基于转录组测序分析细粒棘球绦虫原头蚴与巨噬细胞RAW264.7免疫互作相关基因

旨在解析细粒棘球绦虫原头蚴与巨噬细胞RAW264.7免疫互作相关的基因,为进一步阐明细粒棘球绦虫原头蚴调控宿主免疫反应及寄生适应机制提供理论依据。将细粒棘球绦虫原头蚴和巨噬细胞RAW264.7共培养24 h,收集原头蚴和RAW264.7细胞,提取总RNA,构建cDNA文库,利用RNA sequencing技术进行转录组测序分析。当细粒棘球绦虫原头蚴与巨噬细胞RAW264.7共培养24 h后,和0 h对照组相比,原头蚴处理组分别有435个基因的表达出现显著差异变化,其中,上调表达的基因为227个,包括HSP70、HSP10、Eg95前体分子、AgB、FABP和囊泡运输蛋白SC22B等;下调表达的基因为208个,包括EF-hand蛋白、Cathepsin、跨膜蛋白144、内固醇类受体和MAPK7等。GO分析结果表明,差异表达的基因主要富集在血红素转运、铁配位实体运输、细胞外间质、核糖核酸酶MRP复合物、丝氨酸型内肽酶抑制剂活性以及α-半乳糖苷酶活性等过程。KEGG分析结果表明,差异表达的基因主要参与剪接体、内吞作用、内质网的蛋白质处理、吞噬体、MAPK信号通路以及钙信号通路等。当巨噬细胞RAW264.7与细粒棘球绦虫原头蚴共培养24 h后,和PBS对照组相比,原头蚴处理组的RAW264.7细胞共有3 745个基因的表达出现显著变化,其中,1 159个基因出现上调表达,2 586个基因出现下调表达。GO分析结果显示,差异表达基因主要富集在代谢过程、细胞内组分、细胞内、细胞器以及膜结构细胞器等。KEGG信号通路的分析结果表明,差异表达的基因主要参与代谢通路、核糖体通路、剪接体通路、RNA转运以及泛素介导的蛋白水解等通路。同时研究随机选取了部分差异表达的基因进行了qRT-PCR验证,结果表明,其表达趋势与RNA-seq结果一致。综上所述,当细粒棘球绦虫原头蚴面对宿主巨噬细胞免疫压力时,可引起其基因的差异表达,其中,原头蚴中的AgB、FABP1和Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂等具有免疫调节作用的分子表达明显上调,推测其可能参与宿主的免疫调控,进而有利于虫体在宿主的寄生和免疫逃避。     

细粒棘球绦虫原头蚴lncRNA表达谱分析

本研究旨在解析lncRNA在细粒棘球绦虫原头蚴中的表达谱特性,为进一步揭示lncRNA在细粒棘球绦虫原头蚴发育中的作用及调控机制提供理论依据。从患病绵羊肝无菌采集细粒棘球绦虫原头蚴,提取总RNA,构建原头蚴lncRNA文库,利用RNA sequencing技术进行测序分析。结果表明,首次从细粒棘球绦虫原头蚴中鉴定出609个新的lncRNA分子。其中intergenic lncRNA有431个,intronic lncRNA有11个,anti-sense lncRNA有68个,sence lncRNA有99个。GO分析表明,其表达量前200的lncRNA分子主要与MAP激酶的负调控、SMC结合复合物、IMP的生物合成以及乙酰转移酶激活剂活性相关。KEGG分析结果表明,其表达量前200的lncRNA分子主要与细胞凋亡、萜类骨架生物合成、碳代谢以及背腹轴形成相关。cis分析结果表明,在这609个新的lncRNA分子中,与虫体Wnt信号通路、Hedgehog信号通路、NF-κB信号通路、cAMP信号通路、Notch信号通路、胆酸盐信号通路以及背腹轴信号通路相关的lncRNA分子分别有79、31、10、128、43、84和73个。qRT-PCR的验证结果表明,表达量前10的lncRNA分子与测序结果一致。RNA荧光探针原位杂交结果表明,高表达的lncRNA分子在细粒棘球绦虫原头蚴吸盘以及表皮均有表达。综上所述,本研究首次解析了细粒棘球绦虫原头蚴中lncRNA的表达谱特性,丰富了细粒棘球绦虫lncRNA的数据,为进一步解析lncRNA在细粒棘球绦虫原头蚴发育中的作用奠定了基础。     

细粒棘球绦虫原头蚴microRNA表达谱分析

旨在解析miRNA在细粒棘球绦虫原头蚴中的表达谱特性,为进一步揭示miRNA在细粒棘球绦虫原头蚴发育中的作用及调控机制提供理论依据。从患病绵羊肝无菌采集细粒棘球绦虫原头蚴,提取总RNA,构建原头蚴miRNA文库,利用RNA sequencing技术进行测序分析。结果表明,本研究从细粒棘球绦虫原头蚴中分离得到109个已知的miRNA分子,同时得到189个新的miRNA发夹前体分子。靶基因的预测结果显示,已知miRNA共有132个靶基因,而新发现的miRNA共有3 152个靶基因。进一步的研究发现这些miRNA分子广泛参与虫体生长发育相关的关键信号通路,诸如wnt、cAMP、Hedgehog、NF-κB、Notch以及胆酸盐等信号通路,研究又进一步采用实时荧光定量PCR以及原位杂交技术对虫体经典wnt信号通路相关的miRNA分子以及其靶标基因进行了差异表达以及组织定位研究。结果提示,HG328413.1_36258和β-catenin、HG328414.1_36364*和dis以及HG328399.1_25846和axin可能存在潜在的调控关系。综上所述,本研究在细粒棘球绦虫原头蚴中发现了大量的新的miRNA分子,丰富了原头蚴miRNA的数据,为进一步解析miRNA在细粒棘球绦虫原头蚴发育中的作用奠定了基础。     

棘球蚴病的免疫学研究进展

包虫病又称棘球蚴病，是一种呈世界性分布的严重影响人畜健康的人兽共患寄生虫病。属扁形动物门，圆叶目带科，棘球属，有4种：细粒棘球绦虫(Echinococcus granulosus)，多房棘球绦虫(E．multilocularis)，少节棘球绦虫(E．oligarthtus)和福氏棘球绦虫(E．vogeli)。我国主要以细粒棘球绦虫     

四川省若尔盖牦牛藏绵羊包虫感染分子流行病学调查

细粒棘球蚴病俗称包虫病,是由细粒棘球绦虫的中绦期幼虫-细粒棘球蚴寄生在人和动物体内所致的一种严重的人兽共患寄生虫病。若尔盖县是全国5大牧区之一,牦牛和藏绵羊是该地区主要的经济动物,也是细粒棘球绦虫主要的中间宿主之一,数量分别达100万和150万余头。     

藏绵羊棘球蚴病综合防制

<正>1病因棘球蚴病(包虫病)是细粒棘球绦虫的幼虫阶段,即棘球蚴寄生于藏绵羊肝脏、肺脏等组织器官而引起的一种寄生虫病。该病是一种人畜共患疾病。细粒棘球绦虫虫体长2~6 mm,由一个头节和3~4个节片组成。头节有顶突和四个吸盘,顶突有2列小钩。棘球蚴呈囊包状,大小不一,小的有豌豆粒大,大的有小孩的头大。2感染途经狗是细粒棘球绦虫的终末宿主,人误食含细粒棘球绦虫虫卵的食物或饮水时,同样会感染棘     

棘球蚴病概述

<正>包虫病又称棘球蚴病,是一种人畜共患的寄生虫病。下面就让我们来了解一下这种危害严重的二类动物疫病-包虫病。包虫又名棘球绦虫,在分类上属棘球属,而棘球属又包含5个种,分别是细粒棘球绦虫、多房棘球绦虫、石渠棘球绦虫、少节棘球绦虫和福氏棘球绦虫。在我国,主要分布的是细粒棘球绦虫和多房棘球绦虫。细粒棘球蚴病又称囊型包虫病;多房棘球蚴病又称泡型包虫病。包虫病主要分布在我国的青海、西藏、四川、     

X射线照射后对细粒棘球绦虫原头蚴体外培养成囊率的观察

观察X线照射后细粒棘球绦虫原头蚴体外培养下成囊率的变化,初步探索X线照射对原头蚴成囊过程的影响。新鲜采集自然感染细粒棘球蚴的绵羊肝脏,无菌分离原头蚴体外培养,将X线照射分为0,10,20,30,40,50,60 Gy共7个剂量,于单次大剂量照射后观察各组形态变化,计算成囊率。结果显示,单次大剂量照射原头蚴后体外培养14 d,对照组光镜下可见原头蚴成囊发展,大部分原头蚴已成囊,顶突消失,囊外周已有角质层出现;而照射组出现不同程度的钩突崩解,正常结构消失。不同剂量X线照射后14 d统计原头节的成囊率各不同剂量照射组与对照组比较差别有统计学意义(P0.05)。结果表明,X放射线可抑制细粒棘球绦虫原头蚴向成囊方向发展,这将为X线对原头蚴及包囊的杀灭作用机制研究奠定一定的理论基础。     

科学防控包虫病

一、流行病学(一)病原目前分类学已确认的棘球绦虫有4个种:细粒棘球绦虫、多房棘球绦虫、少节棘球绦虫和伏氏棘球绦虫。我国主要流行由细粒棘球绦虫的幼虫引起的囊型棘球蚴病     

科学防控包虫病

一、流行病学(一)病原目前分类学已确认的棘球绦虫有4个种:细粒棘球绦虫、多房棘球绦虫、少节棘球绦虫和伏氏棘球绦虫。我国主要流行由细粒棘球绦虫的幼虫引起的囊型棘球蚴病     

GPX4失活通过JNK通路缓解LPS诱导巨噬细胞炎症反应

【目的】 研究硒蛋白谷胱甘肽过氧化物酶4（glutathione peroxidases 4,GPX4）失活如何参与调控脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）诱导的RAW264.7巨噬细胞炎症反应及其潜在的分子机制。【方法】 体外培养RAW264.7巨噬细胞,以DMSO为对照,使用0.1~5.0 μmol/L GPX4抑制剂FIN56处理,通过CCK-8法检测细胞活力和Western blotting检测GPX4蛋白表达水平,确定抑制剂最适浓度。将RAW264.7巨噬细胞分为4组：对照组,添加DMSO培养24 h;FIN56（GPX4抑制剂）组,添加0.5 μmol/L FIN56培养24 h;DMSO-LPS组,DMSO培养24 h后使用LPS （100 ng/mL）刺激3 h;FIN56-LPS组,FIN56培养24 h后使用LPS刺激3 h。各组细胞经培养后,利用荧光探针2',7'-二氯二氢荧光素二乙酸酯（2',7'-dichlorodi-hydrofluorescein diacetate,H₂DCFDA）检测细胞内活性氧（reactive oxygen species,ROS）水平,使用试剂盒法检测细胞内丙二醛（malondialdehyde,MDA）水平,分别使用ELISA和荧光定量PCR检测促炎细胞因子白细胞介素1β（interleukin-1β,IL-1β）、白细胞介素6（interleukin-6,IL-6）、肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）的分泌水平和基因表达量,使用Western blotting法检测Toll样受体4（toll like receptor 4,TLR4）信号通路相关蛋白表达水平。【结果】 与DMSO处理相比,0.5 μmol/L FIN56处理巨噬细胞24 h对细胞活性无显著影响（P>0.05）,且显著降低GPX4蛋白表达水平（P<0.05）,故选用0.5 μmol/L FIN56用于后续实验。与对照组相比,FIN56和LPS均显著增加了ROS积累（P<0.05）,而与DMSO-LPS组相比,FIN56-LPS组ROS水平显著升高（P<0.05）。与对照组相比,LPS可显著增加小鼠巨噬细胞IL-1β、IL-6和TNF-α的mRNA表达量和IL-6含量,以及c-Jun氨基末端蛋白激酶（c-Jun N-terminal protein kinase,JNK）和c-Jun磷酸化水平（P<0.05）,而FIN56可显著下调LPS诱导的IL-6的mRNA表达量和含量及JNK和c-Jun磷酸化水平（P<0.05）,但对p38蛋白（p38 MAPK,p38）、细胞外调节蛋白激酶（phosphorylate extracellular regulated protein kinases1/2,Erk1/2）蛋白表达水平无显著影响（P>0.05）。【结论】 GPX4失活可有效阻断JNK和c-Jun磷酸化,从而特异性抑制LPS诱导的巨噬细胞的炎症反应。该结果可为以GPX4为靶点研发抗炎治疗策略提供理论依据。     

布鲁氏菌介导的mmu-miR-671-5p的靶基因预测与功能富集性分析

为进行布鲁氏菌介导的mmu-miR-671-5p的靶基因预测,本试验利用布鲁氏菌（Brucella）感染RAW264.7细胞后,分别运用miRanda和TargetScan软件进行差异表达的mmu-miR-671-5p靶基因的预测,预测的靶基因分别有11 953和9 252个,将预测结果取交集进行韦恩（Venn）分析,重叠部分的靶基因有3 681个;利用GO与KEGG进行功能富集性分析,再利用PicTar软件进一步对mmu-miR-671-5p的靶基因进行预测,将预测结果与Venn分析结果进一步取交集,结果显示,mmu-miR-671-5p的预测靶基因有7个;实时荧光定量PCR分别验证7个预测靶基因的相对表达量发现,Tnfrsf1b与Tnip1基因相对表达量极显著降低（P<0.01）;在RAW264.7细胞中转染mmu-miR-671-5p inhibitors,分别验证7个预测靶基因的相对表达量发现,Tnfrsf1b与Tnip1基因的相对表达量极显著升高（P<0.01）;对mmu-miR-671-5p与Tnfrsf1b和Tnip1的3'非翻译区（3'UTR）结合靶位点分别进行预测,结果初步表明,mmu-miR-671-5p的靶基因为Tnfrsf1b与Tnip1,其预测结合靶位点均只有1个,分别位于Tnfrsf1b和Tnip1 3'UTR全长位置的91和305 bp。本研究结果为进一步揭示mmu-miR-671-5p在布鲁氏菌感染RAW264.7细胞过程中的功能提供科学依据。     

布鲁氏菌OMP16对RAW264.7细胞凋亡与免疫活性的影响

旨在研究布鲁氏菌外膜蛋白OMP16对小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞凋亡和免疫活性的影响及其机制探讨。以OMP16处理RAW264.7细胞为模型,通过MTT以及Hoechst法检测OMP16对细胞活力的影响,通过Western blot检测Caspase-3、GRP78、CHOP的表达情况,流式细胞术检测OMP16对细胞凋亡的影响以及RT-PCR检测免疫因子IL-1β、IL-6和TNF-α的变化。结果表明,OMP16能够影响RAW264.7细胞的活力,且有浓度依赖性;添加OMP16后能够显著增加凋亡标志因子Caspase-3的表达（P<0.001）,并促进RAW264.7细胞的凋亡;作用24、36 h之后,显著引起内质网应激标志蛋白GRP78、CHOP的表达;并且能显著上调IL-1β、IL-6、TNF-α等炎性因子的mRNA表达水平。布鲁氏菌OMP16能够诱导RAW264.7凋亡,OMP16显著引起内质网应激CHOP通路的激活。     

布鲁菌感染小鼠RAW264．7细胞对IRGl基因的表达调控作用

针对小鼠RAW264．7细胞IRGl基N设计4个RNA干扰靶位,筛选出最佳干扰序列构建shRNA慢病毒载体质粒并包装获得慢病毒颗粒,进而经嘌呤霉素筛选获得稳转细胞系,实现IRGl基因在RAW264．7细胞基因表达的沉默。并通过布鲁菌l6M株及M5株感染基因沉默细胞对IRGl基因在布鲁菌感染中的作用进行研究。结果表明,慢病毒介导的shRNA高效、稳定地沉默了IRGl基因的表达,布鲁菌侵染RAW264．7细胞后IRGl基因表达上调。未试验为1RG1基因及相美调控基因抗布鲁菌病作用研究奠定了基础。     

HO-1在巨噬细胞中的抗炎和抗氧化作用

【目的】旨在揭示血红素加氧酶1(HO-1)在巨噬细胞中的抗炎和抗氧化作用。【方法】利用不同浓度脂多糖(LPS,0、3、5、10、15、20、25μg/mL)、HO-1(0、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10μg/mL)及锌原卟啉(zinc protoporphyrin, ZPP;0、5、10、15、20、30 ng/mL)分别处理巨噬细胞(RAW264.7),12 h后通过CCK8法检测RAW264.7细胞活力,计算LPS、HO-1和ZPP处理RAW264.7细胞的最佳浓度。将RAW264.7细胞随机分为对照组(CT)、LPS组(LPS)、LPS+HO-1组(LH)、HO-1组(HO-1)、LPS+HO-1+ZPP组(LHZ),每组3个重复。CT组细胞用含10%胎中血清的DMEM培养基培养;LPS组细胞用LPS处理;LH组细胞用LPS和HO-1共处理;HO-1组细胞用HO-1处理;LHZ组细胞用LPS、HO-1和ZPP共处理,各组细胞的处理时间均为12 h,收集细胞和上清。采用ELISA法检测上清液中白细胞介素-6(IL-6)、IL-8、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、活性...     

A differential interplay between the expression of Th1/Th2/Treg related cytokine genes in Teladorsagia circumcincta infected DRB1*1101 carrier lambs

ABSTRACT: Substantial debate exists on whether the immune response between sheep resistant and susceptible to gastrointestinal nematodes can be differentiated into a Th1 and Th2 phenotype. The present study addresses the hypothesis that variation in resistance to Teladorsagia circumcincta between DRB1*1101 (associated with reduced faecal egg count and worm burden) carriers and non-carriers is due to a differential interplay in the expression of Th1/Th2 and regulatory T (Treg) related cytokine genes. Lambs from each genotype were either slaughtered at day 0 (un-infected control) or infected with 3 × 104 Teladorsagia circumcincta L3 and slaughtered at 3, 7, 21, and 35 days later. Lambs carrying the DRB1*1101 allele had a significantly lower worm burden (P < 0.05) compared to the non-carriers. Abomasal mucosal cytokine gene expression was evaluated by quantitative real-time PCR and comparison made for time and genotype effects. The response generated varied through the course of infection and was affected by genotype. DRB1*1101 carriers had an up-regulated expression of the Th1-related cytokine genes (IL-1β, TNFα, and IFN-γ) at day 3, but this was replaced by an up-regulated expression of Th2-related cytokine genes (IL-10 and IL-13) and Treg-related cytokine genes (IL-2RA-CD25, TGFα, TGFβ, Arg2, MIF and FOXP3) by day 7. Conversely, in the non-carriers these changes in gene expression were delayed until days 7 and 21 post infection (pi), respectively. It is concluded that resistance to Teladorsagia circumcincta in animals carrying the DRB1*1101 allele is influenced by an earlier interplay between Th1, Th2 and T regulatory immune response genes.     

Effects of Enolase of Streptococcus equi ssp. zooepidemicus on Phagocytic Functions of Alveolar Macrophages in Mice

To investigate the effect of enolase (Eno) of Streptococcus equi ssp. zooepidemicus (SEZ) on phagocytosis of mouse alveolar macrophages (RAW264.7). Recombinant enolase (rEno) was obtained by constructing prokaryotic expression plasmid, and the cytotoxicity of rEno protein on RAW264.7 cell proliferation was determined by trypan-blue living cell count method. After the rEno protein was incubated with RAW264.7 cells, SEZ was applied to the cells and the quantity of bacteria being phagocytosed was detected to determine the phagocytic activity of RAW264.7 cells. Further, candidate proteins that might interact with SEZ Eno in RAW264.7 cells were screened by live cell stable isotope labeling (SILAC) and protein spectrum analysis (LC-MS/MS). It was found that protein treatment (rEno,10 μg·mL^-1) had significant cytotoxic effects on RAW264.7 cells. Treatment of RAW264.7 cells with 10.0 μg·mL^-1 rEno protein for 2 and 4 hours could significantly inhibit the phagocytosis of RAW264.7 cells (P<0.01, P<0.05). In RAW264.7 cells, dynactin subunit protein 2 (Dctn), integrin alpha-M and about 17 proteins that might interact with Eno were preliminarily identified as rEno interaction proteins. The rEno recombinant expression protein was obtained in this study, and it could reduce the phagocytosis of RAW264.7 cells to SEZ. Preliminary screening of interacting proteins also laid a foundation for further revealing the mechanism of Eno in the anti-phagocytosis of SEZ.     

马链球菌兽疫亚种烯醇化酶对小鼠肺泡巨噬细胞吞噬功能的影响

旨在研究马链球菌兽疫亚种（Streptococcus equi ssp.zooepidemicus，SEZ）烯醇化酶（enolase，Eno）对小鼠肺泡巨噬细胞（RAW264.7）吞噬能力的影响。通过构建原核表达质粒获得重组烯醇化酶（rEno），采用台盼蓝活细胞计数法，判定在不同处理浓度和时间下rEno蛋白对RAW264.7细胞的细胞毒性。将rEno蛋白与RAW264.7细胞共孵育后，用SEZ作用于细胞并检测细胞吞菌数量，判断RAW264.7细胞对SEZ的吞噬活性。进一步通过活细胞稳定同位素标记技术（SILAC）和蛋白质谱分析技术（LC-MS/MS），筛选到RAW264.7细胞中可能与SEZ Eno存在相互作用的候选蛋白。结果发现，10 μg·mL^-1 rEno蛋白处理对RAW264.7细胞有明显的细胞毒性，且10 μg·mL^-1 rEno蛋白处理RAW264.7细胞2和4 h可显著抑制其对SEZ的吞噬作用（P<0.01、P<0.05）。初步筛选到RAW264.7细胞中动力蛋白激活蛋白亚单位蛋白（dynactin subunit protein 2，Dctn）、整合素α-M蛋白（integrin alpha-M）等17种可能与Eno发生互作的蛋白。本研究获得了rEno重组表达蛋白，发现rEno可减少RAW264.7细胞对SEZ的吞噬，互作蛋白的初步筛选也为进一步揭示Eno在SEZ抗吞噬中的作用机制奠定了基础。     

A novel ��-glucan produced by Paenibacillus polymyxa JB115 induces nitric oxide production in RAW264.7 macrophages

The effect of extracellular β-(1→3), (1→6)-glucan, produced by Paenibacillus polymyxa JB115, on nitric oxide (NO) production in RAW264.7 macrophages was investigated. β-glucan induced the production of NO by RAW264.7 macrophages in a concentration- and time-dependent manner. Moreover, β-glucan stimulation increased the mRNA expression of iNOS, COX-2 and IL-6 in RAW264.7 macrophages in a concentration-dependent manner.