ITS、卵巢保存温度及所处性周期对黄牛卵母细胞和孤雌胚体外发育的影响

研究了ITS、卵巢保存温度及所处性周期阶段对黄牛卵母细胞体外成熟和孤雌胚体外发育的影响.结果表明,在成熟液中添加10μL·mL-1,的ITS对黄牛卵母细胞体外成熟率和卵裂率影响不大,但可以提高卵母细胞孤雌激活后的囊胚发育率(41.67%/32.00%);牛卵巢从采集到送达实验室保存在30～39%的灭菌生理盐水中可以获得较高的成熟率和囊胚发育率(71.34%/41.84%);黄体期无黄体组与有黄体组均低于卵泡期卵母细胞的体外成熟率、卵裂率和囊胚发育率,但差异不显著(P>0.05).     

绵羊卵母细胞体外受精培养体系的建立与优化

本试验对影响绵羊体外成熟和受精的因素进行了比较分析,以期建立并优化这一培养发育体系。从呼市屠宰场采集绵羊卵巢,抽吸卵巢表面2~6mm的卵泡卵母细胞,在体外进行成熟培养;成熟后的卵母细胞,与处理后的附睾精子共同培养进行受精。结果表明,添加10%~15%ESS,10μg/mL FSH,20μg/mL LH,1.5μg/mL 17-βE2,100IU青霉素,100 IU链霉素的TCM-199成熟培养液能较好地促进绵羊卵母细胞体外成熟。绵羊卵母细胞体外成熟培养22-24h,用附睾精液进行体外受精,用Sofaa,10%FBS Sofaa高糖组合或CM,BM组合的发育液培养,置于38.5℃、三气(5%CO2、5%O2、90%N2)、饱和湿度的条件下,可获得较高的卵裂率76.0%和囊胚率(31.1%)。     

猪卵母细胞体外成熟和孤雌激活效率影响因素分析

 研究了月龄和卵巢采集后的保存条件对猪卵母细胞体外成熟和孤雌激活效率的影响 ,以确立猪卵母细胞体外成熟的最佳条件。试验包括 :(1)卵巢保存的生理盐水温度 (2 2、30、37、38.5、4 0℃ )对猪卵母细胞体外成熟和发育潜力的影响。 (2 )卵巢保存时间对猪卵母细胞体外成熟和后期发育的影响。 (3)初情期前后母猪卵母细胞对体外成熟和发育潜力的影响。结果表明 ,(1) 38.5℃保存的卵巢卵母细胞激活后的卵裂率 (79.6 4 % )和囊胚率(18.11% ) ,37℃的卵裂率 (76 .18% )和囊胚     

HA对牛卵母细胞体外成熟和早期胚胎体外发育影响的研究

在TCM-199中添加一些确定的辅助成分,探讨在无血清培养基中添加不同浓度HA对牛卵母细胞体外成熟及早期胚胎体外发育的影响。结果表明,在卵母细胞成熟培养液(TCM-199-m)中添加4.0mg/mL的HA时,卵母细胞的成熟率和卵裂率与对照组(BSA)无显著差异(P>0.05),分别为85.14%,83.57%和89.47%,85.24%,但显著高于其他各浓度组(P<0.05),表明HA在卵母细胞无血清成熟培养中可代替BSA。在受精卵体外培养液(TCM-199-c)中添加HA时,囊胚发育率与对照组(BSA)差异不显著(P>0.05),分别为27.64%和26.51%,但显著高于TCM-199-c组(P<0.05),表明HA对牛胚胎体外发育具有明显的促进作用,在无血清培养中可以代替BSA。当在TCM-199-c+HA中添加少量的BSA时,囊胚发育率(31.19%)显著高于其他各组(P<0.05),表明HA欲完全代替BSA还有不完善之处,有待进一步研究。     

屠宰山羊卵巢有腔卵母细胞体外培养

以屠宰奶山羊的新鲜卵巢为材料,利用抽吸法和切割冲卵法相结合,回收可培养卵丘-卵母细胞复合体(COC),回收率为1 43个/卵巢。将可培养COC置于M199+FBS培养液(10%)+10IU/mLFSH+20μg/mLLH培养微滴中,在5%CO2、95%空气、饱和湿度的CO2培养箱中,不同温度下培养24～26h。于38 0℃、38 5℃、39 0℃不同温度下,获得成熟率分别为82 1%,81 6%,83 3%。结果表明只要培养温度在山羊正常体温的变化范围内,则有腔卵母细胞的体外成熟率就没有明显差异。     

HMG、EGF和TGF-α对猪卵母细胞体外成熟及发育的影响

以TCM199为基础培养基,HMG(尿促性素)为激素,探讨了HMG在猪卵母细胞体外成熟(IVM)和发育中的影响;同时对EGF(表皮生长因子)和TGF-α(转化生长因子-α)单独或联合使用对猪卵母细胞IVM及发育的影响进行了研究,以确立猪卵母细胞IVM较好的培养体系。结果表明:①在猪卵母细胞IVM中分别添加0.075、0.15、0.2、0.3 IU/mL的HMG,其中添加0.2 IU/mL的HMG组卵母细胞的成熟率和激活后的卵裂率显著高于其它组,差异显著(P<0.05);②添加50 ng/mL的EGF组成熟率和卵裂率高于对照组和添加30、40、60 ng/mL组,差异显著(P<0.05);③添加15 ng/mL的TGF-α组成熟率高于对照组和添加5、40ng/mL组,有显著差异(P<0.05),激活后卵裂率添加15 ng/mL组显著高于其他组(P<0.05),当TGF-α的浓度高于15 ng/mL后对卵母细胞的成熟和激活后的卵裂没有显著的提高作用;④同时添加EGF和TGF-α组成熟率和卵裂率与对照组相比差异显著(P<0.05),但与添加50 ng/mL EGF、15 ng/mLTGF-α组相比没有明显不同(P>O.05)。可见EGF和TGF-α对猪卵母细胞的IVM和激活后的卵裂没有明显的协同作用。     

黄牛小腔卵泡卵母细胞体外受精及早期胚胎发育的影响因素

从屠宰场收集黄牛卵巢,取皮质深层卵母细胞进行体外成熟、体外受精和早期胚胎体外培养,分析影响其效果的因素。结果表明,在成熟培养液中添加促卵泡素(FSH)(10 IU/mL)、人绒毛膜促性腺激素(HCG)(20 IU/mL)和17β-雌二醇(17β-E2)(1μg/mL)对卵母细胞受精后早期胚胎发育能力有极显著的促进作用。等量牛卵泡液(BFF)与初生犊牛血清(NCS)效果差异不显著,以添加15?F为最宜。颗粒细胞与输卵管上皮细胞均能显著提高卵母细胞体外成熟受精后早期胚胎的发育率,颗粒细胞 输卵管上皮细胞对克服胚胎阻滞现象效果最显著。     

培养基的保存温度对牛卵母细胞体外受精的影响

研究了培养基保存温度对牛卵母细胞体外受精的影响。结果表明,基础培养基中激素不同添加时间对牛卵母细胞体外成熟率、牛体外受精胚胎卵裂率及囊胚率差异不显著(P0.05);提前添加激素在4℃不能长期保存,而在-20℃能长期冷冻保存,并不会对牛卵母细胞体外受精胚胎的发育产生太大的影响。     

基于均匀设计优化延边黄牛卵母细胞体外成熟及核移植后卵裂体系

［目的］应用均匀设计对延边黄牛卵母细胞体外成熟及核移植后的卵裂体系进行优化。［方法］用抽吸法回收卵母细胞,在不同条件下进行卵母细胞的体外成熟培养,然后对成熟卵母细胞进行核移植、融合、激活以及胚胎的体外培养。比较了在不同的卵巢保存温度、成熟培养时间以及卵泡直径大小对牛卵母细胞体外成熟率及卵裂率的影响。［结果］延边黄牛卵母细胞体外成熟的最佳条件为在卵巢保存温度为26或31℃的条件下,选取直径为8.0mm的卵母细胞成熟培养24h;卵母细胞核移植后卵裂的最佳条件为在卵巢保存温度为26℃的条件下,选取直径为6.0或8.0mm的卵母细胞培养24h。［结论］该结果对延边黄牛或其他种黄牛的育种及种群扩繁具有一定的参考意义。     

牛卵巢的保存与卵巢内卵母细胞采集的研究

利用屠宰牛的卵巢,研究了卵巢内(Interior Ovary,IO)卵母细胞的回收方法与影响IO卵母细胞回收数量的因素,以及卵巢保存方法对卵母细胞体外受精后卵裂率与体外发育能力的影响.结果表明抽吸采取表面卵泡卵母细胞以后,用间隔1.6 mm的4个刀片平行排列构成的切割刀,纵横切割秦川牛卵泡期卵巢,其卵母细胞回收数量最高.两次回收平均每个卵巢可获得26.45个A、B级可用卵,较单纯抽吸采卵(5.15个)提高了约4倍.刀距增宽或缩小都会降低卵母细胞的回收数量.牛品种不同对IO卵母细胞的回收数量有显著影响,以中国荷斯坦牛最多(34.25个/卵巢),秦川牛次之(21.75个/卵巢),山丹牛最少(8.25个/卵巢).牛繁殖状态不同对IO卵母细胞的回收数量有显著影响,以卵泡期最多(21.75个/卵巢),黄体期和妊娠期次之(分别为11.75、10.75个/卵巢),老龄退化期最少(4.25个/卵巢).回收的IO卵母细胞直径和透明带外径分别达(126.9±9.98) μm和(151.85±10.39) μm,均较表面卵母细胞(分别为136.05±6.09 μm和160.80 μm±4.23 μm)要小的多(P＜0.01).卵巢保存温度25～29℃与30～37℃对IO卵母细胞体外受精后卵裂率与6～8细胞胚发育率无显著影响(P＞0.05),但保存时间则有显著影响,超过6 h会显著降低卵裂率和6～8细胞胚发育率(P＜0.05).     

Effects of Ages of Donors and Conditions of Preserving Ovaries on Porcine Oocytes Maturation in vitro and Efficiency of Parthenogenetic Activation

Effects of different ages of donors and different conditions of preserving ovaries on porcine oocytes maturation in vitro and efficiency of parthenogenetic activation were studied. The experiments included: 1) effects of different temperatures (22, 30, 37, 38.5and 40℃) of preserving ovaries on porcine oocytes maturation in vitro and developmental potential; 2) effects of periods of preserving ovaries on porcine oocytes maturation in vitro and development in vitro; 3) effects of different ages of donors on porcine oocytes maturation in vitro and developmental potential. The results of the experiment showed:1) There were no statistical differences (p＞0.05) of the parthenogenetic cleavage rate (79.64% vs 76.18%) and blastocyst rate (18.11% vs 33.82%) between oocytes from ovaries preserved at 38.5℃ and those preserved at 37℃. When the preserving temperature was increased to 40℃, the cleavage rate (21.68%) and the blastocyst rate (0) were great significantly lower than those at 37℃(p＜0.01). The cleavage rate (80.79% vs 76.18%) and blastocyst rate (29.61% vs 33.82%) were not different between 30 and 37℃(p＞ 0.05). When the preserving temperature was decreased to 22℃, the rate of cleavage was not different,but the rate of blastocyst was significantly lower, compared with that at 37℃; 2) The cleavage and blastocyst rates of the porcine oocytes collected after slaughter 2 or 6h were not different (p＞0.05); 3) The cleavage rate of oocytes from gilts and sows after maturation was not different, but the blastocyst rate of the sow group was significantly higher than that of gilt group (p＜ 0.05). The blastocyst cell number of sows and gilt showed no difference (p＞0.05).     

催乳素和牛卵泡液对胚胎体外成熟及未成熟的牛卵母细胞的影响

对催乳素和牛卵泡液在水牛卵母细胞体外成熟中的作用进行了探讨．来自屠宰场水牛卵巢的卵母细胞和卵丘细胞复合体,在含体积分数为5％CO2的培养箱中培养24～26h,然后通过体外受精测定其受精和胚胎发育能力．实验1在成熟液中添加1．0μg/mL催乳素(PRL),卵母细胞的囊胚发育比例(12．8％)比对照组(9．1％)高但不显著．实验2添加5％牛卵泡液(BFF),卵母细胞卵裂的比例明显高于对照组,但囊胚形成率则几乎一样;添加1．0μg/mL PRL和5％ BFF组卵母细胞卵裂的比例为38．1％,而发育成囊胚阶段的卵母细胞的比例为14％．试验结果表明：添加适宜浓度的BFF和PRL能促进未成熟的水牛卵母细胞体外成熟后的胚胎发育能力．     

屠宰山羊卵母细胞的体外成熟培养

屠宰白山羊卵巢在２５～３５℃下于２～３小时运回实验室。每个卵巢获可培养卵丘细胞－卵母细胞复合体（ＣＯＣ）０４２个（１９３４５６）；可培养ＣＯＣ在Ｍ１９９＋ｈＣＧ１ＩＵｍｌ＋１７－β－雌二醇１μｇｍｌ＋牛血清白蛋白１０ｍｇｍｌ＋庆大霉素５０ＩＵｍｌ的培养微滴中于５％ＣＯ２、空气、饱和湿度或标准气（５％ＣＯ２、５％Ｏ２、９０％Ｎ２）、饱和湿度，３９℃培养２４～２６小时，卵母细胞成熟率为９０３％（１８６２０６）。成熟卵母细胞体外受精率为７１５％（１３３１８６）。结果表明此培养系统适合于屠宰白山羊卵母细胞的体外成熟培养     

重组牛生长激素对山羊卵泡卵母细胞体外成熟的影响

将３０７枚Ａ、Ｂ级卵丘－卵母细胞复合体（ＣＯＣ）分别培养于：改良ＴＣＭ１９９＋ＦＳＨ（１０μｇ／ｍｌ）＋ＬＨ（２０μｇ／ｍｌ）＋２０％ＮＣＳ（Ａ液）、Ａ液＋重组牛生长激素（ｒｂＧＨ）１５ｎｇ／ｍｌ、改良ＴＣＭ１９９＋ｈＣＧ（２０μｇ／ｍｌ）＋ｒｂＧＨ＋２０％ＮＣＳ三种培养基中，获得５３１％、６７９％和６３５％的成熟率。结果表明，ｒｂＧＨ对山羊卵泡卵母细胞的体外成熟是有益的。     

颗粒细胞对山羊卵泡卵母细胞体外成熟和体外受精的影响

试验系统研究了颗粒细胞对山羊卵泡卵母细胞体外成熟和体外受精的影响。COCs、机械裸卵和自然裸卵的体外成熟率分别为68.3%、45.6%和6.1%,组间差异显著(P<0.05),卵裂率分别为41.5%、8.1%和0,差异显著(P<0.05)。对照组和15×104个/ml、150×104个/ml颗粒细胞组卵母细胞体外成熟率分别为65.9%、60.2%和64.6%,无显著差异(P>0.05),但均显著高于1 500×104个/ml(50.0%)和1.5×108个/ml(30.3%)颗粒细胞组(P<0.05)。颗粒细胞单层共培养系统卵母细胞成熟率为75.8%,显著高于150×104个/ml颗粒细胞条件培养液组(63.4%)和M199培养液组(66.7%)(P<0.05)。颗粒细胞单层共培养系卵裂率为50.0%,显著高于150×104个/ml条件培养液组(36.7%)和M199培养液组(38.2%)(P<0.05)。     

中国黄牛卵巢卵母细胞体外成熟与体外受精的研究

自屠宰场和临时屠宰的黄牛体内取卵巢2批共25次,黄牛97头,共得可用卵巢卵母细胞657个。用TCM—199加雌激素(FSH、LH、雌二醇—17β)培养于5％CO_2与95％空气的39℃的CO_2培养箱中,使第1批成熟率达到55.04％,第2批成熟率达到61.7％。第1批受精率达到61.97％,移于兔输卵管中发育到卵裂,移于羊输卵管中发育到晚期桑桩胚和早期囊胚。第2批废卵率为38.3％;第10次的体外培养发育率为23.8％;羊输卵管培养发育率达到91％。利用肝素(0.005mg/ml)使精子获能,授精时的精子浓度为25×10~6/ml。用小滴培养法(小滴量为50μl)加盖无菌石蜡培养。结果证明中国老龄黄牛的卵巢还是有利用价值的。     

猪卵母细胞体外成熟及乙醇孤雌激活研究

探讨了不同基础培养液(mTCM-199、NCSU23)和PMSG、HCG浓度、作用时间对猪卵母细胞体外成熟的影响和乙醇及乙醇与各种化学试剂联合处理对猪体外成熟卵母细胞孤雌激活、孤雌生殖胚胎发育的影响,最终找到了优异的猪卵母细胞体外成熟培养体系,并确定了乙醇孤雌激活的适宜浓度、作用时间和与不同化学试剂联合处理的适宜组合。结果表明:优化的猪卵母细胞体外成熟培养体系为NCSU23 20 IU/mLPMSG 20IU/mL HCG 10%PFF,激素作用时间为45 h,成熟率可达70.3%±3.9%;乙醇的适宜激活浓度为8%,激活率为29.6% 2.5%;乙醇激活的适宜处理时间为10 min,激活率为32.6%±4.1%;乙醇与CB CHX联合处理的激活率最高,激活率为60.8%±3.2%,卵裂率、3-4细胞率、6-8细胞率分别为45.1%±3.0%、28.6%±3.7%、8.7%±1.2%;乙醇与CB 6-DAMP联合处理的激活率为51.7%±1.9%,卵裂率、3-4细胞率、6-8细胞率分别为41.7%±3.6%、30.3%±4.3%、9.9%±1.8%,虽然激活率、卵裂率低于乙醇与CB CHX处理组,但3-4细胞率、6-8细胞率均高于乙醇与CB CHX处理组(30.3%±4.3%对28.6%±3.7%,9.9%±1.8%对8.7%±1.2%)。因此,乙醇激活的适宜方法为:8%乙醇处理10 min,CB 6-DAMP处理7 h。     

卵泡大小及卵泡液对牛卵母细胞体外受精后发育的影响

 以屠宰场牛卵巢为材料，研究了卵泡大小和卵泡液对牛卵母细胞体外成熟、受精和培养后发育潜力的影响。试验1：按照卵泡大小将卵丘卵母细胞复合体（COCs）分为4个试验组：＞8 mm组、2～8 mm组、腔前卵泡（PF）卵母细胞组和混合（将前3种卵母细胞混合）组。结果表明，卵泡大小直接影响卵母细胞受精后的发育，同时，源自不同大小卵泡的卵母细胞混合培养，可以促进未成熟的腔前卵泡内卵母细胞的发育。试验2：将源自优势卵泡（＞8 mm）、小卵泡（2～8 mm）和混合（所有卵泡液混合）的牛卵泡液（BFF），按照10%添加到成熟培养液中，3个试验组的卵裂率和囊胚率均高于没有添加BFF的对照组(P<0.05)，但添加10%的优势卵泡液使卵母细胞和胚胎发生粘连，易于造成丢失。试验3：与未添加BFF的对照组相比，成熟培养液中分别加入10%、20%和40%的混合BFF，均可明显促进卵母细胞受精后的发育(P<0.05)，但20%组和40%组出现卵母细胞及胚胎粘连。因此，成熟培养液中添加10%的混合BFF较为适宜。