对虾白斑综合征病毒（WSSV）囊膜蛋白VP110部分重组表达及其与对虾鳃细胞膜蛋白结合分析

将VP110基因的部分序列克隆到pET-28a载体中构建pET28a-vp110b重组质粒并进行原核表达,获得重组表达的蛋白rVP110-B;用rVP110-B注射凡纳滨对虾Litopenaeus vannamei后,经WSSV感染,实验表明,该蛋白注射使凡纳滨对虾感染WSSV的半数死亡时间比对照组延长了20%。用表达纯化的该重组蛋白制备了兔抗rVP110-B多克隆抗体,该抗体用于凡纳滨对虾鳃细胞膜蛋白与rVP110-B的Far-western分析显示,凡纳滨对虾鳃细胞膜蛋白中除90 kDa左右的血蓝蛋白外,在41.7 kDa存在结合条带,经质谱分析表明这条鳃细胞膜蛋白是肌动蛋白。     

氨氮胁迫下白斑综合征病毒对凡纳滨对虾的致病性

为了评价养殖水环境中氨氮(NH_4-N)对凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)的危害性,开展了NH_4-N胁迫对凡纳滨对虾感染白斑综合征病毒(WSSV)后的死亡率、WSSV增殖速率和对虾主要免疫相关酶活性影响的实验。在NH_4-N胁迫质量浓度为15.6 mg·L-1,分别注射2×105和2×106个WSSV粒子,结果显示,NH_4-N胁迫下注射2×105个WSSV粒子的凡纳滨对虾第144小时死亡率达到53.3%,显著高于无胁迫组(40.0%)。对虾鳃组织WSSV荧光定量PCR检测结果显示,NH_4-N胁迫下凡纳滨对虾鳃组织内WSSV的增殖加快。此外,免疫相关酶活性结果显示,NH_4-N浓度突变会促使对虾血清中酚氧化酶(PO)、酸性磷酸酶(ACP)和碱性磷酸酶(AKP)活性短暂升高后持续降低。由此可见,NH_4-N胁迫会加快WSSV在患病凡纳滨对虾体内的增殖,导致更高死亡率,这可能是因为胁迫造成了对虾免疫相关酶活性降低和抗病原感染能力下降。     

毒死蜱胁迫下WSSV对凡纳滨对虾的致病性

为了评价养殖水环境中毒死蜱对凡纳滨对虾生存的危害性,开展了毒死蜱胁迫下白斑综合征病毒(WSSV)对凡纳滨对虾致死实验,分析了毒死蜱胁迫下凡纳滨对虾鳃组织WSSV含量和肌肉组织乙酰胆碱酯酶活性变化。通过急性毒性实验测定了毒死蜱对凡纳滨对虾的半致死浓度(LC₅₀),随着暴露时间的延长,LC₅₀值显著下降,存在着浓度-反应的正向关系,96 h LC₅₀为0.758 μg/L(0.521～0.987 μg/L)。在此基础上,确定了毒死蜱胁迫实验浓度为0.2 μg/L,此浓度下药浴4 d后对凡纳滨对虾注射WSSV,结果显示:毒死蜱胁迫下注射WSSV组的对虾死亡率(83.33?Ee4.7%)极显著高于乙醇-WSSV组(40.00?Ee0.9%);对虾鳃组织WSSV荧光定量PCR检测结果显示:感染72 h后,毒死蜱-WSSV组WSSV含量约是乙醇-WSSV组的4倍;感染96 h后,毒死蜱-WSSV组WSSV含量显著增加,约是72 h毒死蜱-WSSV组的4.9倍,是96 h乙醇-WSSV组的5.9倍。毒死蜱胁迫下,对虾肌肉组织乙酰胆碱酯酶(AchE)活性低于对照组20%左右。由此可见,毒死蜱胁迫下,WSSV增殖速率加快,导致对虾死亡率升高。     

WSSV与IHHNV竞争对虾鳃细胞膜受体的研究

本研究对白斑综合征病毒(White Spot Syndrome Virus,WSSV)与传染性皮下及造血组织坏死病毒(Infectious Hypodermal and Haematopoietic Necrosis Virus,IHHNV)能否竞争虾鳃细胞膜上的NM23蛋白受体进行探索。先用蔗糖梯度离心法提纯WSSV的全蛋白,利用病毒覆盖蛋白印迹技术(VOPBA)与对虾鳃细胞膜NM23蛋白作用,将疑似蛋白条带进行LC-MS/MS分析,初步筛选出3种WSSV蛋白,分别为WSSV013、Wsv497和Wsv035,再构建这3种蛋白的原核表达载体,通过VOPBA和免疫共沉淀(co-immunoprecipitation)验证了Wsv497、Wsv035能与NM23蛋白相互作用,WSSV013不能与NM23蛋白相互作用。初步推测WSSV与IHHNV可能竞争对虾鳃细胞膜上的NM23蛋白受体,该结果为今后研究两种病毒竞争细胞膜受体和虾病毒蛋白作用机制提供理论基础。     

凡纳滨对虾LvRab5B蛋白与IHHNV病毒蛋白的互作

为了探究LvRab5B蛋白在凡纳滨对虾抗病毒感染中的作用,实验分别构建了LvRab5B蛋白在昆虫和酵母细胞中的融合表达载体,将不同的载体导入不同的细胞中,利用免疫荧光和酵母双杂交的方法研究了Lv Rab5B蛋白在昆虫细胞中的表达以及Lv Rab5B蛋白与病毒IHHNV之间的互作关系;通过qRT-PCR方法研究了该蛋白在健康对虾不同组织中的表达情况以及凡纳滨对虾分别感染IHHNV和WSSV后不同时间点的相对表达量。结果显示,Lv Rab5B基因融合蛋白能够在昆虫细胞中表达;Lv Rab5B蛋白与IHHNV病毒衣壳蛋白CP无相互作用,而与非结构蛋白NS1相互作用明显,与非结构蛋白NS2作用较弱。qRT-PCR结果显示,LvRab5B基因在凡纳滨对虾心脏、鳃腺、肠道、胃、肝胰脏和肌肉中都表达,在肠道中表达量最高,肝胰脏次之;Lv Rab5B蛋白在凡纳滨对虾机体感染病毒前后的表达情况不同,感染初期表达降低,随后迅速上升,末期下降。研究表明,LvRab5B基因参与凡纳滨对虾抵抗IHHNV和WSSV病毒的先天免疫过程,为进一步研究Lv Rab5B蛋白在对虾机体中的免疫功能及作用机制奠定了基础。     

凡纳滨对虾RAS与WSSV-VP26的相互作用

白斑综合征病毒(WSSV)是对虾养殖中主要的病原之一,病原与宿主作用是介导病毒感染的重要过程。RAS蛋白是Ras基因分泌的保守蛋白,为小G蛋白家族的一员,普遍存在于从酵母菌到哺乳动物的真核细胞中,具有偶联受体和效应系统传递跨膜信号的功能,在细胞增殖和分化中起双重调节的作用,但关于RAS与WSSV的作用尚不明确。本研究将凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei) Ras基因克隆至pBAD/gⅢA表达载体上,以E. coli Top10为宿主菌,在L-阿拉伯糖的诱导下获得RAS重组蛋白。以Co~(2+)亲和层析方法,获得纯化的RAS蛋白,质谱分析显示,该蛋白为凡纳滨对虾RAS。采用Far-western和ELISA检测方法分析RAS与WSSV结构蛋白VP26、VP28N和VP37的相互作用。Far-western结果显示,RAS与VP26有明显的结合作用,ELISA实验结果显示,RAS与VP26蛋白的相互作用随RAS量的增加而增强。本研究表明,RAS参与WSSV侵染过程,为进一步研究WSSV侵染机制提供了理论基础。     

综合征病毒与中国对虾血细胞膜体外结合实验研究

筛选小分子受体配基或抗受体蛋白的单克隆抗体作为阻断剂,是阻断病毒感染的有效途径.通过差速离心法提取海捕中国对虾血细胞膜,分别利用Dot-Blot和ELISA技术,将血细胞膜包被于硝酸纤维素(NC)膜或酶标板,使地高辛(Digoxigenin,DIG)标记的对虾白斑综合征病毒(WSSV-DIG)与之4℃结合4 h,并以碱性磷酸酶标记抗DIG抗体作为探针检测,实验结果皆为阳性,证明体外环境下WSsV能稳定地与血细胞膜结合.通过血细胞膜免疫Balb/c小鼠生产抗中国对虾血细胞多克隆抗体,以该多抗37℃孵育血细胞膜1 h,然后使WSSV-DIG与血细胞膜结合并检测.在Dor-Blot实验中,阻断组发色明显浅于未阻断组;在ELISA实验中,阻断组OD值比未阻断组降低69%.可以推断,多抗中抗血细胞受体的抗体与血细胞膜上的受体蛋白结合,占据了WSSV黏附蛋白的结合位点,从而显著地抑制了WSSV与血细胞膜的体外结合.实验所建立的WSSV与对虾血细胞膜体外结合技术可以应用于WSSV与血细胞受体蛋白的黏附特性的研究以及WSSV阻断剂的筛选,多抗阻断实验证明了本方法的可行性.     

氨氮和亚硝基氮共同胁迫对凡纳滨对虾感染WSSV的影响

为了评价养殖水环境中氨氮和亚硝基氮对凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)的危害性,开展了氨氮和亚硝基氮共同胁迫对凡纳滨对虾感染WSSV后的死亡率、WSSV在患病对虾体内增殖速率和对虾主要免疫相关酶活性影响的研究。实验设置氨氮(NH+4)和亚硝基氮(NO-2)的共同胁迫浓度均为20 mg·L-1,分别注射10-4和10-5稀释度的WSSV提取液。结果显示,胁迫下感染10-4WSSV的凡纳滨对虾144 h死亡率达到100%,显著高于无胁迫组(76.67%),相同实验条件下高浓度病毒感染组死亡率高于低浓度组。对虾鳃组织WSSV荧光定量PCR检测结果显示,氨氮和亚硝基氮共同胁迫下凡纳滨对虾体内WSSV的增殖加快,感染48 h后胁迫组病毒量是无胁迫组的1.6倍,72 h时病毒量达到无胁迫组的2.0~3.7倍。此外,免疫相关酶活性结果显示,氨氮和亚硝基氮浓度突变会促使对虾血清中酚氧化酶(PO)、酸性磷酸酶(ACP)、碱性磷酸酶(AKP)活性先短暂升高然后降低。由此可见,氨氮和亚硝基氮共同胁迫会加快WSSV在患病凡纳滨对虾体内的增殖,导致更高死亡率,这可能是因为胁迫造成了对虾免疫相关酶活性的降低和抗病原感染能力下降所致。     

白斑综合征病毒和桃拉综合征病毒对凡纳滨对虾的混合感染

2003年10月青岛胶州市对虾养殖场养殖的凡纳滨对虾出现大规模死亡，死亡率在90％以上，典型症状为肝胰腺发红、通过镜检排除寄生虫和细菌感染后，利用免疫荧光抗体技术(IFAT)和PCR方法从病虾鳃中检出白斑综合征病毒(WSSV)，同时利用RT—PCR方法住同一批病虾鳃中检出桃拉综合征病毒(TSV)。结合发病症状，可以认定两种病毒的混合感染造成了凡纳滨对虾的大规模死亡。     

凡纳滨对虾造血激素基因全长序列分析及其克隆与表达

虾造血激素(astakine,AST)是节肢动物中具有促进造血组织细胞分化和增殖的一种细胞因子。在对白斑综合征病毒(WSSV)感染分子机制的研究中发现,WSSV的一个可能受体蛋白与AST存在特异性结合。为进一步了解WSSV感染与对虾细胞分化之间的关系,本研究应用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)结合cDNA末端快速扩增(RACE)技术,成功克隆了凡纳滨对虾Litopenaeus vannamei造血激素基因(lvast)全长cDNA(GenBank登录号:HM594944),并对该基因进行了生物信息学分析。lvast全长共1846bp,含有1个372bp的开放阅读框,编码124个氨基酸,估算分子量为13.3kD。其编码的氨基酸序列包含一个前动力蛋白(Prokineticin)结构域。基因序列和氨基酸序列同源性比较表明,凡纳滨对虾造血激素(LvAST)与斑节对虾和软尾太平蝲蛄AST同源性较高,与脊椎动物的同源性较低。通过构建包含lvast基因ORF重组表达载体pBAD/gIIIA-lvast,本研究成功表达出与预期相符合的目的蛋白,为进一步研究LvAST的结构与功能提供了理论依据和实验基础。     

对虾白斑综合征病毒囊膜蛋白VP110在中国明对虾鳃细胞中结合蛋白的鉴定与特性

为了鉴定对虾白斑病综合征病毒(WSSV)囊膜蛋白VP110在中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)鳃细胞中的结合蛋白, 运用pET-32(a)+载体构建了1段含RGD模体的截短VP110原核重组表达质粒, 转化大肠杆菌诱导表达后获得分子量为41 kD的截短重组VP110蛋白(rVP110)。以rVP110作为诱饵蛋白, 运用pull-down实验结合蛋白质谱分析鉴定rVP110结合蛋白, 结果显示, 中国明对虾鳃细胞中的肌动蛋白和精氨酸激酶(arginine kinase,AK)与rVP110具有结合作用。利用PCR扩增中国明对虾AK编码基因, 将其与表达载体pGEX-4T-1连接后转化大肠杆菌诱导表达获得重组AK蛋白(rAK), 通过pull-down实验进一步证实rAK可与rVP110发生结合。克氏原螯虾(Procambarus clarkia)体内中和实验结果显示, rAK对WSSV感染克氏原螯虾具有一定的中和作用, 能延缓螯虾的死亡进程。另外, 中国明对虾在人工感染WSSV后, 荧光定量PCR检测结果显示, AK基因表达水平显著上调, 18 h时达到峰值, 然后下降至正常水平; 酶底物法检测结果同样显示, 鳃细胞中AK酶活性在感染WSSV后发生显著上调。本研究旨在为深入了解WSSV囊膜蛋白VP110在WSSV感染宿主过程中的作用提供基础依据。

     

对虾组织膜蛋白制备方法及其多肽组成

选取凡纳缤对虾(Litopenaeus vannamei)的4种组织(鳃、血淋巴、肝胰腺、肌肉)，着重对膜蛋白的提取方法及其多肽组成进行分析。在对虾组织膜蛋白提取过程中，使用了5种蛋白酶抑制剂(苯甲基磺酰氟PMSF、胃酶抑制剂、亮抑酶肽、胰凝乳蛋白酶抑制剂、胰蛋白酶抑制剂)，以减少组织自身的酶将蛋白降解的可能。电镜观察，可见纯度较高的、细胞膜结构卷曲形成的小泡样、封闭的结构。使用Gel-Pro软件对提取产物的SDSPAGE图谱分析，确定了这几种组织的特征多肽分子量分别为75．0kD、70．5kD、26．7kD和71．2kD。     

Rotifer cellular membranes bind to white spot syndrome virus (WSSV)

Cell membranes from the rotifer, Brachionus urceus, were obtained by centrifugation and found to specifically bind white spot syndrome virus (WSSV) in vitro. This finding suggests that there is likely a WSSV receptor on the rotifer cell membrane and provides evidence that rotifers may be a host for WSSV.     

白斑症病毒在日本对虾体内的感染增殖

用投喂患白斑症病毒病的虾组织人工感染日本对虾稚虾,每日取样,整虾冰冻切片,单克隆抗体的荧光抗体方法,原位观察病毒在虾体内的感染增殖,结果表明：感染后三天内,在感染虾的各组织器官内均未观察到明显的病毒感染的阳性细胞,每四天首先在鳃丝腔内的小量血细胞观察到病毒感染;第五天除血细胞外同时在血窦,鳃上皮组织,皮下组织内观察到,第六天进而在心脏,胃上皮组织内观察到：第七天进一步又在淋巴器官,中肠内观察到,八     

Recent insights into host–pathogen interaction in white spot syndrome virus infected penaeid shrimp

Viral disease outbreaks are a major concern impeding the development of the shrimp aquaculture industry. The viral disease due to white spot syndrome virus (WSSV) observed in early 1990s still continues unabated affecting the shrimp farms and cause huge economic loss to the shrimp aquaculture industry. In the absence of effective therapeutics to control WSSV, it is important to understand viral pathogenesis and shrimp response to WSSV at the molecular level. Identification and molecular characterization of WSSV proteins and receptors may facilitate in designing and development of novel therapeutics and antiviral drugs that may inhibit viral replication. Investigations into host–pathogen interactions might give new insights to viral infectivity, tissue tropism and defence mechanism elicited in response to WSSV infection. However, due to the limited information on WSSV gene function and host immune response, the signalling pathways which are associated in shrimp pathogen interaction have also not been elucidated completely. In the present review, the focus is on those shrimp proteins and receptors that are potentially involved in virus infection or in the defence mechanism against WSSV. In addition, the major signalling pathways involved in the innate immune response and the role of apoptosis in host–pathogen interaction is discussed.     

高位池养殖过程凡纳滨对虾携带WSSV情况的动态变化

为了更好地预防对虾白斑综合征(WSS)的暴发,探讨该病毒病的流行规律,笔者针对养殖过程中对虾的携带WSSV情况展开调查。调查于2010年7月-2010年11月广东省汕尾市红海湾养殖场进行,从10口凡纳滨对虾高位养殖池中随机抽取6口进行跟踪采样。收集指标包括对虾生长状况、基本环境指标、浮游微藻种群结构和对虾病毒携带量等。本文重点报道利用实时定量PCR-TaqMan探针法检测6口精养池塘对虾体内WSSV的携带量变化情况,检测结果显示:①1-3号虾池苗种携带WSSV,其波动范围在1.3×103~1.7×104copy/g之间;②对虾在养殖过程中均带毒,鳃组织中的平均病毒携带量(2.3×109copy/g)多于肌肉组织中的平均病毒携带量(3.2×108copy/g),且变化趋势一致,但没有显著性差异(P>0.05);③在整个养殖过程中对虾WSSV携带量总体呈现波动上升的趋势,期间各池出现过数次高值。前期WSSV拷贝数的波动范围在1.3×103~3.0×107copy/g之间,后期上升到1.5×106~1.2×1011copy/g,使得某些池塘养殖对虾WSS暴发。调查结果说明:1)对虾携带WSSV可以进行养殖生长;2)WSSV在对虾体内的含量是变化的,且其变化存在着一定的规律性;3)这种变化规律主要体现在带毒量随着养殖时间的进行及外界水环境中某些主要因子的变化而变化,如:养殖时间越长,带毒量越高;养殖环境中某些关键环境因子的改变,如:温差较大,不良藻相转换,天气骤变等均可引起对虾体内病毒含量较大的波动。鉴此,作者提出,构建并维持良好的浮游微藻的群落结构,注意有害藻相改变时保持养殖水体环境稳定,对环境突变前后都做好应对对虾应激的措施等可以极大程度地减少WSS暴发的可能。本研究通过对WSSV的密切跟踪,旨在更好的反映其在养殖环境下的动态变化规律,以及受各种环境因子影响的情况,从而为预防对虾WSS提供依据和参考。     

Competition of infectious hypodermal and haematopoietic necrosis virus (IHHNV) with white spot syndrome virus (WSSV) for binding to shrimp cellular membrane

Infectious hypodermal and haematopoietic necrosis virus (IHHNV) and white spot syndrome virus (WSSV) are two widespread shrimp viruses. The interference of IHHNV on WSSV was the first reported case of viral interference that involved crustacean viruses and has been subsequently confirmed. However, the mechanisms underlying the induction of WSSV resistance through IHHNV infection are practically unknown. In this study, the interference mechanisms between IHHNV and WSSV were studied using a competitive ELISA. The binding of WSSV and IHHNV to cellular membrane of Litopenaeus vannamei was examined. The results suggested that there existed a mutual competition between IHHNV and WSSV for binding to receptors present on cellular membrane of L. vannamei and that the inhibitory effects of WSSV towards IHHNV were more distinct than those of IHHNV towards WSSV.     

WSSV感染对中国明对虾bantam及其候选靶基因的影响

Bantam能够调控细胞增殖、细胞凋亡等过程,影响生物的免疫过程。本研究利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术对感染WSSV的中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)肝胰腺和鳃组织内bantam表达水平进行检测,发现感染WSSV后6、12、24和48 h,中国明对虾肝胰腺中的bantam表达水平分别是对照组的(0.16±0.03)(P<0.05)、(0.63±0.26)、(0.32±0.06)(P<0.05)和(0.41±0.13)倍;中国明对虾鳃中的bantam表达水平分别是对照组的(0.30±0.17)(P<0.05)、(1.88±0.26)(P<0.01)、(0.84±0.36)和(0.51±0.25)倍。利用miRanda软件进一步对中国明对虾bantam靶基因进行预测分析,评分最高的靶基因是泛素缀合酶E2。中国明对虾泛素缀合酶E2包含UBCc功能域。多序列比对显示,UBCc功能域氨基酸残基序列在不同物种间保守性较高。进化树分析显示,分类学地位相近的物种的泛素缀合酶E2聚为一类。qRT-PCR检测感染WSSV的中国明对虾肝胰腺和鳃中的泛素缀合酶E2表达水平,结果显示,在感染WSSV后6、12、24和48 h,中国明对虾肝胰腺中泛素缀合酶E2的表达水平分别是对照组的(0.54±0.10)、(1.19±0.62)、(3.69±0.51) (P<0.01)和(1.94±0.07)(P<0.05)倍;中国明对虾鳃中泛素缀合酶E2的表达水平分别是对照组的(0.22±0.05)、(1.34±0.38)、(4.29±0.52)(P<0.01)和(1.28±0.79)倍。研究表明,bantam和泛素缀合酶E2的表达都受WSSV侵染的影响,可能与中国明对虾和WSSV之间的互作相关。但bantam和泛素缀合酶E2表达水平的变化是对虾抵抗WSSV侵染过程的免疫反应,还是宿主基因被病毒胁迫后的结果,需要进一步验证。