松材线虫侵染对马尾松苗不同部位内生细菌菌群结构的影响

  目的  探究松材线虫Bursaphelenchus xylophilus侵染下松干、松针与根系部位内生细菌菌群的结构变化,可充分挖掘马尾松Pinus massoniana内生细菌资源。  方法  采用变性梯度凝胶电泳(DGGE)及高通量测序技术,对松材线虫侵染下3年生马尾松不同部位内生细菌的结构多样性进行分析。  结果  ①马尾松不同部位内生细菌菌群结构存在较大差异,菌群多样性从大到小依次为松干、松针、根系。②松干部位部分细菌属在侵染15 d时丰度明显增加,但苗木表面并不表现任何症状。③马尾松体内共检测到内生细菌442属,分属35门49纲110目210科。其中松干与松针部位的甲基杆菌属Methylobacterium、假平胞菌属Sphingomonas、薄层菌属Hymenobacter、泛菌属Pantoea、假单胞菌属Sphingomonas与短小杆菌属Curtobacterium在侵染过程中相对丰度变化较大。  结论  松材线虫侵染下,马尾松根部基本不受影响,但松干部位内生细菌菌群结构变化极显著,其次是松针。部分内生细菌可能对松材线虫病具有潜在生防效果,有助于后期生防菌株的挖掘。在侵染高峰期实时监测干部内生细菌菌群结构变化,有助于松材线虫病的早期诊断。图5表1参25     

松材线虫侵染后马尾松几种生化物质质量分数的变化

以2年生马尾松(Pinus massoniana)盆栽苗为研究对象，对接种松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)AMA3虫株后马尾松营养物质(可溶性蛋白、可溶性糖和总糖)、次级代谢产物(总酚和黄酮)以及有机酸(苯甲酸和水杨酸)质量分数进行测定。结果表明：接种松材线虫后，马尾松茎干可溶性蛋白的质量分数呈现先升高后降低再升高的趋势，接种松材线虫后1.0 d,可溶性蛋白的质量分数显著高于对照组(P<0.05),在4.0～10.0 d均低于对照组；马尾松茎干可溶性糖的质量分数总体上呈现较低水平；马尾松茎干总糖和总酚的质量分数均呈现先升高后降低的趋势，总糖的质量分数在0.5 d达到峰值，而总酚的质量分数在4 d达到峰值，随后下降。马尾松茎干黄酮、苯甲酸和水杨酸的质量分数总体上呈现较高水平，且在7 d达到峰值，随后下降。因此，松材线虫的侵染对松树体内营养物质、次级代谢产物及有机酸的质量分数均有影响，其中，马尾松苗茎干苯甲酸和水杨酸的质量分数对病害的早期诊断具有潜在应用价值。     

松材线虫侵染对马尾松抗氧化系统的影响

为揭示松材线虫病对马尾松抗氧化系统的影响,探讨了松材线虫侵染的马尾松针叶中的脯氨酸含量、抗氧化酶活力及相关基因表达的变化规律.结果显示:松材线虫侵染导致马尾松针叶中的脯氨酸含量显著降低,超氧化物歧化酶、铜锌超氧化物歧化酶和过氧化物酶活力显著下降,同时富含脯氨酸的阿拉伯半乳聚糖蛋白和过氧化物酶的编码基因也下调表达;随着侵染虫量的增加,过氧化物酶基因在马尾松针叶中的表达增强,而在茎干、枝条中的表达减弱,导致抗氧化酶活力下降,马尾松的抗病防御能力减弱.研究结果初步揭示了松材线虫侵染致使马尾松最终枯萎死亡过程中抗氧化系统的变化,为林业生产上制定防控松材线虫病害的相应策略提供理论基础.     

马尾松抗性家系感染松材线虫后酶活性变化研究

采用紫外分光光度计法,测定马尾松枝条木质部过氧化氢酶、苯丙氨酸解氨酶、过氧化物酶、多酚氧化酶活性并对其进行比较分析,从生理生化学角度揭示马尾松抗性家系抗松材线虫病的机制。结果表明:随着松材线虫的侵染,抗病家系的4种防御酶活性变化表现不同。其中,不同家系间过氧化氢酶活性差异均不显著;马尾松枝条接种松材线虫6 h后,组织中苯丙氨酸解氨酶活性达到最高值;过氧化物酶活性不同时间段的差异不显著,不同家系间差异极显著;在相同的时间,各马尾松抗性家系枝条中多酚氧化酶活性明显高于CK,在不同时间段,不同家系间,差异均极显著。因此,多酚氧化酶可作为马尾松抗松材线虫病早期鉴定的重要生理指标。     

马尾松响应松材线虫侵染的基因动态表达变化

松材线虫病是一种严重危害马尾松生长的流行性病害,可导致马尾松枯萎死亡。为揭示该过程中基因的表达变化行为,本研究利用荧光定量PCR技术检测了松材线虫侵染不同天数下的马尾松较其对照样本中病原识别、抗逆调节、次生代谢、解毒作用及生长素响应等相关基因的表达变化。结果显示,除了与病原识别相关的CC-NBS-LRR抗性蛋白基因的表达随侵染天数的增加而增强之外,其他基因则在侵染2d的马尾松样本中的表达水平最高,且明显高于未受侵染的对照马尾松样本,随后在侵染3天的马尾松中的表达又低于对照样本。此外,黄酮-3-羟化酶和细胞色素P450基因的表达随着侵染虫量的增加呈先上调后下调的变化方式。通过本研究初步揭示了马尾松响应松材线虫侵染的基因表达变化模式。     

松材线虫携带的一株细菌分离及其致病性

从患松材线虫病致死的黑松和马尾松病树组织及松褐天牛虫体中分离的松材线虫虫体上均分离到同一细菌菌株 .经致病性、革兰氏染色、菌体形态、培养性状和生理生化反应等测定 ,将致病菌株鉴定为洋葱伯克霍尔德氏菌 .ATBExpression自动鉴定仪的鉴定结果与上述结果相同 .在分离过程中该菌出现频率较高 ,说明是松材线虫携带的主要细菌 .人工接种试验结果显示 ,用无菌线虫或洋葱伯克霍尔德氏菌菌株分别接种的黑松无菌苗不发病 ,而用二者混合接种则使无菌苗迅速发生褐变和萎蔫 .林间利用 6年生黑松进行的接种试验结果证明 ,用无菌松材线虫和洋葱伯克霍尔德氏菌菌株混合接种的黑松与使用野生松材线虫接种的黑松都 10 0 %的患病 .单独用无菌松材线虫接种有 4株发病 ,6株没有发病 .其中发病黑松中不仅分离到了松材线虫 ,也分离到了细菌 ,而没有患病的 6株黑松中仅分离到少量松材线虫 .这说明在野外条件下接种的松材线虫可以通过某种途径重新获得细菌 ,导致了接种的黑松患病 .而接种后无菌松材线虫没能获得细菌的那些黑松就没有患病 ,说明单独无菌松材线虫不能使黑松患病 .这些结果说明松材线虫携带的细菌与松材线虫的致病性有关 .因此 ,可以把松材线虫病看作是线虫和细菌共同侵染引起的一种植物复合侵染病害 .在这     

中国日本松材线虫虫株对不同松苗的致病性及在树体内移动特点比较

为了解不同松材线虫虫株在致病性方面的差异,选用分离自日本和中国浙江的松材线虫虫株,分别接种雪松、黑松和马尾松,比较其感病情况,并在不同时期分离树体内的线虫,比较不同虫株在不同寄主体内的移动和分布情况.结果表明,2个日本虫株和1个中国虫株都能使黑松和马尾松感病和枯死,3虫株对黑松和马尾松的致病力没有明显差异;日本松材线虫虫株能使雪松枯死,枯死率在50%左右;中国松材线虫虫株不能使雪松致病,但在其体内可以分离到松材线虫.不同时期分离各寄主体内线虫发现.接种72 h前线虫数量处于调整期,接种144 h后线虫数量开始上升或下降.日本虫株接种雪松后,线虫数量呈递增趋势:中国虫株接种雪松.线虫数量在接种144h后开始下降.我国雪松不感染松材线虫病是由于线虫虫株发生了变异.     

松材线虫入侵对不同类型松林群落演替的影响

对马尾松和黑松纯林及混交林不同类型森林生态系统的植物分层情况、种类丰富度、个体数量、多样性指数、均匀度指数、生态优势度及重要值进行了调查和分析.结果表明:内陆型生境中,无论是马尾松纯林还是马尾松混交林群落,被松材线虫危害后,乔木层植物的种类及植物多样性均有较大程度的增加,原有森林群落并未向灌丛方向退化,反而比危害前生物多样性指数有较大的增加.危害后的黑松混交林群落比纯林的生物多样性指数大,种类丰富度及个体数量均增大.无论是纯林还是混交林,马尾松林乔木层植物的种类丰富度、生物多样性均大于黑松林,种类组成及空间分布更趋合理.     

坡向对北亚热带大别山区不同马尾松林型土壤细菌群落的影响

土壤细菌作为土壤微生物的重要组成部分,在土壤生态系统中发挥着重要作用,作为北亚热带区典型的森林植被类型,马尾松针阔混交林在区域地带性植被恢复方面发挥着重要作用。探讨马尾松不同森林类型土壤细菌群落的组成结构和多样性特征是维护马尾松森林生态系统健康和稳定的关键。以北亚热带大别山区4种马尾松林型[马尾松（Pinus massoniana）纯林（pure forest,PF）、马尾松—麻栎（Quercus acutissima）混交林（Pinus massoniana-Quercus acutissima mixed forest ,PQM）、马尾松—枫香（Liquidambar formosana）混交林（Pinus massoniana and Liquidambar formosana mixed forest ,PLM）和马尾松—化香（Platycarya strobilacea）混交林（Pinus massoniana-Platycarya strobilacea ,PPM）]为研究对象,分析不同坡向（阴坡和阳坡）下马尾松4种林型林地土壤细菌群落的组成及多样性变化规律,旨在为该区不同环境梯度下马尾松林的生产经营和生物多样性保护提供理论参考。结果表明：（1）马尾松4种林型林地共检测到36门107纲246目393科688属,其中土壤优势菌门为放线菌门（Actinobacteriota）、变形菌门（Proteobacteria）、酸杆菌门（Acidobacteriota）和绿弯菌门（Chloroflexi）。（2）3种马尾松针阔混交林土壤细菌丰富度和多样性在阴坡均显著高于马尾松纯林,且不同坡向变化为：阴坡>阳坡,而4种林型在阳坡差异不显著。（3）土壤含水量与土壤细菌门之间存在显著相关性,其中与细菌α多样性呈极显著正相关。综上,阳坡环境下,马尾松4种林型林地土壤细菌群落变化差异较小,相较于马尾松纯林,3种针阔混交林土壤细菌群落更易受不同坡向环境条件的变化而变化。坡向和林型变化引起的土壤含水量改变是导致北亚热带大别山区马尾松森林土壤细菌群落组成改变和多样性差异的主要因素。     

松材线虫入侵初期三峡库区马尾松林及土壤性质的变化

近些年来,松材线虫入侵对三峡库区马尾松林造成严重危害,并严重威胁着三峡库区松林资源和三峡水利枢纽工程的生态安全。以不同的马尾松林生态系统(健康、感病1年、感病3年、感病5年、感病7年)为研究对象,采用样方法和每木调查法,分析松材线虫入侵早期马尾松林群落植物群落结构和土壤理化性质的动态变化。共调查了37种乔木物种,隶属于30科33属,其中马尾松是群落内的优势树种(IV=49.63%),樟树、槲栎、栓皮栎和檵木等树种的重要值也较高,为亚优势种;与健康林地相比,感病林地内马尾松的数量显著下降,平均胸径和平均树高呈现明显增加趋势;松材线虫入侵对群落内植物不同空间结构(乔木、灌木、草本)的物种多样性影响较大,且物种多样性指数随感病年限变化规律符合“中间高度膨胀理论”;此外,不同感病年限马尾松林群落内土壤的化学性质变化不显著,但是与水分相关的物理性质变化显著。本研究明确阐明了松材线虫入侵早期,三峡库区典型马尾松林群落内植物群落结构、物种多样性指数和土壤理化性质的动态变化,旨在为改变三峡库区单一的马尾松林结构、增加群落的健康程度,从而为三峡水利枢纽工程的生态安全提供基础依据。      

松材线虫入侵对马尾松林主要种群生态位的影响

采用定量分析方法,对松材线虫不同受害阶段的马尾松群落中13个主要种群进行了生态位研究.以群落组成类型: ①马尾松＋NFDA4木＋白栎,②黑松＋马尾松＋冬青＋柃木,③马尾松＋冬青＋栀子+短柄NFDA5,④马尾松＋篌竹+NFDA4木,⑤木荷＋马尾松＋苦槠＋短柄NFDA5,⑥栓皮栎＋冬青＋杜虹花,及所建立的综合资源梯度指数（10～70）综合为一维资源位,调查6个资源位,定量测定不同受害阶段马尾松群落主要种群生态位宽度、生态位相似比例、生态位重叠,并阐述了各种群生态位的生态学意义.结果表明:由于松材线虫的入侵,加之随后的人为伐除马尾松受害木,马尾松林正朝着阔叶林和针阔混交林两个方向演替.      

不同松材线虫虫株接种雪松等寄主后的组织病理学变化

用来自日本和中国的几个松材线虫虫株,分别对黑松、马尾松和雪松进行接种,接种后分离树体内的线虫,并观察树体的组织细胞变化。研究结果表明,2个日本虫株均能使黑松、马尾松和雪松发病并枯死,而中国线虫虫株仅能够使黑松和马尾松发病枯死,不能使雪松致病。接种后不同时间分离线虫,比较线虫在寄主体内的数量消长情况。发现凡接种发病死亡的,其体内线虫数量最多;发病但没有死亡的,其体内线虫数量也较多;中国虫株接种的雪松,一直没有表现任何症状,其体内也分离到了一定数量的线虫。接种后组织病理学变化表明,细胞和组织变化与线虫的移动和扩散有关。黑松和马尾松,接种日本和中国浙江松材线虫虫株后,72 h时皮层和韧皮部的薄壁细胞变形、死亡普遍存在,树脂道泌脂细胞和木射线细胞均遭到线虫破坏。144 h后,皮层、韧皮部、木质部和髓心大量细胞死亡,形成空洞,管胞中可见线虫活动。而对于雪松,接种日本松材线虫虫株后,皮层、韧皮部和形成层细胞死亡,树脂道泌脂细胞和木射线细胞死亡,有少量代谢物聚集。中国松材线虫虫株接种后,初期皮层、韧皮部细胞变形并破坏;但是,细胞的破坏只局限在小范围内。后期皮层、韧皮部细胞被破坏,但形成层完整,木射线和管胞基本完好。     

荧光假单孢细菌培养的无细胞滤液导致松萎蔫的病状观察

将松材线虫携带的致病细菌无细胞滤液、无菌松材线虫和致病细菌混合物、致病细菌鞭毛蛋白无细胞滤液、无菌松材线虫、无菌松材线虫和非致病细菌混合物接种黑松导致的松树萎蔫的病状与野生松材线虫导致松树萎蔫的病状进行观察和对比,结果为:(1)经培养的致病荧光假单孢菌GcM5-1A菌株的无细胞滤液、无菌松材线虫和致病细菌GcM5-1A混合物接种导致的黑松的病状变化趋势与松材线虫致死的黑松病状是一致的;无菌松材线虫、无菌松材线虫和非致病细菌AM2C混合物不能使黑松发病;(2)致病细菌GcM5-1A无细胞滤液和野生松材线虫导致的黑松病状和病程天数无显著差异;(3)接种无菌松材线虫和致病细菌GcM5-1A混合物的黑松病程显著长于接种野生松材线虫的黑松.结果可以用松萎蔫病是松材线虫和其携带的细菌的复合侵染病害的假说和松材线虫与其携带的细菌之间的互惠共生关系的论点来解释,说明松材线虫携带的致病细菌无细胞滤液是松萎蔫病致病的真正原因.     

马尾松受松材线虫侵染后昆虫结构和功能变化的研究

2003年11月和2004年6、9月在浙江省舟山市马尾松纯林内选取处于松材线虫病不同侵染期的马尾松进行昆虫的种类和数量及分布位置的调查.明确了处于不同侵染期的马尾松上的昆虫的种类,计算了昆虫的优势度,划分了不同的昆虫功能团,比较了不同侵染期的马尾松上的昆虫群落的丰富度、均匀度和多样性,并对昆虫群落进行了聚类分析.结果表明:在松林中,分解性昆虫占有绝对的优势,衰弱木上的昆虫群落的丰富度、均匀度和多样性较高.而健康木上昆虫群落的丰富度、均匀度和多样性最低.可将6种侵染期的松树上的昆虫群落最终划分为3类.     

Study on Inoculation of the Bursaphdenchus xylophilus and Eats Experiment of Monochamus alternatus Hope of P/nus massonlana Lamb

通过对健康、无病的马尾松人工接种松材线虫以及在伐倒健康、元病的马尾松上进行松褐天牛蛀食性试验。结果表明：主干接种松材线虫的马尾松染病率为20％,死亡率为10％,树枝接种松材线虫的马尾松染病率为10％,无死亡情况。另外,松褐天牛蛀食性试验的伐倒木上,每只雌性松褐天牛繁殖的平均幼虫数为12．3头,皮下组织被取食破坏率平均达25．6％。     

马尾松接种松材线虫及松褐天牛蛀食性试验研究

通过对健康、无病的马尾松人工接种松材线虫以及在伐倒健康、无病的马尾松上进行松褐天牛蛀食性试验,结果表明:主干接种松材线虫的马尾松染病率为20%,死亡率为10%,树枝接种松材线虫的马尾松染病率为10%,无死亡情况。另外,松褐天牛蛀食性试验的伐倒木上,每只雌性松褐天牛繁殖的平均幼虫数为12.3头,皮下组织被取食破坏率平均达25.6%。     

松树内生细菌GD2对松材线虫入侵寄主时转录组的影响

为了进一步阐明细菌在松材线虫病中的作用,采用松材线虫(CK)和松材线虫与马尾松内生细菌GD2的混合物(T)分别接种马尾松,对松材线虫进行转录组测序、 Gene Ontology(GO)及KEGG富集分析,并利用Real-time Quantitative PCR(RT-qPCR)验证目标基因表达情况。结果显示,与对照组(空白虫)CK相比,共筛选到143个差异表达基因(differentially expressed genes, DEGs),其中有63个上调基因,80个下调基因。Gene Ontology分析显示,差异表达基因在免疫系统过程、细胞膜、代谢过程、转运活性等功能类富集。KEGG通路在ECM-receptor互作、肾素-血管紧张素、糖酵解、胰岛素信号等通路富集。这些GO功能与KEGG通路涉及机体的免疫调节。选取8个基因进行RT-qPCR验证,表达水平与测序结果一致,证明了测序结果的准确性。表明菌株GD2可以通过提高松材线虫的免疫调节能力来影响松材线虫病的发生。     

松材线虫病疫木卫生伐对马尾松纯林林分结构的影响

  目的  探讨松材线虫Bursaphelenchus xylophlius病疫木采伐对马尾松人工纯林林分结构的影响,对松材线虫病入侵后的马尾松林分的经营管理有理论和实践价值。  方法  在浙江省杭州市临安区,分别选择松材线虫病危害及周边未受害的马尾松Pinus massoniana人工纯林设置样地并进行调查。  结果  疫木卫生伐12 a后的结果表明:与马尾松纯林相比较,卫生伐之后马尾松重要值显著下降,从100.00%降至38.41%;胸径结构由正态分布变为反J型曲线;树高结构由单层林变为复层林;林木大小个体差异显著增加,两级分化显著加剧;林木分布从均匀分布变为随机分布;林木竞争压力增加,6 cm径阶林木竞争压力最大。  结论  卫生伐促使受害马尾松纯林向混交林演替的速度加快,多个林分结构指标发生了重大变化,单层马尾松同龄纯林演替为复层马尾松落叶阔叶树混交异龄林。图2表4参18     

贵州马尾松群落植物多样性与土壤酶活性

以贵州4种典型马尾松群落类型为研究对象,对不同马尾松林下植物多样性和土壤酶活性及二者之间相互关系进行研究。结果表明：(1)不同马尾松群落植被种类差异显著,其中马尾松杉木混交林植物种类最多,为23种,马尾松硬阔混交林最少,仅11种。对4个物种多样性指数的综合分析表明,灌木层物种多样性高于草本层,群落中物种多样性整体表现为马尾松杉木混交林>天然次生纯林>人工纯林>马尾松阔叶混交林;(2)不同群落间土壤理化性质差异显著,混交林土壤有机质、全氮、碱解氮和有效磷含量均高于纯林, pH值则相反,有机质和有效磷与灌木层植物多样性指数呈显著负相关(P<0.01),全钾含量与草本层植物多样性指数呈显著正相关(P<0.01);(3)不同马尾松群落土壤多酚氧化酶和酸性磷酸酶差异不显著,脲酶、β￣葡萄糖苷酶和纤维素酶活性差异显著,且与土壤全氮、碱解氮或全磷呈显著相关,这3种酶可作为不同马尾松群落类型土壤肥力状况和质量的生物学指标。     

松材线虫携带细菌在疫区和寄主中的分布及致病性研究

作者在江苏、上海、广东、安徽、湖北、浙江等疫区 ,采集了呈现松材线虫病典型症状的黑松、马尾松的病样 ,采用病木组织分离法 ,分离获得松材线虫所携带的细菌菌株 2 4株 ,经鉴定 ,2 4株细菌中 ,假单胞菌属有 11株 ,泛菌属有 6株 ,其余有不解糖消化链球菌、河生肠杆菌、乡间步丘菌和粘质沙雷菌 .由此可知 ,假单胞菌和泛菌分布较广 ,在所有采样疫区感染松材线虫病的马尾松和黑松病死木中都能分离到 ,是普遍存在病木组织中松材线虫携带的主要细菌 .致萎活性测定结果表明 :所有假单胞菌属和泛菌属的菌株对无菌黑松切根苗均有致萎活性 .用假单胞菌和泛菌分别与无菌松材线虫混合接种室内无菌黑松苗和野外多年生黑松 ,结果表明 :用细菌单独接种 ,无菌黑松苗和野外黑松均不发病 ,无菌松材线虫单独接种的无菌黑松苗和野外黑松也不发病或发病轻、慢 ,无菌线虫和致萎细菌二者混合接种能使无菌黑松苗和野外黑松发病快且严重 .由此认为松材线虫携带到寄主组织中的假单胞菌和泛菌属的一些种对松材线虫病有明显的协同作用