基于F2和RIL群体鉴定棉花抗黄萎病主效QTL

【目的】通过对棉花抗黄萎病性状进行数量性状位点(quantitative trait locus,QTL)定位，鉴定可以应用于育种实践的能稳定检测到的主效QTL，为棉花抗黄萎病遗传改良奠定分子基础。【方法】以抗黄萎病品种中植棉2号和感黄萎病品种冀棉11号为亲本杂交的F₂群体和重组自交系(recombinant inbred lines,RIL)群体作为作图群体，在对2个群体进行多环境黄萎病抗性鉴定和简单重复序列(simple sequence repeat,SSR)分子标记检测的基础上进行遗传连锁图谱构建，利用完备区间作图法进行QTL定位，并对获得的主效QTL置信区间进行候选基因挖掘。【结果】在F_2:3家系和RIL群体中共检测到7个抗黄萎病QTL，能够在多个环境条件下重复检测到的QTL有4个，包括q VW-D05-1、qVW-D05-2、q VW-D05-4和qVW-D05-5。共线性分析表明上述4个QTL集中分布于D05染色体上2 293 776～3 205 058 bp和62 407 897～62 582 344 bp 2个区域。4个抗性...     

棉属D基因组3个野生棉种Bet v1基因鉴定及功能分析

【目的】对棉花D基因组中Bet v 1基因家族进行分析,比较其在不同抗性棉种间的表达模式差异,为深入研究Bet v 1基因在棉花抗黄萎病中的作用提供理论依据。【方法】通过生物信息学方法对D基因组中Bet v 1基因进行鉴定。通过雷蒙德氏棉(Gossypium raimondii,D5)、三裂棉(G. trilobum,D8)和瑟伯氏棉(G.thurberi,D1)转录组和实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)分析Bet v 1基因在黄萎病菌处理下的表达模式。利用病毒诱导的基因沉默技术(VIGS)对Bet v 1基因进行功能鉴定。【结果】[棉花D基因组中包含59个成员,其中57个基因带有内含子,分布于8条染色体上,多数为亲水性蛋白并定位于细胞质。]黄萎病菌胁迫条件下3个野生棉种的Bet v 1基因表达量与其抗病水平一致。将不同表达水平的基因分为3组,其中第3组基因响应黄萎病菌侵染并在抗病棉种瑟伯氏棉中高表达,表明该组基因可能与黄萎病胁迫应答反应有关。从中筛选出高水平表达的Bet v 1基因,在陆地棉中沉默相应的同源基因,棉株感病加重,揭示该基因在棉花抵御黄萎病菌侵染过程中起正调控作用。【结论】响应黄萎病菌胁迫的Bet v 1基因在棉花抗黄萎病复杂的生物过程中至关重要。本研究结果为棉花Bet v 1家族基因的深入研究提供依据,为进一步解析棉花Bet v 1基因的功能奠定基础。     

棉花RAV基因家族的全基因组分析

在二倍体棉花D5基因组(Gossypium raimondii Ulb.)数据库中鉴定出10个RAV基因,分布于4、5、8、9、13号染色体;在二倍体棉花A2基因组(Gossypium arboreum L.)数据库中鉴定出10个RAV基因,与棉花D5基因组的R AV成员的数量和序列具有一一对应的同源关系,推测棉花A、D组的祖先种中可能存在10个RAV基因。对植物R AV蛋白序列做系统发育分析,将R AV成员分为4个组;发现棉花R AV基因可能参与了棉属所特有的基因组多倍化事件的证据。对N CBI中陆地棉(Gssypium hirsutum L.)EST、Unigene数据库做比对统计,得到陆地棉不同组织中R AV基因表达情况;对陆地棉受黄萎病菌胁迫后的荧光定量检测,发现棉花RAV基因与棉花响应黄萎病菌的胁迫相关。     

基于黄褐棉导入系群体定位抗黄萎病QTL

【目的】黄萎病(Verticillium wilt)是棉花生产中的最主要病害,且棉花黄萎病的致病机理尚不清楚。通过构建黄褐棉导入系群体定位棉花黄萎病抗性相关的数量性状位点(quantitative trait loci,QTL),为抗黄萎病分子标记开发和辅助育种提供参考。【方法】以陆地棉(Gossypium hirsutum)B0011为轮回亲本、黄褐棉(G.mustelinum)为供体亲本,构建有71个株系的BC₅S₅群体。利用2 839个单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)标记结合表型值进行黄萎病抗性相关QTL定位。【结果】共检测到15个与黄萎病抗性相关的QTL,可解释4.21%～26.77%的表型变异。加性效应分析表明：其中6个QTL的有利等位基因来源于黄褐棉,9个QTL有利等位基因来自B0011。同时,qVW-A01-1、q VW-A02-2和qVW-A07-2在2个及以上环境中被检测到,表型变异解释率分别为15.56%～16.56%、11.95%～24.62%和13.22%～16.7...     

植物生长调节剂与杀菌剂互作防治棉花枯萎病及增效作用探究

本实验旨在筛选出能有效防治棉花枯萎病的植物生长调节剂与杀菌剂组合，并探究其增效机理，为植物生长调节剂与杀菌剂互作防治棉花枯萎病提供技术指导和理论依据。通过室内毒力测定挑选EC₅₀最小的2种杀菌剂；通过种子活力和分生孢子萌发实验确定植物生长调节剂的最适浓度；两者混用进行室内盆栽试验，测定两者互作的防治效果及增效作用；通过q RT-PCR测定茉莉酸(jasmonic acid,JA)和水杨酸(salicylic acid,SA)途径相关基因在棉花中的表达量。试验结果发现，5种杀菌剂中多菌灵和萎锈灵的EC₅₀最小，对枯萎病菌的毒力最强，EC₅₀分别为13.894 mg/L和29.566 mg/L；综合苄氨基嘌呤和萘乙酸2种植物生长调节剂对种子活力的影响和对枯萎病菌分生孢子萌发的影响，得到其最适防治浓度分别为5 mg/L和50 mg/L。杀菌剂与植物生长调节剂互作防治棉花枯萎病效果最好的为苄氨基嘌呤与多菌灵组合，防效可达80.95%，且具有显著增效作用；qRT-PCR结果显示，JA和SA途径相关基因在药剂处理的棉花中的相对表达显...     

陆地棉TLP基因家族的全基因组鉴定及表达分析

【目的】类甜蛋白(Thaumatin-like proteins,TLP)参与多种植物病原真菌侵染后的防御反应。本研究通过在全基因组分析TLP基因,为深入探究其在介导棉花抗黄萎病通路中的分子机理提供基础。【方法】分别利用生物信息学方法和荧光定量聚合酶链式反应技术对陆地棉中的TLP基因进行全基因组鉴定和响应棉花黄萎病菌侵染表达分析。【结果】共鉴定出88个TLP基因;通过系统发育分析和序列特征分析可将棉花TLP家族分为10类。TLP基因家族外显子数量介于1～5之间,内含子介于0～4之间,同组成员具有相似的基因结构。大部分TLP含有5个保守的motif,具有相同的基序组织模式,均为Motif 5_4_2_3_1。染色体定位显示87个TLP基因定位于陆地棉20条染色体上,其中A亚组和D亚组各分布有42和45个,其在染色体上的分布存在串联重复现象。响应病原菌侵染表达分析显示,黄萎病菌侵染可以诱导6个候选基因的表达,不同抗性品种相对表达量达到峰值的时间不同,且耐病品种(GZ-1)上述基因表达量比感病品种(86-1)有增高的趋势。【结论】该研究结果有助于了解棉花TLP基因家族的进化与功能。     

棉花GhIQM1基因克隆及抗黄萎病功能分析

棉花是我国重要的经济作物,而黄萎病(Verticillium wilt)是棉花生产上的主要病害,严重危害棉花产量和纤维品质。本研究通过转录组数据分析筛选出1个与棉花抗病相关、不依赖Ca²⁺的钙调素结合蛋白基因GhIQM1。该基因受黄萎病菌和水杨酸(SA)诱导表达。利用病毒诱导的基因沉默(virus-induced gene silencing, VIGS)技术研究其在棉花抗黄萎病中的功能发现,抑制GhIQM1基因表达增强了植株对黄萎病的抗性, TRV:GhIQM1植株病情指数、维管束褐化程度、体内病原菌积累量都显著低于TRV:00。qRT-PCR分析表明,抑制GhIQM1表达的植株接种黄萎病后,作为参与水杨酸途径中的3个重要基因NPR1、NPR3和PR5的表达量显著高于对照。以上结果初步表明,GhIQM1基因可能通过抑制SA途径负调控了棉花的黄萎病抗性。     

陆地棉PPO基因全基因组鉴定及对黄萎病菌的响应分析

【目的】多酚氧化酶(Polyphenol oxidases,PPO)广泛参与植物抵抗病虫害等生物逆境胁迫的过程。本研究旨在研究棉花中的PPO基因及其表达模式,验证多酚氧化酶与棉花抗黄萎病的关系。【方法】分析了黄萎病菌V991侵染下异源四倍体陆地棉TM-1根系中PPO酶活力变化,并利用TM-1的基因组数据库,鉴定相关基因,并进行生物信息学和表达分析。【结果】共筛选到13个候选GhPPO基因。这些基因都不含内含子,所编码的蛋白包含2个铜离子结合位点和PPO的保守序列(酪氨酸酶、DWL和KFDV保守结构域)。进化分析显示,陆地棉PPO基因的种内相似性大于种间相似性,并且相互之间形成了多对重复基因。GhPPO的表达量差异较大,少数基因具有组织特异表达的特性,多数基因在棉花不同组织中表达量都很低。实时荧光定量聚合酶链式反应分析结果表明:GhPPO6D在棉花根系中表达量较高,且在黄萎病菌V991侵染后上调。【结论】GhPPO6D可能参与了棉花与黄萎病菌的互作过程,与V991侵染后棉花根系PPO酶活力上升相关。     

陆地棉小GTP结合蛋白基因GhRop4的克隆及其表达分析

【目的】对陆地棉小GTP结合蛋白基因(Small GTP-binding protein)GhRop4(AY965614.1)在多种逆境胁迫下的应答表达模式进行研究分析,为棉花抗逆相关基因克隆及棉花抗逆分子机制研究奠定基础。【方法】利用生物信息学方法分析了GhRop4基因的结构特征和进化树关系,并通过荧光定量PCR(Real-time quantitative polymerase chain reaction,qRT-PCR)的方法分析Gh Rop4基因的组织表达特异性和不同逆境诱导条件下的表达模式。【结果】以陆地棉c DNA为模板克隆得到GhRop4基因,其开放阅读框为588 bp,编码包含195个氨基酸残基的Ⅰ型Rop蛋白。氨基酸多重序列比对表明,GhRop4与其它植物Rop蛋白高度同源,符合Rop蛋白结构特点。qRT-PCR分析表明,GhRop4基因在棉花幼苗根、茎、叶、子叶和下胚轴中均有表达,且在子叶和茎中表达水平较高。GhRop4基因对高盐、干旱、低温和棉花黄萎病菌处理都有一定程度的响应。【结论】Gh Rop4基因在陆地棉的逆境胁迫适应过程中可能具有重要的作用。     

陆地棉小GTP结合蛋白基因GhRop4的克隆及其表达分析

【目的】对陆地棉小GTP结合蛋白基因(Small GTP-binding protein)GhRop4(AY965614.1)在多种逆境胁迫下的应答表达模式进行研究分析,为棉花抗逆相关基因克隆及棉花抗逆分子机制研究奠定基础。【方法】利用生物信息学方法分析了GhRop4基因的结构特征和进化树关系,并通过荧光定量PCR(Real-time quantitative polymerase chain reaction, qRT-PCR)的方法分析Gh Rop4基因的组织表达特异性和不同逆境诱导条件下的表达模式。【结果】以陆地棉c DNA为模板克隆得到GhRop4基因,其开放阅读框为588 bp,编码包含195个氨基酸残基的Ⅰ型Rop蛋白。氨基酸多重序列比对表明,GhRop4与其它植物Rop蛋白高度同源,符合Rop蛋白结构特点。qRT-PCR分析表明,GhRop4基因在棉花幼苗根、茎、叶、子叶和下胚轴中均有表达,且在子叶和茎中表达水平较高。GhRop4基因对高盐、干旱、低温和棉花黄萎病菌处理都有一定程度的响应。【结论】Gh Rop4基因在陆地棉的逆境胁迫适应过程中可能具有重要的作用。     

普通菜豆镰孢菌枯萎病抗病相关基因PvCaM1的克隆及表达分析

钙调素蛋白(calmodulin,CaM)作为植物细胞内介导多种功能的Ca²⁺结合蛋白,在调节植物的生长发育和抗病性方面具有重要作用。利用普通菜豆(Phaseolus vulgaris L.)表达序列标签(EST)克隆了含有编码普通菜豆CaM基因的cDNA序列。序列分析表明,cDNA片段长713 bp,命名为PvCaM1,具有一个453 bp的开放阅读框(ORF),GenBank登录号为JN418801,该基因编码150个氨基酸,预测蛋白质分子质量为17.16 kD。蛋白质结构分析表明,PvCaM1蛋白含有4个Ca²⁺结合结构域(EF-hand)。同源分析结果显示,PvCaM1基因与百脉根、西瓜的CaM基因亲缘关系最近,分别达到77%和76%。荧光定量PCR分析表明,PvCaM1基因受尖孢镰孢菌菜豆专化型FOP-DM01菌株诱导表达,接种病原菌96 h,抗病品种260205根中PvCaM1基因的表达量达到最高,而感病品种BRB-130达到最低,260205叶中PvCaM1基因的表达量均高于BRB-130,而且叶中的表达量高于根和茎中的表达量。PvCaM1基因表达量也受外源植物激素脱落酸、茉莉酸甲酯和乙烯利诱导上调,在根、茎、叶中均有不同程度的表达。本研究表明PvCaM1基因可能通过脱落酸、茉莉酸和乙烯等信号途径参与菜豆对FOP-DM01菌株的防御反应,推测菜豆PvCaM1基因与镰孢菌枯萎病的抗病性有一定关联。     

红麻HcAOC1基因克隆及响应茉莉酸甲酯的表达模式分析

茉莉酸对植物的生长发育、花药开裂具有重要调控作用。丙二烯氧化物环化酶基因(AOC)是茉莉酸合成途径关键基因,在植物生长发育、育性调控过程也发挥关键作用。为了探究红麻茉莉酸合成途径中关键基因(HcAOC1)的调控机理,本研究以红麻细胞质雄性不育系UG93A为材料。利用同源克隆的方法,以UG93A的g DNA和cDNA为模板,成功克隆获得HcAOC1基因全长。其CDS序列为780 bp,编码259个氨基酸残基,蛋白质分子量为28.4 kD,等电点为9.28。HcAOC1系统发育进化树分析结果表明,红麻与棉花、蓖麻、榴莲的亲缘关系较近,与小果野芭蕉、萝卜的亲缘关系较远(GenBank登录号:MW520098)。此外,在花期采用不同浓度的外源茉莉酸甲酯(MeJA)处理红麻。在处理的第0天、5天、10天和15天后取样成熟期花药,利用RT-qPCR分析不同处理时间下HcAOC1的表达差异,发现HcAOC1表达量随着处理时间延长存在先增高后降低的趋势,即0.5 mmol/L (T1)、1 mmol/L (T2)、2 mmol/L (T3)处理在第10天HcAOC1的表达量达最高值,均极显著高于对照组...     

基于RIL群体鉴定棉花抗黄萎病相关QTLs

【目的】鉴定出能够稳定表达的棉花抗黄萎病相关数量性状位点(Quantitative trait loci,QTLs)。【方法】以抗落叶型黄萎病棉花品种常抗棉和感黄萎病品种TM-1为亲本配制的111个重组自交系家系为作图群体,筛选出多态性简单序列重复(Simple sequence repeat,SSR)标记,并用于构建遗传图谱。用完备复合区间作图法对该群体在安阳大田、新疆重病地及病圃等多个环境下的黄萎病病情指数进行QTLs检测。【结果】构建了1张含有12个连锁群、40个标记、总长212.5 cM(厘摩)的遗传图谱。获得了6个与抗黄萎病基因相关的QTLs,对数优势比(Logarithm of the odd score,LOD)分布在2.51～5.55,贡献率最大为20.34%,最小为6.93%。其中,qVR-D05-1能够在安阳大田2015年7月15日和新疆南疆重病地2016年7月9日2个环境中检测到,贡献率分别为12.96%和20.34%。【结论】本研究得到的qVR-D05-1能够为定位出稳定的棉花抗黄萎病相关QTLs提供参考。     

陆地棉GhDAHP基因的克隆与表达分析

棉花黄萎病是制约棉花产业健康发展的一种重要病害,在生产上未发现有效的根治办法,使用现代基因工程技术,从基因库中挖掘抗黄萎病相关基因,为棉花抗黄萎病育种工作的提供理论基础。本研究根据在GenBank中检索到抗黄萎病基因SDAHP(GU479467,1,3-脱氧-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸合成酶),从陆地棉基因组数据库中检索到3个同源基因(NM_016893351.1,XM_016849738.1和XM_0168151150.1),根据3个同源基因核苷酸序列设计引物,以陆地棉cDNA为模板进行克隆,获得3个目的基因,依次命名为GhDAHP-1、GhDAHP-2和GhDAHP-3。利用ProtParam和Prot Scale等在线软件对目的基因进行生物信息学分析;RT-PCR分析黄萎病菌诱导后目的基因在陆地棉叶片中的表达量。结果表明:GhDAHP-1序列全长1983 bp,氨基酸总数为539,分子质量约59.45378 kD,理论等电点pI为8.7;GhDAHP-2序列全长1832 bp,氨基酸总数516,分子质量约57.02998 kD,理论等电点pI为7.68;GhDAHP-3序列全长1652 bp,氨基酸总数517,分子质量约56.95491 kD,理论等电点pI为8.52。系统进化树分析,GhDAHP与雷蒙德氏棉(Gossypium raimindii)、木本棉(Gossypium arboreum)的亲缘关系最近。棉花叶片在黄萎病菌的处理下,GhDAHP基因表达量呈现先升高后降低的趋势,推测受到黄萎病诱导后,GhDAHP基因可能参与了黄萎病菌侵染的防卫过程。     

棉花黄萎病相关基因GhAAT的克隆与功能鉴定

棉花黄萎病(Verticillium dahliae)是一种土传性真菌维管束病害,严重影响棉花的生产。本研究通过转录组数据分析筛选出一个与棉花黄萎病相关的氨基酸转运蛋白GhAAT基因,该基因在棉花根部响应黄萎病菌诱导表达。利用病毒诱导的基因沉默(virus-induced gene silencing, VIGS)技术研究其在棉花抗黄萎病中的功能。结果显示将该基因在棉花TM-1的叶片和根部沉默后,棉花对黄萎病抗性减弱,证明GhAAT基因参与调控了棉花抗黄萎病功能。发掘棉花抗黄萎病菌重要调控基因并揭示其分子机制对培育棉花抗病品种具有重要意义。     

棉花CLE多肽家族的全基因组鉴定与生物信息学分析

【目的】CLE(CLAVATA3/Embryo surrounding region-related)多肽是一类小分子分泌蛋白,在植物生长发育过程中,对于维持分生组织细胞增殖与分化间的平衡起到重要的信号转导和调控作用。CLE家族是迄今为止报道的最大的植物多肽分子家族,也是近十年来研究最为热门的植物多肽激素。尽管CLE基因家族在拟南芥和水稻等模式植物中取得较多的研究进展,但在棉花中有关CLE多肽基因家族的研究尚属空白。通过对CLE多肽家族的鉴定及演化研究,可以为进一步挖掘棉花中的功能多肽及其信号转导研究提供一定的理论基础。【方法】本文以亚洲棉(Gossypium arboreum L.)、雷蒙德氏棉(G. raimondii Ulbrich)、陆地棉(G. hirsutum L.)和海岛棉(G. barbadense L.)为研究对象,利用生物信息学方法和已鉴定的拟南芥CLE基因序列,在棉花基因组中进行同源比对,并对4个棉种中的CLE家族成员进行全基因组鉴定和分析。【结果】共得到148个棉花CLE候选基因。陆地棉和海岛棉中CLE基因数量都分别是亚洲棉和雷蒙德氏棉的2倍。聚类分析将所有CLE基因分为5个亚组。Ka/Ks分析表明大部分基因都经历了负选择作用,有11对基因经历了显著的正选择作用。转录组数据分析发现,除海岛棉中的GbCLE39、GbCLE13、GbCLE43,陆地棉中GhCLE34、GhCLE9以及亚组棉中的GaCLE4外,大部分CLE基因在棉花组织中的表达量较低,这与多肽在植物体内含量较低相一致。CLE核心保守基序分析发现了12个棉花特有的多肽,其中有2个多肽来源于受到强烈正选择作用的基因,因此在后续研究中可以对其进行进一步深入分析。【结论】本文利用生物信息学、比较基因组学等方法,首次对棉花的CLE基因家族进行了鉴定和分析,对于进一步挖掘棉花中的功能多肽及其信号调控网络研究提供了一定的理论基础。     

陆地棉NAC转录因子基因GhNAC6的克隆、表达和耐盐性分析

【目的】NAC(NAM-ATAF-CUC)家族是植物细胞内特有的1类转录因子家族,参与植物的抗逆过程。为了研究棉花抗逆的分子机制,本研究从陆地棉TM-1中克隆到1个NAC转录因子基因并研究了其功能。【方法】根据其序列同源性和进化分析结果,将该基因命名为GhNAC6,本文对GhNAC6进行了生物信息学和表达分析,并利用病毒诱导基因沉默技术在棉花中沉默GhNAC6的表达。【结果】GhNAC6全长为1629 bp,包含2个内含子,其中编码区为900 bp,编码1个相对分子质量为33.9×10~3、等电点为6.18的蛋白。GhNAC6启动子区段包含多个与诱导表达和组织特异表达相关的顺式作用元件。转录组数据分析结果表明,GhNAC6在棉花发育的不同时期具有时空表达差异性;实时荧光定量核酸扩增检测结果显示GhNAC6还受到植物激素水杨酸、乙烯利、茉莉酸甲酯和逆境胁迫低温、高温、高盐、伤口的诱导。干涉GhNAC6基因发现,降低GhNAC6基因的表达能增强棉花对盐胁迫的耐受性。【结论】研究结果表明GhNAC6可能参与了棉花发育、逆境响应和激素信号传导的过程。     

棉花抗黄萎病相关基因的序列和表达分析

黄萎病是棉花生产的主要病害,克隆抗病基因是培育棉花抗黄萎病品种的关键。本文根据前期的定位结果,结合棉花基因组测序信息,提取定位区段内基因组序列,预测获得63个基因。Gene Ontology分析表明63个基因参加多种生物进程,其中6个基因参与植物抗逆进程。根据Gene Ontology分析和前人研究结果,选择15个基因进行序列分析。启动子序列分析表明启动子区域包含各种抗逆的调控元件,其中6个基因包含了W-box元件。对海7124和苏棉8号棉花幼苗进行黄萎病菌处理,取病菌处理后不同时期的根,选择14个基因进行表达分析,结果表明在黄萎病菌处理后,有8个基因表达出现变化,其中在海7124和苏棉8号之间表达差异最大的基因是跨膜蛋白(Transmembrane protein 214-a isoform 1)、细胞色素P450(Cytochrome p450)和Udp-糖基转移酶UGT89A2(Udp-glycosyl transferase 89a2-like)基因。本研究为抗病基因克隆提供了候选基因。