamH17片段的质粒pUC6.6进行亚克隆，构建了仅含Us9基因约0.6kb片段的重组质粒pSKMN0.6。双脱氧末端终止法进行双链测序，结果表明：Us9存在2种可能的同C-末端的编码形式，分别编码106或98个氨基酸残基，Us9基因与其下游的Us2(28K)基因之间存在约200bp的非转录区，将Ea株Us9基因序列同国外Rice株进行没源比较，发现二者在组成和结构上存在多处保守序列，尤其是潜在的酪氨酸磷酸化位点，C-端疏水性氨基酸以及由连续6个带正电荷的精氨酸残基组成的核定位信号序列，但在N-糖基化位点以及丝氨酸含量上存在较大差异。     

猪伪狂病病毒粤A株gE基因的克隆与序列分析

参考GenBank中伪狂犬病病毒(PRV)gE基因的序列设计了1对引物,对PRV粤A株gE基因进行了PCR扩增,PCR产物克隆到PMD18-T载体.对重组质粒进行限制性内切酶分析和基因测序,证实了克隆片段的可靠性,并与2株不同来源的毒株进行了同源性分析和比较.     

伪狂犬病病毒IE180基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

提取伪狂犬病病毒国内地方分离株Ea株基因组DNA,BamH I酶切后回收4.8kb左右的片段,克隆到pUC18中,酶切分析和部分序列测定筛选到含IE180基因的重组质粒pUCIE.进一步将长约1.8kb的IE180基因5′端部分编码区亚片段克隆到原核表达载体pET-28a中,使其置于pET-28a的T7启动子下游并同6×His(多聚组氨酸标签)-Tag融合,重组表达质粒pET1.8转化BL21(DE3),在IPTG诱导下获得高效表达,表达产物以包涵体形式存在,相对分子质量为62 000,同预期大小相当,并能同抗6×His的抗体发生特异性反应.     

鸭肠炎病毒UL41、UL42基因的克隆与分析

依据GenBank登录的鸭肠炎病毒(DEV)核苷酸序列设计引物,利用长片段PCR技术扩增了DEV基因组UL36与UL43基因之间的未知序列,扩增所得片段长度约为15 kb.经EcoRV单酶切,将其中的3.9 kb片段克隆到pUC18中.序列分析表明该3.9 kb EcoR V片段含有2个完整的转录方向相反的与单纯疱疹病毒(HSV)UL41和UL42基因同源的ORF,命名为DEV UL41和ULA2基因.通过氨基酸序列比对发现:DEV UL41基因含有5个高度保守位点,而UL42含有2个,进化树分析表明DEV与疱疹病毒科a疱疹病毒亚科的马立克病毒、火鸡疱疹病毒的进化关系非常相近,为DEV的分类提供了参考依据.     

猪伪狂犬病病毒山东分离株gE和gD基因的克隆及序列分析

近年来,我国猪场内很多规模化猪场的伪狂犬病病毒野毒呈阳性,大部分中小规模猪场和小养殖场感染情况更为糟糕,使得伪狂犬病病毒的变异率增加,给该病的防控带来了更大的压力。为了深入了解本病的流行情况及研制新型疫苗用于该病的防治,本研究在流行病学调查的基础上从发生疑似伪狂犬病的2个猪场仔猪组织内各分离到1株PRV野毒株,分别命名为LY株和YSH株。参照已发表的PRV gE和gD基因序列,设计合成2对分别扩其全长的引物,使用高保真酶进行PCR扩增,将扩增得到的全长序列克隆到pEASY-Blunt载体中,并转化Trans1-T1感受态细胞,挑取阳性菌落的质粒进行酶切、测序鉴定,并与国内外其他毒株进行比较分析,构建遗传进化关系图。结果表明,2毒株与国内外其他毒株比较,gE、gD基因核苷酸序列的同源性分别为97.7%~100.0%和99.0%~100.0%;氨基酸序列的同源性分别为95.5%~100.0%和98.9%~100.0%,以gE、gD基因氨基酸序列建立的进化树分析结果显示,近3~5年分离的PRVs形成一个相对独立的新分支。经过同源性及进化分析,可知新分离的2株伪狂犬病病毒株与欧美株的亲缘关系远,与亚洲株内中国株的亲缘关系近,初步判定属于国内流行株,并可能存在一定的抗原变异,这为进一步研究山东省猪群伪狂犬病病毒分子流行病学奠定了基础。