结核分枝杆菌和牛分枝杆菌的二重PCR快速检测试剂盒的研究

根据已发表的结核分枝杆菌23S rRNA和牛分枝杆菌特殊基因序列,设计并合成了2对可扩增结核分枝杆菌和牛分枝杆菌特异性基因片段的引物,建立二重PCR快速检测结核分枝杆菌和牛分枝杆菌的方法,并研制出检测试剂盒。结果表明,该检测试剂盒对结核分枝杆菌能特异性地扩增出838 bp条带而扩增不出631 bp条带,牛分枝杆菌能特异地扩增出838 bp和631 bp条带,而对其他牛菌株的DNA扩增结果均为阴性;敏感性试验表明最低能检测出50 pg的结核分枝杆菌和牛分枝杆菌DNA模板;保存期测定结果表明,在-20℃条件下保存至1、3、6、9个月时,试剂盒的敏感性无明显变化,仍能检测到50 pg的DNA模板,保存至12个月时其敏感度仍能100%检出阳性样品。     

应用PCR试剂盒对奶牛结核病的检测

应用聚合酶链式反应技术制备的PCR式剂盒,对贵州省某奶牛场140份血样和奶样标本中的结核分枝杆菌进行检测,结果显示:在111份奶样中有8份为阳性,阳性检出率7.2%。在39份血样中12头牛为阳性,阳性检出率为30.76%。本试验对PPD检测与PCR检测法进行验证,将1200头牛中PPD检测阳性牛和可疑牛,再用PCR法进行检测,PCR法阳性牛共计20头份,阳性检出率为1.67%,PPD法阳性牛24头份,阳性检出率为3.67%。结果表明:PCR试剂盒在检测牛结核病不同标本中显示出快速、特异等优点。     

清镇市某奶牛场牛结核的检测与净化

采用结核菌素皮内试验和牛结核PCR诊断试剂盒,对清镇市某奶牛场牛结核病进行检测,并制定和采取了有效的防控和净化措施,使该奶牛场结核病由2012年的阳性检出率1.98%,下降到2013年的0.26%,该场牛结核病得到了有效控制。     

牛支原体、牛多杀性巴氏杆菌和牛结核分枝杆菌三重PCR快速检测方法的建立

为建立快速、准确的检测牛呼吸道主要病原菌牛支原体(Mycoplasma bovis)、牛多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida)及牛结核分枝杆菌(M.tuberculosis)的方法,对牛支原体oppD基因序列、牛多杀性巴氏杆菌Pm-kmt基因序列、牛结核分枝杆菌IS6110基因序列分别设计特异性引物,对单一PCR检测方法进行优化后建立三重PCR检测方法。结果表明:三重PCR的最佳扩增条件为94℃预变性10min;94℃1min,60℃50s,72℃1min,循环30次;72℃延伸10min。建立的三重PCR方法能对同一样本中的3种病原菌进行扩增,特异性强。牛支原体、牛多杀性巴氏杆菌和牛结核分枝杆菌的最低检测DNA浓度分别为5.306×10~(-3)ng/μL、3.075×10~(-2)ng/μL和1.605×10~(-4)ng/μL。建立的三重PCR方法临床检测牛支原体肺炎鼻拭子、牛结核分枝杆菌、结核菌素与单一PCR检测方法的阳性符合率为100%。三重PCR检测方法可用于牛支原体、牛多杀性巴氏杆菌、牛结核分枝杆菌的单一和混合感染鉴别诊断,具有快速、准确、简便的特点。     

应用双重PCR技术快速鉴定结核与非结核分枝杆菌

本研究建立1种双重PCR技术,用于区分鉴定结核与非结核分枝杆菌.在最佳扩增反应条件下.检测引物P1、P2和P3、P4扩增结核分枝杆菌的特异性及敏感性,并对19株结核分枝杆菌和9株非结核分枝杆菌临床分离株进行扩增鉴定.结果表明,引物P1、P2能扩增所试13株结核和非结核分枝杆菌,P3、P4仅扩增结核分枝杆菌复合群菌种,两对引物同时扩增3种非分枝杆菌均为阴性.两对引物双重PCR检测结核分枝杆菌DNA的敏感性分别为100pg/μl和10pg/μl.检测28株临床分离株,结核分枝杆菌可扩增出368bp和225bp 2条带,非结核分枝杆菌仅扩增出一条361bp～383bp带.因此,该双重PCR技术的建立为结核及非结核分枝杆菌的快速鉴定提供了1个可供选择的手段.     

结核分枝杆菌巢式PCR诊断技术的建立和初步评价

以结核分枝杆菌特有的插入序列IS6110设计巢式PCR引物,对痰样本结核分枝杆菌的基因组DNA进行扩增,建立了检测结核病病原的巢式PCR诊断方法,试验验证有较好的特异性和敏感性,采用此方法扩增结核分枝杆菌可以获得244 bp的目的片段,对常见病原菌金黄色葡萄球菌、链球菌、沙门氏菌、大肠杆菌、李氏杆菌、布鲁氏菌等以及无结核病史的痰样本检测阴性,通过扩增不同浓度梯度稀释的模拟阳性痰样本确定了其敏感性为4个拷贝/反应.对送检的41份痰样本采用本方法进行检测,阳性率为60.98;.     

人结核病病原菌型的PCR指印分析

以结核分枝杆菌特异插入序列ＩＳ６１１０两端序列为模板,设计一对外向ＰＣＲ引物进行ＰＣＲ扩增,从而建立一种结核分枝杆菌的快速分子生物学分型技术,该试验的基础是利用ＩＳ６１１０在结核分枝杆菌染色体ＤＮＡ中反复重复且ＩＳ６１１０序列之间相距较近,经ＰＣＲ扩增呈现多条带型构成ＤＮＡ指印。采用ＰＣＲ指印技术,对人结核病患者痰标本中的结核分枝杆菌进行分型,５７份痰标本呈现７种ＰＣＲ指印。该ＰＣＲ分型技术对结核     

用PCR方法鉴别诊断分枝杆菌

结核杆菌病的诊断包括:动物临床诊查、变态反应诊断(结核菌素试验)、动物剖检诊断及利用病理材料进行病理学和实验室诊断.实验室诊断通常要持续3个月左右,也增加了动物疾病传播的危险性. PCR方法是现今结核杆菌检测最可靠和敏感的方法之一.原理是对DNA专一性核苷酸序列进行扩增.95℃加热,使DNA链变性;50～62℃,专一性引物与DNA模板的杂交;72℃,在DNA聚合酶存在条件下,进行DNA链扩增,利用该方法可以从少量细菌细胞的DNA中得到足够量的专一性DNA片段考贝数.组织提取物、毛发、血液以及长期冻存的组织都可以作为DNA模板的来源.患病动物和被其污染的环境物质,也可作为PCR诊断的材料来源.     

鸽疱疹病毒PCR检测方法的建立及试剂盒的研制

鸽疱疹病毒(PiHV1)感染是由I型鸽疱疹病毒引起的以幼鸽为主的一种常见病毒性传染病,临床上以鼻炎、结膜炎为主要特征。偶尔也会出现精神沉郁、食欲下降、腹泻、呕吐、神经症状。根据已发表的鸽疱疹病毒的基因序列,设计并合成了一对能特异性扩增鸽疱疹病毒的引物,通过对PCR的退火条件的优化,建立了鸽疱疹病毒的PCR检测方法,对发病鸽子进行诊断。并研制出检测试剂盒,再进一步对该试剂盒的敏感性、特异性和稳定性进行了研究,证明该试剂盒具有很高的敏感性和特异性,并且在-20℃条件下可保存1年以上。     

谈奶牛场牛结核病的净化

结核病是一种危害严重的慢性人畜共患传染病,该病由牛结核分支杆菌引起．奶牛是家畜中最易感染该病的动物。近年来,因奶制品社会需求量大幅增加、奶牛饲养规模扩大、交易频繁、动物结核病防治滞后等原因,     

牛结核病的防治

牛结核病是由分枝杆菌属牛分枝杆菌引起的一种慢性传染病,以组织器官的结核结节性肉芽肿和干酪样、钙化的坏死病灶为特征的一种人、畜共患的慢性传染病。该病分布很广,世界各地都有发生,严重影响畜牧业发展。 OIE将其列为B类疫病。 1.病原学：结核杆菌不产生芽孢和荚膜,也不能运动,为革兰氏染色阳性菌。结核菌具有蜡质膜.结核杆菌为严格的需氧菌,生长最适pH为：5.9～6.9,最适温度为37～38℃。结核杆菌的菌落、毒力及耐药性可发生变异。典型的菌落为粗糙型,毒力强,而变异菌株菌落则呈光滑型,毒力弱。     

牛布鲁菌与牛分枝杆菌双重PCR方法的建立及应用

根据GenBank中已发表的流产布鲁菌种特异的omp25基因序列及牛分枝杆菌特异保守的16S rRNA加工蛋白rimM基因序列设计了2对特异性引物,通过对PCR条件的优化,建立了快速鉴别检测牛布鲁菌Brucella abortus和牛分枝杆菌Mycobacterium bovis的双重PCR方法.对建立的方法进行特异性和敏感性试验,结果显示,在牛布鲁菌和牛分枝杆菌中分别扩增出448、269 bp的特异性目的条带,作为对照的大肠杆菌Escherichia coli、沙门菌Salmo-nella typhimurium、八叠球菌Sarcina lutea、金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus、巴氏杆菌Pasteurella multocida、军团菌Legionella pneumophila、枯草杆菌Bacillus subtilis及溶血性链球菌Streptococcus pneumonia均未扩增出任何条带.牛布鲁菌和牛分枝杆菌的DNA最低检出量均为10 pg;牛奶样品中人工污染的牛布鲁菌和牛分枝杆菌的检测敏感性分别为7.9×103CFU/mL、3 ng/mL.     

牛结核病的防治措施

牛结核病是由分枝杆菌属牛分枝杆菌引起的一种慢性传染病,以组织器官的结核结节性肉芽肿和干酪样、钙化的坏死病灶为特征的一种人、畜共患的慢性传染病。该病分布很广,世界各地都有发生,严重影响畜牧业发展。     

牛分枝杆菌SYBR Green I实时荧光定量PCR检测方法的建立

【目的】建立一种检测牛分枝杆菌的SYBR Green I 实时荧光定量PCR,为防控牛结核病提供技术支持。【方法】根据牛分枝杆菌特异性基因序列（No. MBU87961,gi9954088）设计合成一对扩增牛分枝杆菌的特异性引物,从引物设计、各成分配比、样品采集及样品DNA提取等方面进行优化,并对建立的方法进行标准曲线、溶解曲线分析及特异性、敏感性、重复性、临床样品检验试验。【结果】牛分枝杆菌SYBR Green I实时荧光定量PCR的检测模板范围为1.0×109～1.0×10拷贝/μL时,其标准曲线呈良好的线性关系,溶解曲线表现为单一波峰,Tm值为86.48～86.65℃。SYBR Green I实时荧光定量PCR的牛型分枝杆菌扩增结果为阳性,其他参试菌株均为阴性;可检测出10拷贝/μL的牛分枝杆菌DNA,敏感性是常规PCR的100倍;Ct值变异系数小于5%,重复性好;对50份PPD检测为阳性的牛鼻黏液、牛奶和淋巴结进行检测,其结果与常规PCR检测结果一致。【结论】建立的SYBR Green I实时荧光定量PCR具有快速、便捷、准确等优点,适合于牛分枝杆菌的鉴别诊断。     

关于牛结核病诊断与防治

牛结核病是由分枝杆菌属牛分枝杆菌引起的一种慢性传染病,以组织器官的结核结节性肉芽肿和干酪样、钙化的坏死病灶为特征的一种人、畜共患的慢性传染病。该病分布很广,世界各地都有发生,严重影响畜牧业发展。 OIE将其列为B类疫病。 1病原学 结核杆菌不产生芽孢和荚膜,也不能运动,为革兰氏染色阳性菌。结核菌具有蜡质膜.结核杆菌为严格的需氧菌,生长最适pH为：5.9～6.9,最适温度为37～38℃。结核杆菌的菌落、毒力及耐药性可发生变异。典型的菌落为粗糙型,毒力强,而变异菌株菌落则呈光滑型,毒力弱。     

副结核分枝杆菌单克隆抗体杂交瘤细胞系的建立和鉴定

本试验通过6次细胞融合,经过3次反复克隆化与长时间培养和两次液氮中冻存、复苏,获得了10株稳定、高效地分泌抗副结核分枝杆菌单克隆抗体的杂交瘤细胞系。这些杂交瘤细胞的染色体数量均较其两种母源细胞有明显地增加,但少于两者之和;经培养产生的含单克隆抗体的培养上清液效价在1/100～1/300之间,腹水效价达万倍以上。这10株单克隆抗体都是分枝杆菌特异性的,但在分枝杆菌之间却有广泛的交叉反应。     

猪大肠杆菌K88-K99 PCR诊断试剂盒研究

根据已成功扩增的大肠杆菌K88及K99菌毛蛋白结构基因PCR反应 ,进行PCR反应体系的优化。将 2种菌毛蛋白结构基因的扩增引物混合进行PCR ,同时检测K88及K99菌毛蛋白结构基因。经优化试验 ,筛选出 5 0 μLPCR反应体系中各成分的最适用量为 :Mg2 + 浓度 2mmol L ,Taq酶 5U ,dNTPs 2 0 0mmol L ,每条引物 5 0pmol,模板量 1 0 0CFU ,并研制成功用于临床检测的PCR诊断试剂盒。     

牛结核分枝杆菌Mce4E蛋白对牛肺泡巨噬细胞iNOs、TNF-α、IL-6和IL-12表达的影响

探讨Mce4E蛋白在牛结核分枝杆菌致病机理中的作用。以Mce4E蛋白刺激肺泡巨噬细胞24和48h后,MTT检测分析表明,Mce4E蛋白对巨噬细胞的活性有显著的抑制作用(P<0.05);用重组表达的Mce4E蛋白、人分枝杆菌纯化蛋白衍生物(Purified Protein Derivative of M.tuberculosis,MtbPPD)、牛结核分枝杆菌纯化蛋白衍生物(Purified Protein Derivative of M.bovis,MbPPD)、卡介苗(Bacille Calmette Guerin,BCG)和刀豆蛋白A(con-canavalin A,ConA)分别刺激肺泡巨噬细胞48h后,real-time PCR方法检测显示,Mce4E蛋白能够促使牛肺泡巨噬细胞TNF-α和IL-6 mRNA的表达上调(P<0.05)、抑制肺泡巨噬细胞iNO的mRNA表达(P<0.05)而对IL-12表达没有影响(P>0.05)。Mce4蛋白能够促使肺泡巨噬细胞分泌炎性细胞因子,并对肺泡巨噬细胞有抑制作用,证实Mce4蛋白在分枝杆菌中具有重要的作用。     

牛环形泰勒虫病的PCR诊断

[目的]梨形虫病是一类由蜱传播的人畜共患血液原虫病的总称,呈地方性流行.早期查出托克逊县部分地区牛梨形虫虫病的病原,为该地区的牛梨形虫病的综合防治提供参考.[方法]在托克逊县部分地区随机采集疑似牛血样(N=50),采用病原学检测方法和PCR检测方法进行诊断.[结果]在采集的50份疑似牛血样中,血液涂片结果阳性率为30; (15/50);PCR诊断结果阳性率为40; (20/50);其阳性率与动物接种实验(兔)的结果基本一致(34;和40;).[结论]血液涂片法直观、简便、经济实用,是基层工作者检测寄生虫病原的常用方法之一,而PCR检测法敏感性高于血液涂片法,易用于该病的早期诊断.该地区的牛染虫率较高,可能与蜱虫较多的原因有关,为控制环形泰勒虫病的进一步传播,需加强灭蜱工作.