农杆菌介导Cry1 Ab/Ac抗虫转基因玉米植株的获得

转基因技术的迅速发展有效地打破了物种间的遗传壁垒,从而加快了优良基因定向聚合的进程,然而遗传转化率低及转基因安全问题成为制约其进一步发展的限制因素。基于此,本研究以玉米自交系H99为材料,将Ac/Ds双元表达载体(包含抗虫Cry1 Ab/Ac基因和gfp报告基因等)通过农杆菌介导法转入由110粒玉米幼胚诱导出的愈伤组织中,获得28株抗性转基因植株。经PCR及RT-PCR的验证结果显示,其中8株为含有Cry1 Ab/Ac目的基因且该基因有效表达的阳性植株,转化效率达7%。通过农杆菌介导法所获得的玉米转基因植株为今后剔除抗生素筛选标记,从而获得安全的玉米抗虫新种质提供了遗传材料。     

转Bt基因玉米残体Cry1Ab蛋白在土壤中的残留动态

采用ELISA定量法研究了(28±1)℃下转Bt基因玉米植株残体不同组织所含Cry1Ab蛋白在黄褐土和红壤中的残留动态,并对其进行方程拟合。结果表明,转Bt基因玉米植株残体不同组织释放的Cry1Ab蛋白在不同土壤中的残留动态基本一致,均呈前期快速降低和后期稳定下降2个阶段,但同一组织释放的Cry1Ab蛋白在不同土壤中的残留变化速率存在显著差异,黄褐土中下降明显快于红壤,1周内表现尤为显著;不同组织释放的Cry1Ab蛋白在同一土壤中其残留差异显著,且受培养时间等因素的影响,总体表现为根>叶>茎,与初始时Cry1Ab蛋白土壤可提取量表现基本一致;双指数模型比移动对数模型和指数模型更符合转Bt基因玉米残体中Cry1Ab蛋白在土壤中的残留动态。     

Bt毒蛋白Cry1Ab受体基因Bt-r3在大肠杆菌中的克隆和表达及特性分析

根据二化螟中肠Bt毒蛋白Cry1Ab的受体基因Bt-r3的cDNA序列设计特异引物,扩增得到编码Bt-R3蛋白胞外部分的目的片段(约4500bp).将目的基因酶切克隆到质粒载体prcHis-TOPO上,再将该质粒导入到感受态细胞TOP 10,经IPTG诱导、得到约为160 kD的表达蛋白.经Western印迹鉴定,结果表明表达产物能有效地结合Bt毒蛋白Cry1Ab,从而确认Bt-r3是Cry1Ab的受体基因.它们的结合部位位于Bt-R3蛋白的胞外结构域中.     

Cry2A基因植物表达载体构建及其转化子生长曲线的建立

根据定向克隆原则,以pCAMBIA2301为载体骨架,Cry2A基因为目的基因,构建了大小为15354 bp的植物表达载体p2AST2301。新载体带有抗虫基因Cry2A和筛选标记基因NPTⅡ,适合通过农杆菌进行遗传转化,并以抗生素G418为筛选底物。同时将新载体转化根癌农杆菌EHA105,获得了用于植物遗传转化的工程菌,并且明确了工程菌D600 nm值在1.0-1.6之间活力最强。     

转Bt基因玉米幼苗残体中Cry1Ab杀虫蛋白田间降解动态

【目的】研究间苗后留在田间地表的转Bt基因玉米幼苗残体中Cry1Ab杀虫蛋白的降解规律,比较两种Bt玉米幼苗残体中Cry1Ab杀虫蛋白的降解速度。【方法】以两种表达Cry1Ab杀虫蛋白的转Bt基因抗虫玉米MON810和Bt11为材料,采用ELISA方法测定各取样时期中幼苗残体中Cry1Ab杀虫蛋白残留量。【结果】转Bt基因玉米幼苗残体中杀虫蛋白降解是逐渐的,且降解速度较快,到50 d时幼苗残体已经完全腐烂,Bt11幼苗残体中的杀虫蛋白已经完全降解,在MON810中还能检测到微量的杀虫蛋白。两种转基因玉米幼苗残体中的Bt杀虫蛋白的初始含量差异不显著,但在同一时间段的Bt杀虫蛋白降解速度存在差异均显著,在30 d前MON810幼苗残体中Bt杀虫蛋白降解速度比Bt11降解的快,30d后,则降解趋势相反,到50 d取样结束时MON810和Bt11分别降解了初始含量的99.81%和100%。【结论】两种转Bt基因玉米间苗后留在田间的幼苗残体中的Cry1Ab杀虫蛋白降解速度不同,在50 d完全腐烂时,其中的杀虫蛋白完全降解或仅有微量残留。     

Cry1Ia和Cry2Ab融合蛋白的表达

[目的]苏云金芽孢杆菌表达的杀虫蛋白Cry1Ia和Cry2Ab对鳞翅目和鞘翅目昆虫具有较好的杀虫活性。为充分利用已有Cry蛋白,本文构建了两者的融合蛋白,并对融合蛋白的原核表达进行检测。[方法]本文将两个基因的编码基因,按照两种先后顺序拼接起来,获得cry1Ia-cry2Ab融合基因和cry2Ab-cry1Ia融合基因。另外,将Cry1Ia蛋白N端第一个α-螺旋(73个氨基酸)的编码序列删除后,接入cry2Ab基因5'端,获得第三个融合基因cry1IaD73-cry2Ab。将3个基因分别插入pHT304载体,并由cry1Ac基因的启动子和终止子调控其在Bt细胞中表达。[结果]SDS-PAGE结果显示,Cry1Ia-Cry2Ab、Cry2Ab-Cry1Ia和Cry1IaD73-Cry2Ab三个融合蛋白均能够在Bt细胞中表达,其测定分子量与预期大小一致,分别约152kDa、152kDa和144kDa。蛋白印迹法分析发现,在表达过程中,三种融合蛋白均有一定比例的降解。另外,不同温度对融合蛋白的表达也有不同程度的影响。[结论]本研究构建了3种融合杀虫基因并在Bt细胞中成功表达,为进一步解析这类融合蛋白的杀虫活性和机理奠定了基础。     

转Bt基因抗虫玉米根茬和根际土壤中Cry1Ab杀虫蛋白的田间降解动态

【目的】研究转cry1Ab杀虫蛋白基因玉米收获后玉米根茬及其根际土壤中Cry1Ab杀虫蛋白的降解动态,比较两种Bt玉米根茬和根际土壤中Cry1Ab杀虫蛋白的降解速度。【方法】以两种表达Cry1Ab杀虫蛋白的Bt抗虫玉米MON810和Bt11为材料,采用ELISA方法测定玉米收获后根茬残体和根际土壤中Cry1Ab杀虫蛋白的田间降解动态。【结果】转Bt基因玉米根茬残体和根际土壤中杀虫蛋白是逐渐降解的,Bt玉米MON810根茬中Cry1Ab杀虫蛋白含量较高,降解的速度也较慢,收获后8个月时还不能完全降解;Bt玉米Bt11根茬中Cry1Ab杀虫蛋白含量较低,降解速度比MON810根茬中Cry1Ab杀虫蛋白降解速度快,到7个月时已检测不到Cry1Ab杀虫蛋白。Bt玉米MON810根际土壤中Cry1Ab杀虫蛋白的降解较Bt11的慢,MON810和Bt11根际土壤分别在8个月和7个月时检测不到Cry1Ab杀虫蛋白。【结论】种植过Bt11和MON810抗虫玉米的田块,在第二年春播农作物已经出土时,其根茬和根际土壤中残留的Cry1Ab杀虫蛋白尚不能完全降解,还有少量残留。     

Cry1Ia和Cry2Ab杂交分子的构建和表达

同源性较低的Cry杀虫蛋白之间的结构域交换突变体成功案例很少。选择2种氨基酸同源性很低且蛋白其他特点差异也较大的Cry2Ab和Cry1Ia为亲本,将它们的3个结构域(Domain I,II和III)互换,构建6种结构域交换突变体。将这些突变体在Bt菌株中表达,分析其表达稳定性,并比较不同温度条件下的表达情况。结果显示,6种突变体在28.5,32.0℃条件下,均能够稳定表达,且表达量较高。说明构建的6种突变体在Bt菌株中具有较好的表达稳定性,以此为基础可以进一步检测其杀虫活性等特性。     

抗虫基因Cry1C转化大豆的研究

[目的]将对鳞翅目害虫具有抗性的抗虫基因Cry1C转入大豆中,获得对田间鳞翅目害虫具有抗性的大豆材料.[方法]利用农杆菌介导法将抗虫基因CrylC转入大豆品种Williams82中,并通过Bar试纸条及PCR方法对所获得的转化苗进行鉴定.[结果]获得28株阳性大豆转化植株.[结论]初步认定CryIC基因已整合到大豆基因组中.     

猪肝脏BHMT基因植物表达载体构建及玉米遗传转化

甜菜碱高半胱氨酸甲基转移酶(BHMT)是一种甲基代谢酶,在动物和微生物体内存在,能催化甜菜碱向高半胱氨酸转移甲基,促进甲硫氨酸形成。本试验通过RT-PCR扩增猪肝脏BHMT基因ORF的cDNA序列,成功构建了p3301-BHMT植物表达载体,并利用农杆菌介导法转化玉米萌动胚,经PPT筛选和PCR检测,初步确定获得4株抗性植株。试验结果将为研究BHMT基因在植物中的作用,提高玉米甲硫氨酸含量和抗逆性提供试验材料。     

Cry1 Ac基因组织特异表达载体构建及水稻遗传转化

为了提高转基因抗虫水稻的生物安全性,构建了由组织特异性启动子序列RSP1、RSP2及组成型启动子35S带动Bt基因Cry1Ac的双元载体pCAM RSP1 Cry1A(c)、pCAM RSP2 Cry1A(c)及pCAM 35S Cry1A(c),并通过农杆菌EHA105介导对两个水稻品种"秀水11"和"秀水63"进行了遗传转化。"秀水11"和"秀水63"的平均转化率分别为72 9%和83 2%,经抗性愈伤组织的分化培养两个品种分别获得346和448株再生植株,其中PCR检测阳性株数分别为295和414。     

玉米蛋白激酶基因ZmASK1表达载体的构建及遗传转化

为了研究玉米蛋白激酶基因ZmASK1的功能,把ZmASK1的cDNA连接到植物表达栽体pGreen0029中,通过农杆菌介导转入拟南芥中进行过量表达.PCR和Western-blot分析表明,ZmASK1已经转入到拟南芥中,并且在大多数转化植株中稳定表达.通过本试验,为以后对ZmASK1的功能验证工作打下基础.     

玉米ZmCPK12基因真核表达载体的构建及转化

[目的]CDPK是一类依赖于Ca2+而不依赖CaM及磷脂的蛋白激酶,或类钙调素结构域的蛋白激酶,是植物和低等动物所特有.研究为玉米CDPK基因家族在抗逆中的作用提供基础.[方法]构建玉米ZmCPK12基因真核表达载体是了解玉米中该基因功能的重要途径之一.实验利用RT - PCR技术扩增得到大小为1 533 bp的玉米ZmCPK12基因,经限制性内切酶SalI和NotI进行消化,将目的基因与真核表达质粒pREP -5N连接,获得重组真核表达质粒ZmCPK12 - 5N.[结果]通过菌落PCR、双酶切及测序等方法进行鉴定,重组真核表达质粒ZmCPK12-5N构建成功.制备酵母感受态,将重组质粒电击转人酵母中,酵母菌落PCR结果显示电击转化成功.[结论]成功构建了玉米mCPK12基因真核表达载体,并且成功转化了酵母.     

水稻广谱抗性负调控基因OsSSI2的克隆及原核表达

水稻Os SSI2基因负调控水稻的抗病反应,为了研究该基因的抗性机理,构建p GEX-6P1-Os SSI2原核表达载体,转化大肠杆菌BL21细胞后利用IPTG诱导外源蛋白表达并优化表达条件,使用SDS-PAGE和Western Blot检测分析表达产物。结果表明:成功构建了p GEX-6P1-Os SSI2原核表达载体后进行原核表达,在IPTG浓度为0.3 mmol/L,温度为25℃,诱导表达7 h,通过SDS-PAGE和Western Blot检测发现Os SSI2蛋白的可溶性表达量最多,为进一步研究水稻Os SSI2蛋白的抗性机理奠定了基础。     

玉米ZmCCT基因缺失区段原核表达载体的构建与蛋白表达

[目的]旨在纯化玉米ZmCCT基因缺失区段的原核表达蛋白.[方法]依据ZmCCT氨基酸序列中的CCT保守功能区,利用PCR技术获得ZmCCT基因的缺失突变体DNA片段,分别构建4个原核蛋白表达缺失区段.[结果]成功获得3个缺失区段的原核蛋白:ZmCCT1-300,ZmCCT300-540和ZmCCT1-540.[结论]该研究不仅有助于ZmCCT多克隆抗体的纯化,还将为探索ZmCCT的抗病分子机理奠定基础.     

大豆铁蛋白基因GmFerritin在玉米中的遗传转化

使用In-Fusion试剂盒构建表达载体pCUB-Zein::ferritin-35s::bar,以玉米自交系齐319茎尖分生组织为受体,采用农杆菌介导法,将玉米胚乳特异启动子基因15 kDβ-Zein驱动的大豆铁蛋白ferritin基因转入玉米,共筛选出272株除草剂(草铵膦)抗性植株,其中108株PCR检测呈阳性,转化率达3.6%,初步判断Zein::ferritin基因已转入玉米基因组中。     

Hi-Ⅱ玉米的NGc抗虫基因遗传转化研究

为促进转基因抗虫玉米研究,通过农杆菌介导的玉米幼胚遗传转化法将目的基因转入玉米材料Hi-Ⅱ中,通过外植体侵染、共培养以及分化筛选,培养具有CryNGc抗虫基因的玉米植株,并研究外源基因在后代的遗传表达及抗性情况.结果表明:玉米幼胚大小在1.2～1.8mm时侵染效果最好,并成功获得了10株具有Cry NGc抗虫基因的阳性...     

农杆枪法基因遗传转化技术初报

为提高遗传转化的效率,克服受体范围的限制,采用农杆枪法进行基因的遗传转化。根据已报导的VirD1和VirD2基因的序列设计特异引物,以农杆菌C58菌株的质粒为模板进行PCR扩增．对VirD1和VirD2基因进行克隆。将序列正确的VirD1和VirD2基因连接到植物表达载体PBI121启动子CaMV35S和终止子nos之间,构建VirDl和VirD2基因的表达载体pB-VirD1及pB-VirD2。经PCR及酶切鉴定,基因已成功构建到表达载体上,为农杆枪法进行目的基因转化的研究奠定了基础。     

转基因抗虫玉米转育株Bt蛋白的表达特性分析

为了对转基因抗虫玉米转育株 Bt 蛋白的表达特性进行分析,用Cry1Ab/Cry1Ac 平板试剂盒定量检测了3种含 Bt 基因的玉米回交后代品系 BC₁F₁ ( HZ3152、HZ3342、HC0142 ) 在相同生长时期不同组织和不同生长时期相同组织中 Bt 蛋白的表达量。结果表明,在乳熟期 BC₁F₁ 不同组织中 Bt 蛋白表达含量的高低顺序为: 叶片 ＞胚乳＞花丝＞种子苞叶;在BC₁F₁不同的生长发育阶段 ( 苗期、抽丝期和乳熟期 ),叶片中 Bt 蛋白的含量随生育期的推移呈明显先上升后下降趋势, Bt 蛋白含量在抽丝期达到最大,之后又开始下降;苗期 ( HC0142、HZ3152、HZ3342） Bt 蛋白的含量 (4.16、3.75和3.72 μg·g^-1 ) 和乳熟期 (5.56、4.58和4.79 μg·g^-1 ) 的含量分别是抽丝期 (6.05、5.36和5.50 μg·g^-1) 的 68%、69%、67% 和91%、85%、87%。一般在玉米生长后期 Bt 蛋白的浓度有所下降,但幅度不大,对其抗性不会造成太大影响。该研究表明 Bt 蛋白在玉米回交后代中可以稳定表达,对 Bt 的相关研究为转基因育种等提供了参考依据。     

小麦TaLRK基因高效表达载体的构建及遗传转化

从抗白粉病小麦(Triticum aestivumL)品系99/2439中分离到1个类受体蛋白激酶基因TaLRK。为了研究TaLRK基因对小麦白粉病菌[Blumeria graminis(DC)E O Speer fsptriticiEm Marchal]的抗性作用,以单子叶植物高效表达载体pAHC25为基础载体,将TaLRK基因插入到玉米泛素高效启动子Ubi1的下游,构建成pAH-TaLRK( )植物高效表达载体。利用花粉管通道技术,以高产小麦新品种周麦18为受体进行了遗传转化。T0代植株经PPT抗性鉴定、PCR扩增检测,获得了19个转基因植株,为研究小麦TaLRK基因的功能奠定了基础。