板栗CmWRKY基因的克隆、序列分析与原核表达

为深入研究板栗WRKY转录因子基因在板栗抗病过程中的分子作用机制,根据板栗转录组数据库分析获得EST序列,利用RT-PCR技术,克隆板栗WRKY转录因子cDNA(CmWRKY)序列,分析CmWRKY基因及其编码蛋白的相关信息并进行原核表达研究。结果表明,CmWRKY基因为1 437 bp,编码479个氨基酸,推测蛋白分子质量为52. 128 96 ku,理论等电点为9. 15,具有2个WRKY保守结构域和2个C2H_2锌指结构域,属于WRKY家族的第Ⅰ组,基因登录号为KY312850. 1。CmWRKY核苷酸序列与巴旦木等植物的WRKY基因一致性均在80%以上,与西班牙栓皮栎WRKY基因一致性最高,达到97%。同源建模表明,CmWRKY蛋白三级结构与拟南芥At WRKY1蛋白结构相似,推测其可能与At WRKY1具有相似的调控功能。分子进化分析显示,板栗CmWRKY与西班牙栓皮栎及核桃WRKY蛋白亲缘关系最近。SDS-PAGE蛋白电泳分析表明,CmWRKY蛋白最佳诱导表达条件为0. 2 mmol/L IPTG在30℃下诱导10 h,蛋白分子质量为56 ku,其主要以可溶性蛋白的形式存在。为板栗CmWRKY基因的生物学功能研究及应用奠定基础。     

玉米丝氨酸羧肽酶基因(ZmSCP)的克隆及表达分析

丝氨酸羧肽酶(serine carboxypeptidases, SCP)基因在植物生长发育及抗病性方面起着重要作用。本研究在立枯丝核菌胁迫24 h后, 以RT-PCR技术和RACE技术克隆玉米丝氨酸羧肽酶基因全长cDNA序列, 命名为ZmSCP。结果显示, 该基因全长为1874 bp (GenBank登录号为JF682634), 开放阅读框为999 bp, 编码332个氨基酸, 相对分子量为36.505 kD, 等电点为4.75。ZmSCP基因编码蛋白与其他高等植物中该蛋白具有一定的同源性, 同源性比例范围为42%~81%。进化树分析表明ZmSCP基因与水稻、高粱亲缘关系较近, 属于同一进化分支。ZmSCP基因编码蛋白序列保守结构域分析显示该基因编码产物具有S10结构域, 属于S10超家族。半定量RT-PCR与实时荧光定量PCR结果表明, ZmSCP基因在立枯丝核菌、ABA、JA、低温、高盐胁迫条件下, 总体均呈诱导表达的趋势。其中, 在立枯丝核菌AG1-IA诱导下, ZmSCP基因表达呈两步诱导趋势, 第1次诱导出现在接菌后24 h, 然后下降, 第2次诱导出现在接菌后60 h。在ABA、JA、低温和盐胁迫下, ZmSCP基因表达均呈现上调趋势, 表达高峰均出现在胁迫后48 h。     

阳春砂WRKY40的克隆、分析及原核表达

转录因子可有效调控植物次生代谢产物的生物合成,本研究从姜科药用植物阳春砂(Amomum villosum Lour.)中克隆获得两个WRKY转录因子基因,命名为AvWRKY 40-1和AvWRKY 40-2。两个基因的编码框分别为852 bp和885 bp,分别编码283和294个氨基酸。Av WRKY 40-1和Av WRKY 40-2编码的蛋白序列一致性为75%,在GenBank中均比对上拟南芥的WRKY 40,且均含有WRKY转录因子家族所共有的WRKKYGQK七肽序列及CX5CX23HNH锌指结构域。系统发育进化树表明:Av WRKY 40-1和Av WRKY 40-2与菠萝(Ananas comosus)的AcWRKY 71亲缘关系最近,且与单子叶植物的WRKY聚为一支。两个基因在阳春砂果皮和种子团中的表达有差异,并且与阳春砂转录组中筛选出来的萜类合酶基因表达相关性也存在差异,AvWRKY 40-1表现出与萜类合酶基因更高的相关性。成功构建了两个基因的重组表达载体pDEST 17-Av WRKY 40-1和pDEST 17-Av WRKY 40-2,经诱导表达得到其融合蛋白。本研究首次克隆阳春砂的WRKY类转录因子基因并获得其融合蛋白,为后续Av WRKY 40-1和Av WRKY 40-2的功能鉴定及其对萜类的代谢调控研究提供基础。     

毛果杨半胱氨酸蛋白酶基因PtCP3的基因克隆和原核表达分析

为研究毛果杨半胱氨酸蛋白酶基因PtCP3的酶学特征和生理功能,本实验对PtCP3进行了基因克隆和原核表达分析。从毛果杨(Populus trichocarpa Torr.Gray)中克隆得到半胱氨酸蛋白酶基因PtCP3,将其克隆至pMD-18T载体。进一步构建原核表达载体pET30a-PtCP3,并在大肠杆菌(Escherichia coli)中成功诱导表达重组蛋白,然后通过包涵体洗涤法对目的蛋白进行纯化。测序结果表明,PtCP3基因CDS序列全长1074 bp,含有木瓜蛋白酶的保守催化位点和组织蛋白酶B的保守结构域。序列分析结果显示,半胱氨酸蛋白酶基因PtCP3编码357个氨基酸,预测N-末端含有长度为27个氨基酸残基的信号肽序列,去除信号肽后蛋白酶大小为36.515 kDa,理论等电点为7.44。SDS-PAGE电泳结果显示,可以检测到大小约为42 kDa的目的条带,并可通过包涵体洗涤法在体外得到了高表达量、单一的重组蛋白PtCP3。     

小麦谷胱甘肽S-转移酶基因的克隆及原核表达

为了进一步研究小麦谷胱甘肽-S-转移酶基因(TaGST)的功能,采用RT-PCR方法分离了小麦谷胱甘肽-S-转移酶基因(TaGST)的ORF全长c DNA,并进行了生物信息学分析。结果表明:小麦TaGST基因的ORF全长690 bp,编码229个氨基酸;TaGST蛋白分子质量为25.81 k Da,p I为5.29。系统进化分析表明,该基因编码蛋白与水稻OsGST蛋白的氨基酸同源性最高,与已知植物GST家族成员的氨基酸序列聚类分析将TaGST聚为Phi类GST。构建原核表达载体p ET32-TaGST,对TaGST基因进行原核表达,SDS-PAGE结果表明,其所表达蛋白与预期蛋白大小一致。为进一步研究该基因的特性和功能奠定了理论基础。     

籽粒苋AmA1基因的克隆、原核表达及植物表达载体构建

本文采用RT-PCR方法,从籽粒苋(Amaranthus hypochondriacus)"千穗谷1号"的幼嫩种子克隆出AmA1基因的完整开放阅读框序列(ORF),其长度为915 bp,编码305个氨基酸.经Blast同源性分析,结果表明该序列与GenBank登录的籽粒苋AmA1基因的核苷酸序列基本一致,只在起始密码子下游51 bp处由G变成C,但不影响氨基酸的编码.将该基因插入原核表达载体pET28a(+),并转化到大肠杆菌BL21中,经过IPTG诱导,能正确表达出37 kD的融合蛋白.同时构建了AmA1基因双T-DNA双标记植物表达载体PCDMAR-AmA1-dsRed2-hpt,该载体含有2个独立的T-DNA区,其中一个T-DNA区含有选择标记基因hpt和可视标记基因DsRed2(红色荧光蛋白基因),另一个T-DNA区含有由水稻胚乳特异性表达启动子pGt1驱动的AmA1基因,在AmA1基因的两侧连有两段正向重复的烟草Rb7MARs,以增强AmA1基因的表达.实验结果为下一步规模化培育稻米氨基酸组成平衡无选择标记的转基因水稻奠定了基础.     

黄瓜CsRAX2的克隆与表达分析及原核表达蛋白诱导

作为最大的转录因子家族,MYB转录因子广泛参与植物的生长发育以及对胁迫的响应与耐受。CsRAX2是黄瓜MYB转录因子家族成员之一,本研究通过同源克隆法克隆了CsRAX2全长,分析了该转录因子基因的生物信息和表达特征,在原核表达系统中诱导并纯化该蛋白。结果表明,CsRAX2全长939 bp,编码321个氨基酸,定位在3号染色体。CsRAX2蛋白定位在细胞核,与其他物种MYB的进化关系很近,是一个典型的R2R3-MYB转录因子。CsRAX2表达具有组织特异性,且低温处理显著诱导采后黄瓜CsRAX2表达,表明其可能在采后黄瓜低温反应调控中发挥作用。启动子元件分析显示,该基因启动子中含有多个环境和激素响应元件,表明非生物胁迫可能通过激素信号调控CsRAX2表达。原核表达研究表明,培养温度影响原核表达蛋白的诱导效果,降低细菌培养温度能提高上清液中融合表达蛋白产量。本研究结果为进一步研究黄瓜CsRAX2基因的生物学功能及黄瓜耐冷性机理提供了帮助。     

猪DDX21基因的克隆、序列分析及原核表达

DEAD-box解旋酶21(DEx D-box helicase 21,DDX21)是含DEAD-box的RNA解旋酶家族成员之一,不仅参与RNA的合成和加工过程,同时还参与机体的天然免疫应答,调控病毒的复制。为了研究猪DDX21基因的结构和功能,以猪肾传代细胞(PK-15)总cDNA为模板,根据GenBank公布的预测序列(XM_005657387.2)设计引物扩增猪源DDX21基因,并采用分子生物学软件将其编码的氨基酸序列进行生物信息学分析。结果显示,首次成功克隆了猪DDX21基因的cDNA序列(GenBank登录号为KX396051),其开放读码框全长为2 355 bp,编码784个氨基酸;与牛、斑马鱼、人、小鼠、大鼠和非洲爪蟾的氨基酸序列同源性分别为91.7%,57.5%,88.0%,82.3%,83.8%和48.9%;该基因编码的蛋白结构域和人、牛、小鼠、大鼠一样,其C端都具有保守的GUCT结构域;系统进化树分析表明猪DDX21与牛DDX21的亲缘关系最近。进一步构建原核表达质粒p ET28a-DDX21,经测序鉴定正确后,将其转化感受态细胞BL21(DE3),对DDX21基因进行原核表达。经SDS-PAGE分析显示重组菌可表达分子量约为90 k Da的融合蛋白,与预期相符;在IPTG诱导浓度一定的条件下,重组菌的最佳诱导时间为5 h。猪DDX21基因的克隆和原核表达,为进一步研究DDX21蛋白的结构和生物学功能奠定了基础。     

芸香草CdLEA3基因的克隆及原核表达分析

本研究以芸香草为试验材料,采用RT-PCR和RACE技术对芸香草CdLEA3基因进行了分离克隆以及原核分析,并进行了生物信息学分析与原核表达分析.结果显示,芸香草CdLEA3基因的cDNA全长为934 bp,含627 bp的最大开放阅读框,编码208个氨基酸;生物信息学分析表明,CdLEA3基因编码蛋白的分子质量预测为...     

重组人肿瘤坏死因子TNF-α的克隆与原核表达

为了构建人肿瘤坏死因子TNF-α与谷胱甘肽-S-转移酶(GST)的融合基因表达载体,并进行原核表达。以人肿瘤坏死因子TNF-α全长转录本为模板,设计特异性引物,经PCR扩增目的基因将其定向克隆到pMD-l8T simple vector中,构建重组质粒pMD-18T-TNFα。然后通过亚克隆将测序正确的TNF-α基因插入表达载体pGEX-4T-1中,筛选出阳性质粒转化宿主菌株BL21(DE3),通过温度、时间等不同条件诱导表达重组蛋白。结果表明,成功克隆到大小为702 bp的TNF-α全长cDNA序列,通过限制性酶切、PCR扩增证实pMD-18T-TNFα和pGEX-4T-1-TNFα载体已构建成功。诱导表达得到约51 kDa重组蛋白GST-TNFα。说明重组蛋白GST-TNFα的表达成功,为进一步获得纯化TNF-α,研究其生物功能、作用机理,制备抗TNF-α单克隆抗体奠定基础。     

扁桃CBF2基因的克隆及原核表达

为进一步研究扁桃CBF2 目的蛋白功能,探明CBF2 转录因子在扁桃中的抗寒分子机制,以新疆栽培扁桃(Amygdalus communis L.)‘双软’叶片为材料,通过PCR 技术从基因组DNA 中克隆CBF2 基因,命名为AcCBF2,将该基因片段连接到原核表达载体pET-32a(+)上,构建重组质粒pET-AcCBF2 并转化E. coli Rosetta(DE3)感受态细胞中进行诱导表达;生物信息学推测显示该基因的开放阅读框(ORF)为717 bp,编码238 个氨基酸,其分子量为26.59 kD,等电点为5.29。系统发育树分析结果显示,AcCBF2 基因与扁桃CBF1、光核桃和桃的亲缘关系最近。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳结果表明,该蛋白分子量约47 kD,与预期蛋白大小基本一致。AcCBF2 基因在E. coli Rosetta 中的最佳诱导条件为IPTG浓度0.2 mmol/L、诱导4 h。     

长白猪甘露聚糖结合凝集素A基因的 克隆与原核表达

从长白猪肝脏细胞中提取总RNA,通过RT-PCR法扩增pMBL-A基因,与pMD18-T载体连接进行TA克隆,得到猪甘露聚糖结合凝集素A（porcine mannan-binding lectin A,pMBL-A）基因。再亚克隆到pPROEXHTb表达载体上,构建重组表达质粒。将阳性重组表达质粒转化到大肠杆菌中诱导表达重组pMBL-A蛋白,通过SDS-PAGE检测蛋白的表达情况。结果成功扩增得到包括完整开放读码框长为875bp的全长cDNA片段,并原核表达了重组蛋白,为进一步研究该蛋白的遗传特征以及为猪遗传育种方面的研究提供依据。     

铁皮石斛DoSAMDC-like基因的克隆及原核表达

本研究从药用植物铁皮石斛中克隆得到S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶(S-adenosyl-L-methionine decarboxylase)基因(DoSAMDC-like)并进行序列分析和原核表达。SAMDC基因家族具有多个成员,本研究采用同源克隆的方法对铁皮石斛中尚未报道的新成员DoSAMDC-like基因进行克隆,并与拟南芥SAMDC基因家族成员和铁皮石斛基因组注释序列进行比对分析、蛋白质特征及原核表达等分析。基因序列分析表明,DoSAMDC-like基因编码区全长1104 bp,推测编码368个氨基酸,氨基酸序列具有SAM_decarbox超家族共同的保守结构域。多序列比对及进化树结果表明,克隆获得的DoSAMDC-like基因序列对应于基因组测序注释的XM_020825443.2序列,一致性为99.55%,与铁皮石斛SAMDC1基因一致性为80.16%。异源表达结果表明,DoSAMDC-like基因受IPTG诱导,蛋白分子量约为47 kD。DoSAMDC-like基因的克隆和原核表达,可为参与铁皮石斛多胺代谢、生物碱合成相关基因的蛋白质生化活性等研究提供了帮助。     

小麦品种“陕253”低分子量谷蛋白亚基基因的克隆及原核表达

利用LMW-GS特异引物,从强筋小麦品种陕253中克隆了1个1 498 bp的片段(GenBank登录号为FJ172533),该片段包含全长为912 bp的低分子量谷蛋白亚基的完整编码序列.经比较推导氨基酸序列的同源性,发现该基因属于Glu-D3位点编码低分子量谷蛋白亚基的基因,编码产物N-端具有LMW-m型低分子量谷蛋白亚基的典型特征,系统演化分析也支持这一结果.构建了该基因的表达载体pET32a-GluD3-S253,在宿主菌E. coll Rosetta-gami B(DE3)中经IPTG诱导表达融合蛋白.SDS-PAGE和Western blot检测表达产物,证实融合蛋白表达成功.     

猪博卡病毒NP1基因的克隆与原核表达

猪博卡病毒是近年来新发现的一种细小病毒.本研究根据其部分基因组序列(GenBank登录号GU902967-GU902971)设计了一对引物,采用PCR方法扩增出了猪博卡病毒的NP1基因,将其克隆到表达载体pET32a(+)中,构建了重组质粒pET32a-NP1,经测序鉴定正确后,将其转化感受态细胞BL21(DE3)中,...     

杜氏盐藻MAPKK激酶基因DsMAPKKK的克隆、原核表达与纯化

为了进一步研究MAPKK激酶的生理功能,利用RT-PCR技术扩增了DsMAPKKK的开放阅读框序列,并利用T4连接酶与质粒pGS21a连接,构建了原核表达载体pGS21a-DsMAPKKK。将该重组质粒导入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导成功表达了融合蛋白。经SDS-PAGE检测,融合蛋白在上清和包涵体中均存在。可溶性蛋白经过GST柱纯化,电泳分析结果表明,在68kD左右有单一的蛋白条带,说明融合蛋白得到有效纯化。蛋白印迹结果显示在68kD左右有明显的杂交条带,初步证明纯化的蛋白就是带有GST标签的MAPKK激酶。DsMAPKKK的成功表达与纯化,为深入探讨DsMAPKK激酶的性质及功能打下了坚实的基础。