GAPB基因原核表达载体的构建

以拟南芥cDNA为模板,用PCR扩增出GAPB的基因全长,然后将GAPB基因片段连接到PET28a(+)载体上,构建重组质粒并转化大肠杆菌DH5α,经菌落PCR和酶切鉴定筛选出阳性克隆,测序正确后,再将阳性克隆的质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)。结果表明:成功构建了原核表达载体PET28a(+)-GAPB,为后续的GAPB融合蛋白的表达以及纯化奠定了基础。     

肌肉生成抑制素和抑制素融合表达质粒的构建和表达

以乙肝表面抗原S基因为载体,分别将肌肉生成抑制素N端基因片段和抑制素N端基因片段分别插入S基因C端和第112～113 氨基酸残基密码子之间,构建MSTN-INH融合表达质粒pVAX-SMI。酶切和测序鉴定表明,重组质粒pVAX-SMI构建成功。脂质体法将pVAX-SMI转染HeLa细胞,Western Blot检测表达产物的免疫原性。结果表明,融合目的蛋白成功在HeLa细胞中表达,并具有免疫原性。     

牛Nanog 原核表达载体构建及其在大肠杆菌中的表达

本研究的目的是构建牛Nanog基因原核表达质粒,并在大肠杆菌JM109中诱导其表达。从6周龄的胎牛原始生殖嵴中提取总RNA, 通过RT-PCR扩增Nanog 基因,将其克隆到PMD-18T载体,再从酶切鉴定和测序正确的质粒上切下目的片断,定向克隆到 pGEX-KG表达载体上,获得原核表达质粒pGEX-KG -Nanog ,限制性内切酶分析和DNA测序证明所插入片段为牛Nanog基因编码序列。重组质粒转化大肠杆菌JM109, 在不同的培养温度和不同浓度的IPTG诱导下均获得了高效表达,说明培养温度和IPTG浓度对GST-Nanog融合蛋白在大肠杆菌中的表达影响甚微;经Western Blotting 检测证实该蛋白约60KD, 大小合适,具有GST抗原活性,从而证实目的蛋白为Nanog 蛋白。     

抗线虫基因表达载体构建与转化甘蔗研究初报

试验研究利用德国引进的抗线虫基因Hs1pro 1构建表达载体并转化甘蔗 (SaccharumofficinarumL .) ,以获得抗线虫转基因植株。提取克隆载体P1832用NcoⅠ酶切、Klenow补平和SacⅠ酶切 ,回收基因片段 ;提取表达载体pBIL 1用KpnⅠ酶切、T4DNApolymerase补平和SacⅠ酶切 ,回收大片段 ;目的片段用T4DNAligase连接并转化E .coli,鉴定重组质粒 ;用基因枪轰击转化甘蔗品种“ROC”16获得 16株再生苗 ,其中 4株经PCR检测呈阳性 ,通过Southern杂交 ,证明Hs1pro 1基因已整合到其中 3株甘蔗基因组中     

猪链球菌2型纤连蛋白/血纤蛋白原结合蛋白 全基因的克隆及融合表达

采用发表的引物对,以猪链球菌2型（Streptococcus suis type 2）江苏分离株HA9801的基因组DNA为模板,采用PCR方法扩增纤连蛋白/血纤蛋白原结合蛋白基因fbps（GenBank登录号为AY565303）克隆于pMD-T18载体构建成载体pMD-T-fbps.经内切酶酶切和测序鉴定后,将由pMD-T-fbps内切酶切下的片段定向克隆于表达载体pET-32a（＋）,得到重组质粒pfbps.将重组质粒pfbps转化大肠杆菌（Escherichia coli）BL21株,经IPTG诱导,可高水平地表达相对分子量为83 kD的融合蛋白.配体印迹结合试验表明,表达的融合蛋白可与人纤连蛋白结合.     

pBI121-Lyz-GFP表达载体的构建及其对和田苜蓿愈伤组织的转化

利用分子克隆技术,将GFP基因片段插入到pBI121-Lyz多克隆区,构建了重组表达载体pBI121-Lyz-GFP。经SmaI与BamHI双酶切和PCR验证重组质粒,均能得到约750bp的目的片段,通过进一步测序证明：GFP基因已成功连接到pBI121-Lyz中,且重组质粒连接方向正确。利用冻融法将重组质粒导入农杆菌菌株LBA4404,用叶盘法转化和田苜蓿,筛选出具有卡那霉素抗性的愈伤组织,经PCR扩增和荧光显微镜检测证明重组基因已成功转化到和田苜蓿愈伤组织中。     

PRK基因原核表达质粒的构建

以拟南芥cDNA为模板,扩增出PRK基因,构建重组质粒pET-28a(+)-PRK转化大肠杆菌DH5α。经PCR鉴定和酶切鉴定筛选出阳性克隆,将阳性克隆的质粒转化到大肠杆菌表达载体BL21中,构建PRK基因原核表达载体。测序结果表明pET-28a(+)-PRK载体构建成功。     

猪细小病毒VLPs供外源蛋白插入的候选位点发现及其重组PCV2-ORF2的病毒样颗粒构建

先将猪细小病毒(PPV)SC-1株VP2基因扩增产物克隆到pMD18-T载体构建质粒pMD-VP2;设计两对引物(分别引入Hind Ⅲ和Sac Ⅰ两个酶切位点)扩增猪圆环病毒二型(PCV2)SC株ORF2基因,构建了pMD-ORF2.A和pMD-ORF2.B两质粒;经相应内切酶酶切后回收目的片段,插入PPV SC-1株VP2基因的Hind Ⅲ和Sac Ⅰ两个特异限制酶切位点处(分别对应于PPV VP2蛋白N端和C端1/3处),得到重组质粒pPVP2-ORF2.A和pPVP2-ORF2.B.经鉴定后的质粒pPVP2-ORF2.A和pPVP2-ORF2.B用Kpn Ⅰ、BamH Ⅰ和ApaL Ⅰ三酶切,回收含VP2和ORF2基因的目的片段克隆至真核表达载体(pEGFP-C1),得到重组质粒pEGFP.VO.A和pEGFP.VO.B.脂质体法转染重组质粒于Cos7细胞后,采用荧光显微镜和电镜观察基因表达情况,结果仅在转染pEGFP.VO.A的样品中观察到了病毒样颗粒(VLPs).纯化VLPs免疫小鼠,结果显不能产生较好的细胞免疫和针对PPV和PCV2的特异性体液免疫,该结果表明研究中获得了PCV VP1-PCV2ORF2重组VLPs,同时也揭示PPV VPLs的N端1/3适于外源蛋白插入构建重组VLPs     

香蕉条斑病毒ORFⅠ、ORFⅡ在大肠杆菌中的原核表达和自激活特性的鉴定

目前,香蕉条斑病毒所有3个ORF表达产物功能均不明确,通过双杂技术研究病毒未知蛋白与宿主蛋白的互作,可以初步推断未知蛋白的功能。本实验旨在构建香蕉条斑病毒ORFⅠ和ORFⅡ在细菌双杂系统中的诱饵质粒。首先以课题组保存的连接有香蕉条斑病毒河口分离物全基因组的pMD-18T载体DNA为模板,经过PCR扩增,切胶回收,并通过与带有λcI基因的pBT载体共同双酶切及T4连接酶连接后,得到与λcI基因融合表达的重组载体pBT-ORF1和pBT-ORF2。转化大肠杆菌XL1-BlueMRF＇报告菌株,用IPTG（0.1mmol/L）诱导目的基因片段表达。Westernblotting结果表明,ORF1-λcI和ORF1-λcI两种融合蛋白均成功表达,且大小与预期一致。之后,pBT-ORF1及pBT-ORF2分别与空质粒pTRG共转化XL1-BlueMRF＇报告菌株,pBT空质粒和pTRG-Gal11p共转化作为阴性对照。结果显示pBT-ORF1及pBT-ORF2均无自激活现象,可以进行后续的细菌双杂工作。本实验为BSV与宿主的细菌双杂系统的建立及蛋白组学的研究奠定了基础。     

草莓乙烯受体FaEtr1和FaErs1基因的克隆及其反义表达载体的构建

在已报道的FaEtr1和FaErs1基因序列的基础上,设计特异引物,分别克隆草莓(Fragaria ananassa)乙烯受体FaEtr1基因580bp部分特异序列和FaErs1基因445bp部分特异序列,将上述2个片段分别反向插入植物表达载体pBI121的CaMV35S启动子和Nos终止子之间,构建了反义表达载体pBI121Etr1和pBI121Ers1。将带有完整启动子和终止子的FaEtr1和FaErs1基因引入pCAMBIA1301中,最终获得FaEtr1和FaErs1的双价植物表达载体pFRS。将这3个重组表达质粒pBI121Etr1、pBI121Ers1和pFRS导入根癌农杆菌(Agrobactrium tumefaciens)EHA105中,PCR及限制性内切酶酶切确定质粒已被导入。     

口蹄疫病毒3D蛋白在T4噬菌体衣壳表面的展示

本文通过PCR技术获得3D基因,使用拼接重叠延伸聚合酶链反应对3D基因内部的EcoRⅠ位点进行定点突变,将突变后的3D基因克隆至原核表达质粒pSOC和T4噬菌体的穿梭质粒pR中,通过PCR及质粒酶切鉴定,分别获得阳性重组子pSOC-3D和pR-3D。将含有3D基因的重组质粒pSOC-3D质粒转化大肠杆菌BL21进行表达,SDS-PAGE检测表达产物。将含有3D基因的重组质粒pR-3D转化T4噬菌体的宿主菌E2,通过同源重组获得重组噬菌体T4-3D,经SDS-PAGE及Western- blot检测,证明展示在T4噬菌体表面的3D融合蛋白能与FMDV感染血清发生特异性反应。     

真核表达载体pIRES2-ZsGreen1-opLA的构建及其在猪成纤维细胞的表达

α-乳清蛋白(α-lactalbumin,α-LA)是哺乳动物乳汁中一种重要的蛋白质,富含机体必需氨基酸和支链氨基酸,其极佳的氨基酸比例、易吸收性以及功能特异性,使得α-LA在婴幼儿个体正常生长中具有重要的意义。本实验旨在构建人α-乳清蛋白真核表达载体pIRES2-ZsGreen1-opLA,将其转染至猪(Susscrofa)的成纤维细胞,获得稳定表达人α-LA的细胞。根据猪基因密码子偏爱性优化并合成人α-乳清蛋白基因mRNA序列opLA,并将其定向克隆入pIRES2-Zs Green1真核表达载体,双酶切及测序方法鉴定重组载体;脂质体介导的方法将载体转染入培养的猪成纤维细胞,荧光显微镜下观察转染效果,G418抗性筛选重组细胞;RT-PCR方法检测目的基因的表达。结果表明,通过酶切以及测序鉴定得到的重组载体pIRES2-Zs Green1-opLA构建成功;荧光显微镜下观察,转染了pIRES2-Zs Green1-opLA和pIRES2-Zs Green1空载体的细胞均发出绿色荧光,且荧光多集中于细胞核;筛选重组细胞的最小G418浓度为400ng/μL;RT-PCR法检测到与目的基因大小一致的片段,而未转染组和转染空载体组均未检测到。本实验成功构建真核表达载体pIRES2-ZsGreen1-opLA,并获得稳定表达目的基因的猪成纤维细胞,该细胞可作为进一步研究转基因克隆猪的供体细胞。     

猪繁殖与呼吸综合症病毒ORF5基因的融合表达

根据GenBank公布的猪繁殖与呼吸综合症病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus , PRRSV)ORF5基因的核苷酸序列设计3对特异性引物，从重组质粒pMD- ORF5中扩增去除ORF5基因中包括全部信号肽在内的N端跨膜区(28 residues)和中部跨膜区(60 residues)。改造后的ORF5基因分别命名为ORF5-1和 ORF5-2。将2个基因片段定向克隆到原核表达载体pET-32a(+),构建重组质粒pET-ORF5-1和pET-ORF5-2,转化大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)感受态细胞，经IPTG诱导表达和SDS-PAGE电泳分析，ORF5-1和ORF5-2基因获得融合表达，表达量分别为12.2%和39%，证明删除双跨膜区能明显提高ORF5基因的表达量。经Western blot分析，融合蛋白具有一定的免疫学活性，表明摘除跨膜区对该蛋白的抗原性影响不大。     

人胰腺激肽释放酶cDNA的克隆、序列分析和原核表达

摘要: 为了研制人激肽释放酶（KLK1）特异单克隆抗体和进行重组酶的鉴定及纯化，根据已发表的人KLK1序列设计引物，用PCR扩增法从人胰腺单链cDNA库中特异地扩增出KLK1 cDNA。将其克隆入pGEM-T载体中,对5个重组质粒进行了序列测定，其中1个cDNA克隆的核苷酸序列与已发表的人肾/胰/唾液腺KLK1 cDNAs序列完全相同或有3个核苷酸差异。将去除信号肽序列的KLK1 cDNA以正确阅读框插入表达载体pGEX-4T-3,构建成重组质粒pGEX-KLK1。此重组质粒转化的E.coli 经IPTG诱导后表达分子量为48 kDGST-KLK1融合蛋白，表达产物主要以不溶性包涵体形式存在，可溶性部分能被Glutathione Sepharose 4B特异吸附，两者都能被GST特异单克隆抗体识别。用SDS-PAGE分离纯化的融合蛋白免疫小鼠，获得的抗血清的ELISA效价为1∶1600。结果表明，克隆的人KLK1 cDNA及其表达产物是正确的，可以用于人KLK1单克隆抗体的制备。     

Overlap-PCR克隆秦川牛HCRTR1基因及其在大肠杆菌中的表达分析

通过Overlap-PCR方法克隆了秦川牛的HCRTR1基因编码区全长,获得1278 bp编码区全长序列,将其克隆至pMD-18T载体上,经测序表明获得的cDNA序列与GenBank公布的序列同源性均为98%。提取阳性克隆的质粒经BamHI和HindⅢ双酶切后,回收到1278 bp的目的片段,定向克隆到pET32a（+）表达载体上,连接产物转化Bl21(DE3)感受态大肠杆菌,对长出的菌落进行菌落PCR和质粒酶切鉴定正确后,用IPTG诱导目的蛋白的表达。SDS-PAGE表明秦川牛HCRTR1基因在大肠杆菌中不表达,生物信息学分析表明,HCRTR1基因的表达产物为具有7个跨膜螺旋的G蛋白偶联受体,可能是此类蛋白在原核系统的表达将会影响细菌本身存活,因此原核表达系统也成为研究此类蛋白的瓶颈。     

手掌参中赤霉酸诱导的富含半胱氨酸蛋白基因的表达、纯化及鉴定

目的: 构建含赤霉酸诱导的富含半胱氨酸蛋白基因(gcgasa)的原核表达载体,并在E.coli BL21(DE3)中表达。材料：手掌参。方法：设计带有EcoR I和Hind III酶切位点的引物,分别对gcgasa基因编码区全长及信号肽缺失的片段进行PCR扩增,将目标片段克隆入原核表达载体pET-32(a),构建重组质粒。经测序鉴定后,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达融合蛋白,并采用SDS-PAGE、Western-blotting、电镜超薄切片技术检测外源蛋白的表达及定位情况。对于水溶性蛋白,采用Ni2+-NTA亲和层析及凝胶过滤手段纯化。结果: 含有信号肽的外源基因在大肠杆菌周质空间中以包含体形式存在,而信号肽缺失的片段主要以可溶形式表达,经Ni2+-NTA纯化可获得目的蛋白。结论：首次在原核表达系统中高效表达了水溶性的gcgasa蛋白,为其结构和功能的研究奠定了基础。     

小反刍兽疫病毒N基因在大肠杆菌中的表达及鉴定

参照GenBank中小反刍兽疫病毒((Peste des petits ruminants virus,PPRV)N基因序列（Nigeria/75/1）(1 578 bp)设计了1对添加EcoRⅠ和Not Ⅰ酶切位点的引物,对从奥地利引进的pCI-neo-PPRN质粒进行PCR扩增,克隆至pGM-T载体,并转化大肠杆菌Escherichia. coli TOP10感受态细胞,获得重组质粒pGM-T-PPRN。将重组质粒经EcoRⅠ和NotⅠ双酶切的产物插入原核表达载体pET-32a（+）,构建原核表达质粒pET-PPRN,将其转化进BL21(DE3)感受态细胞中后用IPTG诱导表达, 收集菌液进行SDS-PAGE电泳和Western blot分析,结果表明小反刍兽疫病毒N基因在BL21(DE3) 成功表达。所表达融合蛋白的相对分子质量约为80 kD,并能被组氨酸单抗、PPRV标准阳性羊血清及PPRV疫苗免疫羊血清所识别。     

牛干扰素-tau基因的原核表达及生物功能鉴定

本试验采用PCR方法直接从牛早期胚胎细胞液中扩增牛干扰素-tau （bIFN-τ）基因（含信号肽基因序列）,并克隆到pGEM-T载体中,筛选阳性克隆,将含信号肽和不含信号肽的bIFN-τ 片断分别克隆到原核表达载体pET-30a(+),构建重组质粒,进行IPTG诱导表达,表达产物进行变性、复性和纯化,最后通过抗病毒活性检测和对体外培养的牛子宫内膜上皮细胞形态变化的影响,鉴定其生物学功能。结果表明,不提取胚胎基因组DNA,以胚胎的裂解液为模板,可以从少量（5枚）牛囊胚中直接扩增得到bIFN-τ基因,与Genbank报道的序列相比,核苷酸和氨基酸的同源性分别达99％和97％;SDS-PAGE电泳检测,不含信号肽的bIFN-τ基因与表达载体形成的重组质粒,在约20kD处出现特异性条带,与目标蛋白分子量一致;病毒抑制法测定rbIFN-τ的抗病毒活性单位为1×104IU/mg,在牛子宫内膜上皮细胞培养液中添加rbIFN-τ作用24 h后,细胞体积增大,细胞内出现明显的囊泡状结构,表明本研究获得的rbIFN-τ具有一定的生物活性。     

重组海参溶菌酶C端基因(SjLys-C)的可溶性表达和抑菌活性分析

为进一步研究海参(Stichopus japonicus)溶菌酶基因(Sjys)(Genbank登录号:EF036468)中不司片段表达产物的生物特性,本研究通过对其cDNA片段的分析,发现C端基因区域所对应的蛋白质序列中含有非酶活性.根据已知的海参溶菌酶的cDNA序列,设计山含有Nco Ⅰ和EcoR Ⅰ酶切位点的特异性引物,从新鲜的海参肠中提取总RNA,以其为模板利用RT-PCR扩增出长度为259 bp的溶菌酶C端(SjLys-C)基因.将该目的基因连接到pET-32a(+)载体上,构建重组质粒pET-32a(+)-SjLys-C,再转化至大肠杆菌(Escherichia coli)Rosetta(DE3)pLysS,成功地构建了重组蛋白SjLys-C的基因工程菌.利用该工程菌诱导发酵,结果显示它能高效表达出26 kD左右的重组蚩白SjLys-C.经过Western blot分析,该重组蛋白在26 kD左右能够与Penta-His抗体发生特异性免疫反应.对纯化的重组蛋白SjLys-C进行了抑菌特性的分析,结果发现它对溶壁微球菌(Micrococcus lysodeikticus)和副溶血弧菌(Vibrio parahae molytic us)有较高的抑菌活性.此外,将该重组蛋白经100℃、40 min处理后,其抑菌能力提高了5％～21％.研究结果表明,重组蛋白SjLys-C基因工程菌能够制备出具有可溶性的、并具有抑菌活性的重组蛋白SjLys-C,在农业和医药等行业中有潜在应用和开发价值.