马立克氏病病毒(MDV)糖蛋白gB在重组鸡痘病毒中的表达

将马立克氏病病毒gB基因用EcoR I从质粒pUR-MDVEgB中切下。两端补平后，插入到质粒pEFgpt12s的Pst I酶切位点。构建了含有完整的MDVgB基因的转移载体pEFgpt12s-gB。这个载体的特点是，它含有两个启动子，在强的复合启动子Spromoter的下游是插入的gB基因，另一个反向启动子vvP7.5的下游 是标记基因Ecogpt，它的两端是FPV的非必需区。携带gB基因的质粒pEFgpt12s-gB通过磷酸钙的方法转染用282e4株FPV感染3-4h的鸡胚成纤维细胞。通过药物筛选 ，得到含有gB基因的重组病毒。通过PCR、免疫荧光检测，证实了重组病毒中含有gB基因，并且gB糖蛋白也得到了表达。     

马立克氏病病毒gB基因的克隆及理组鸡痘病毒的构建

通过PCR方法扩增了马立克氏病病毒（MDV）2.8kbgB基因，并且在其两端加上PstⅠ和NotⅠ位点。然后用PstⅠ/NotⅠ酶切回收gB片段，插入到转移载体pEFgpt12s复合启动子Spromoter的下游的PstⅠ/NotⅠ酶切位点处，构建了转移质粒pEFgpt12s-gB。将该质粒与鸡痘病毒（FPV）野毒282E4株共转染鸡胚成纤维细胞（CEF），通过MXHAT选择培养基进行筛选，蚀斑纯化，经PCR扩增证实重组病毒中含有gB基因。重组病毒和FPV野毒在CEF上形成空斑大小无明显差别，病毒效价分别为10^-5.43TCDID50/mL和10^-6TCID50/mL，表明外源基因的插入不影响所构建的重组病毒的生物学特性。     

表达MDV—gB基因的重组鸡痘病毒免疫效果观察

将马立克氏病病毒（MDV）gB基因插入鸡痘病毒中，构建了含有MDV－gB基因的重组鸡痘病毒（rFPV)，用rFPV、火鸡疱疹病毒（HVT）冻干疫苗、rFPV HVT二联疫苗分别免疫1日龄AA肉用雏鸡，8日龄攻毒后观察免疫保护效果。结果表明，3种疫苗均诱导了免疫应答，免疫保护率分别为69％、69％和85％。该重组病毒疫苗的免疫效果与HVT疫苗的免疫效果相当，二者联用具有免疫协同作用。     

表达鸡马立克氏病病毒糖蛋白B基因重组鸡痘病毒毒种的纯净性检验及冻干疫苗的保存期测定

为了检测高效表达鸡马立克氏病病毒gB基因的重组鸡痘病毒(rFPV-gB/R)的纯净性,对纯化后的0代重组病毒毒种进行了细菌和支原体检验;并对中间试制的冻干疫苗在-20℃保存期进行了测定。结果表明,重组病毒毒种高度纯净,没有污染任何细菌或支原体,符合新制品制造和检验规程申报的要求;中试冻干疫苗在-20℃保存了12个月,病毒含量始终大于109PFU/mL,疫苗保存期可达12个月。     

表达鸡马立克氏病病毒糖蛋白B基因重组鸡痘病毒毒种的纯净性检验及中试冻干疫苗的保存期测定

为了检测高效表达鸡马立克氏病病毒gB基因的重组鸡痘病毒（rFPV-gB/R）的纯净性,对纯化后的0代重组病毒毒种进行了细菌和支原体检验;并对中间试制的冻干疫苗在-20℃保存期进行了测定。结果表明,重组病毒毒种高度纯净,没有污染任何细菌或支原体,符合新制品制造和检验规程申报的要求;中试冻干疫苗在-20℃保存了12个月,病毒含量始终大于109PFU/mL,疫苗保存期可达12个月。     

表达马立克氏病病毒CV1988／Rispens糖蛋白B重组鸡痘病毒的免？…

用表达马立克氏病病毒（ＭＤＶ（Ｉ型疫苗株ＣＶ１９８８／Ｒｉｓｐｅｎｓ糖蛋白Ｂ（ｇＢ）基因的重组鸡痘病毒（ｒＦ－ＰＶ－ｇＢ／Ｒ）和鸡痘病毒（ＦＰＶ）疫苗株２８２Ｅ４免疫１日龄不同品种的鸡,来评价２种病毒株的安全性及免疫母源抗体的商品是我毒性,而对无毒源抗体的ＳＰＦ鸡的毒性则不同。斑点杂交和Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交产,ｆＦＰＶ－ｇＢ／Ｒ中无氨苄青霉素的抗性基因。     

表达鸡马立克氏病病毒gB基因的重组鸡痘病毒与火鸡疱疹病毒二价冻干疫苗的免疫效力

对高效表达鸡马立克氏病(MD)血清型疫苗毒株CVI998/Rispens gB基因的重组鸡痘病毒(rFPV-gB/R)和火鸡疱疹病毒(HVT)组成MD二价冻干疫苗时2种病毒的最适剂量配比进行了研究。试验表明,以对MD易感、MD和鸡痘病毒(FPV)抗体阴性SPF鸡为试验动物进行的试验中,不同免疫剂量的rFPV-gB/R(1×106、1×105、1×104PFU)同HVT组成的二价苗产生的免疫效力相当;以对MD易感、MD和FPV抗体阳性的狼山鸡进行的试验中,不同免疫剂量的rFPV-gB/R同HVT组成的二价苗产生的免疫力随rFPV-gB/R免疫剂量的降低而降低;所有的rFPV-gB/R+HVT的二价苗组均有一定的免疫保护作用。     

表达鸡传染性喉气管炎病毒gB基因的重组鸡痘病毒rFPV-ILTVgB的理化特性及遗传稳定性研究

为检测各理化因子对表达鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV)gB基因的重组鸡痘病毒rFPV-ILTVgB的影响,并探究其在体内体外的遗传稳定性,本研究将rFPV-ILTVgB经热、酸、碱、氯仿、乙醚和胰酶分别处理后,接种于鸡胚成纤维细胞(CEF)中,测定病毒的半数感染量(TC1D50),结果显示:rFPV-ILTVgB经55...     

表达马立克氏病病毒CV1988／Rispens株糖蛋白B基因的重组鸡痘病毒疫苗的免疫保护研究

用鸡痘病毒载体表达马立克氏病病毒（MDV）糖蛋白B（gB)基因构建成重组鸡痘病毒（rF-PV)。以MDV GA或Md5和RBIB混合攻毒，在不同品种的鸡中评价rFPV-gB/R单价苗和与火鸡疱疹病毒（HVT）组成的二价苗的免疫保护效力。试验结果表明，MDV疫苗和FPV母源抗体阴性的SPF鸡和母源抗体阳性的商品鸡中，rFDV-gB/R均能提供免疫保护作用，且其中一种商品蛋鸡中rFPV-gB/R与HVT液氮苗或HVT冻干苗结合使用，均有显著的免疫协同保护作用。免疫学研究指出，rFPV-gB/R与常规疫苗一样，可显著地降低疫苗免疫攻毒鸡的病毒血症和羽囊排毒。     

表达新城疫病毒F基因重组鸡痘病毒的遗传稳定性

本实验为了评价表达新城疫病毒F基因重组鸡痘病毒（rFPV282E4-SF，rFPV Lp-SF）的遗传稳定性，将其在鸡胚成纤维细胞连续培养20代。通过蓝斑来鉴定重组鸡痘病毒纯度，结果所有蚀斑100％变蓝。通过对第0、10和20代F基因扩增并进行序列测定，所有碱基和氨基酸序列均和原始转移载体序列完全一致，没有发生任何改变。随后又通过间接免疫荧光证实rFPV282E4-FS和rFPV LP-FS各个代次F基因的特异表达。所有结果均显示了上述重组鸡痘病毒：艮有良好的遗传稳定性，满足兽医生物制品的遗传稳定性要求。     

表达传染性支气管炎病毒S1基因重组鸡痘病毒的构建

将鸡传染性支气管炎病毒S1基因插入到鸡痘病毒转移载体pSY681中，获得重组转移载体pSY681。将pSY681-IBVS1转染已感染亲本鸡痘病毒S-FPV-017株的鸡胚成纤维细胞，使其在鸡胚成纤维细胞内与鸡痘病毒基因组发生同源重组，产生表达鸡IBVS1蛋白的重组鸡痘病毒rFPV-IBVS1。在含有X-gal的营养琼脂培养基上进行蓝斑筛选且进一步纯化14代。S1基因的PCR检测表明，获得的含传染性支气管炎病毒S1基因的重组鸡痘病毒能够稳定遗传，间接免疫荧光和Western blot等试验证实该重组病毒在CEF内真实地表达了分子量约为90Ku的具有免疫学活性的IBV S1糖蛋白。     

表达NDV HN基因的重组鸡痘病毒的部分生物学特性研究

为了评价转基因对鸡痘病毒(FPV)生物学特性的影响,通过电镜观察表达新城疫病毒(NDV)血凝素-神经氨酸酶蛋白(HN)基因重组鸡痘病毒(rFPV-12LSHN)感染的鸡胚成纤维细胞(CEF).结果表明:在FPV中插入NDV HN基因后,不改变rFPV的形态、病毒成熟过程;rFPV-12LSHN与FPV在CEF上的产量无...     

鸡新城疫重组鸡痘病毒活疫苗的免疫持续期和加强免疫研究

本研究旨在评价表达新城疫病毒（NDV）血凝素-神经氨酸酶（HN）基因的重组鸡痘病毒（rFPV-12LSHN）活疫苗的免疫持续期和加强免疫对疫苗免疫效力的影响。用rFPV-12LSHN活疫苗免疫14日龄SPF鸡,103PFU/羽,7d即可检测到NDV HI抗体应答,对NDV强毒F48E8株攻毒保护率达100%。一次免疫18周后,对NDV强毒攻击依然提供完全保护。鸡痘病毒（FPV）疫苗免疫4周,再接种rFPV-12LSHN活疫苗,攻毒保护率降低至50%。相反,rFPV-12LSHN免疫4周,随后二次免疫可显著提高对NDV的体液免疫应答水平（P〈0.01）,对NDV强毒攻击的保护率仍然为100%。结果表明,表达NDV HN基因的重组鸡痘病毒（rFPV-12LSHN）活疫苗,能够快速建立坚强免疫力,免疫持续期至少可达18周,rFPV-12LSHN的二次免疫可以提高疫苗的免疫力。     

共表达鸡IL-6和H5亚型禽流感病毒HA基因重组鸡痘病毒的遗传稳定性研究

为评价共表达鸡IL-6和H5亚型禽流感病毒HA基因重组鸡痘病毒(rFPV-AH5AIL6)的遗传稳定性,本研究将其接种CEF,绘制生长曲线.结果显示,该重组病毒与亲本病毒的生长速度及蚀斑大小一致;在CEF 连续培养20代,取第0代、5代、10代、20代重组病毒PCR扩增HA和Ⅱ-6基因进行鉴定,显示HA基因无核苷酸突变,IL-6基因在第20代时有1个氨基酸发生突变,但不影响该蛋白的功能区;间接免疫荧光试验证明所选代次病毒均能够表达HA蛋白,RT-PCR试验表明各代次病毒均可以表达鸡IL-6基因;通过蓝斑鉴定重组病毒纯度,结果显示所有蚀斑均为蓝斑.因此,该重组鸡痘病毒具有良好的遗传稳定性,符合兽医生物制品的生产要求.     

表达传染性喉气管炎病毒gB基因重组鸡痘病毒疫苗免疫持续期试验

将200003批疫苗免疫4周龄SPF鸡,免疫后的7、14、21、30、60、90、120、150、180和225 d分别采血,分离血清,采用ELISA方法检测血清抗FPV抗体,结果表明重组疫苗免疫后14 d,免疫鸡血清抗体已经全部阳转,免疫后的21 d血清抗FPV的抗体出现峰值,此后便开始下降,到免疫后的6个月抗体水平已经接近阴性对照的水平.用ILTV WG株和FPV 102株强毒进行的攻毒保护试验与血清检测的结果基本一致,在免疫后的5个月内可以使免疫鸡获得100%(10/10)保护,免疫后的6个月对ILT和FP的免疫保护分别为1/7和2/10,此时需要对鸡群实施二次免疫.其他5批疫苗(200001、200002、200101、200102和200103)免疫SPF鸡后5个月用ILTV WG株和FPV 102株攻击也获得了完全保护.     

鸡马立克氏病基因工程二价苗重组病毒分子生物学特性鉴定

用磷酸钙沉淀法将MD Ⅰ型病毒gB基因插入到HVT病毒载体中制成MD重组病毒DNA，再将重组DNA转染于鸡胚成纤维细胞上，形成的病毒蚀斑与HVT病毒蚀斑形态相似，经复制2～3代后，提纯病毒DNA，PCR扩增后电泳分析，凝胶上形成一条2．9kb左右的条带。将重组病毒负染后电镜观察，病毒粒子形态与HVT病毒相似，再将重组病毒的DNA进行测序，结果表明，gB基因已经重组在二价病毒中，并能够稳定遗传。     

应用双重实时荧光定量PCR方法检测鸡马立克氏病血清1型病毒

本研究建立了鸡马立克氏病血清1型病毒（MDV1）绝对定量检测方法。研究中选择MDV1特有的Meq基因的一段保守序列作为检测对象，将其克隆到质粒载体中，作为阳性标准品；同时将管家基因．鸡卵铁转蛋白（Ovo）特异性基因片段克隆到质粒载体上作为内参照的标准品。经荧光定量PCR（FQ-PCR）法扩增获得MDV1的FQ-PCR两条标准曲线，建立了MDV1双重FQ-PCR检测方法。应用该方法绝对定量检测了实验攻毒鸡及吉林省某地发病鸡只的羽髓、淋巴细胞等组织样本中单位细胞病毒拷贝数，并与琼脂扩散（AGP）、常规PCR等检测方法进行比较。结果表明，不论实验攻毒鸡还是自然发病鸡，羽髓中病毒富含量均高于其它组织，每百万宿主细胞内病毒含量为10^7～10^8拷贝；FQ-PCR检测MD发病鸡只的阳性率高于AGP，达100％；该方法的灵敏度比常规PCR检测高10～100倍，在单位细胞内可灵敏地检测到2．78个拷贝的病毒。该方法可以在不同的样品中有效的绝对定量检测MDVl。     

禽痘病毒感染对禽流感重组禽痘病毒疫苗免疫效力的影响

表达禽流感病毒 (AIV)HA和NA基因的重组禽痘病毒rFPV_HA_NA能够诱导鸡体产生 10 0 %抵抗高致病性禽流感病毒 (HPAIV)H5N1的攻击。而当鸡群已进行禽痘疫苗免疫或者感染了禽痘病毒的情况下 ,此重组疫苗的免疫效力如何 ?首先用禽痘病毒S_FPV_0 17人工感染SPF试验鸡 ,既而在感染后的不同间隔时间接种重组疫苗 ,免疫后检测鸡群的HI抗体水平 ,同时用 10 0LD50 的HPAIVH5N1进行攻击。结果重组疫苗免疫与禽痘病毒人工感染时间间隔在 4周 (或以上 )时 ,预先感染禽痘病毒对重组疫苗的免疫效力不构成影响 ,对禽流感的保护力为 10 0 % ,而间隔时间在 1、2、3周时 ,重组疫苗的免疫保护效力则受到不同程度的影响。