番茄黄化曲叶病毒CP基因的原核表达载体构建选择

[目的]筛选出目的蛋白能够高效表达的重组质粒。[方法]利用原核表达载体pET-32a(+)和pET-28a(+)成功构建了番茄黄化曲叶病毒(Tomato Yellow Leaf Curl Virus,TYLCV)外壳蛋白(Coat Protein,CP)基因的重组质粒p32a-CP和p28a-CP,并通过PCR和双酶切鉴定了序列连接的正确性;再分别将2个载体转化至BL21(DE3)中,采用不同浓度的IPTG对其进行诱导表达,并进行SDS-PAGE电泳检测。[结果]测序结果显示TYLCV-CP基因已定向插入p32a-CP和p28a-CP中;SDS-PAGE电泳结果显示分子量约为50 kD的目的蛋白在重组载体p32a-CP中得到了高效表达,而在重组载体p28a-CP中未表达。[结论]为下一步的抗体制备及TYLCV的免疫学检测奠定了基础。     

大蒜B病毒CP基因的原核表达及抗血清制备

制备抗大蒜B病毒(Garlic virus B,GarV-B)CP血清,为研究侵染大蒜6种葱X病毒属(Allexivirus)病毒之间的血清学关系以及大田检测GarV-B奠定基础。该研究根据GenBank报道的GarV-B序列设计引物,扩增从六安市寿县分离获得的GarV-B外壳蛋白基因(CP)并进行序列比对分析。将GarV-B的CP基因插入表达载体pS-BET,在大肠杆菌BL21(DE3)plys E菌株中诱导表达。表达的CP经12%SDS-PAGE和5%～20%梯度SDS-PAGE两次制备电泳纯化,免疫小鼠获得抗CP血清。Western blot分析抗体的特异性,采用ELISA分析抗体能否与天然GarV-B病毒结合。结果显示:GarV-B的CP基因与目前已报道的GarV-B不同分离物CP基因核苷酸序列的同源性为89%～90%,氨基酸序列同源性为92%～93%。表明制备的抗体对GarV-B的CP具有高度特异性,且能够与天然GarV-B病毒粒子结合。因此本研究制备的抗GarV-B的CP血清可以用于该病毒的检测。     

番茄黄化曲叶病毒Rep基因植物表达载体的构建及对番茄的遗传转化

克隆番茄黄化曲叶病毒的复制酶基因(TYLCV-Rep),并构建其植物表达载体,通过农杆菌介导法转入番茄子叶外植体。经过共培养、潮霉素筛选和分化再生,获得21株潮霉素抗性植株。PCR检测和Southern Blot检测结果表明,有3株呈阳性检测反应,说明TYLCV-Rep基因已整合到番茄基因组中,阳性率为14.3%。烟粉虱接种试验结果表明,番茄转基因植株较非转基因植株对番茄黄化曲叶病毒的抗性明显增强。     

GroEL基因抗番茄黄化曲叶病毒(TYLCV)的研究

利用烟粉虱体内GroEL基因,构建了具有抗生素标记的SUC2-GroEL和无抗生素标记的CaMV35SPDRB10 2个植物表达载体.通过农杆菌介导法转化番茄,获得抗性再生苗.对抗性植株进行PCR、RT-PCR以及病毒检测.PCR检测结果表明:SUC2-GroEL载体和CaMV35S-PDRB10载体转化的阳性植株分别有11株和9株.RT-PCR检测结果显示:SUC2-GroEL载体和CaMV35S-PDRB10载体转化植株分别有6株和2株检测到GroEL基因特异条带,说明GroEL基因在转录水平得到表达.农杆菌病毒接种和带毒烟粉虱传毒检测结果显示,SUC2-GroEL 载体转基因植株3、4和5号和CaMV35S-PDRB10载体转基凶植株5号均未表现发病症状,证明利用GroEL基因抗番茄黄化曲叶病毒具有可行性,而且SUC2启动子诱导的GroEL抗性更加理想.     

香石竹斑驳病毒外壳蛋白基因的原核表达及抗血清制备

 香石竹斑驳病毒（Carnation mottle virus,CarMV）是侵染香石竹的主要病毒。本研究从已鉴定的CarMV毒源植物中提取总RNA, 克隆外壳蛋白（cp）基因后构建pET30a CP重组质粒,并转入BL21（DE3）pLysS进行原核表达。通过对诱导温度、初菌浓度、IPTG的浓度等表达条件进行优化,目的蛋白在37℃, IPTG 终浓度为10mmol/L的条件下,诱导表达6h后获得最高表达量。采用割胶的方法纯化cp蛋白,纯化后的目的蛋白免疫小鼠获得了特异性抗血清。经Western blot检测,结果表明所制备的抗血清与诱导表达的重组蛋白及接种CarMV的香石竹样品均发生特异性结合。利用所制备抗血清对昆明地区的48个香石竹样品进行抽检,结果表明香石竹样品的带毒率为79.2%。本研究为大规模抗血清生产、检测应用和深入研究该病毒cp基因与寄主的互作奠定基础。     

香蕉线条病毒MP功能域基因的克隆、原核表达及抗血清制备

【目的】制备香蕉线条病毒广东分离物(BSV-GD)MP功能域基因编码蛋白的多克隆抗血清,为BSV基因编码蛋白功能的研究提供条件.【方法】对BSV-GD ORF3基因氨基酸序列进行生物信息学分析,得出MP功能域基因序列,克隆该基因并插入载体pET-28b(+)构建原核表达载体,经IPTG诱导表达后,采用超声波裂解法进行蛋白可溶性分析,利用组氨酸标签纯化试剂盒对目的融合蛋白进行纯化和回收,然后以纯化的目的蛋白为抗原免疫健康家兔制备其多克隆抗血清;通过Western-blot分析该抗血清的特异性,间接ELISA法检测该抗血清的效价.【结果和结论】MP功能域基因在ORF3中的序列为61~311 aa处,核酸序列长753 bp.试验克隆了该基因并成功构建了其原核表达载体pET28b-MP,经IPTG诱导1 h后表达了相对分子质量约为30 800的融合蛋白6His·MP.可溶性分析表明该融合蛋白以包涵体形式存在,纯化获得了高纯度的目的融合蛋白,以其为抗原成功制备了BSV-GD MP功能域基因编码蛋白的多克隆抗血清;分析表明该抗血清具有很强的特异性,其效价高达204 800倍以上.     

番茄环纹斑点病毒非结构蛋白NSs的原核表达及多抗血清制备

用RT-PCR从感染番茄环纹斑点病毒(Tomato zonate spot virus,TZSV)的番茄中扩增出编码病毒非结构蛋白NSs基因,将NSs基因构建到原核表达载体p ET-30 a中,获得原核表达载体p ET-30a-NSs,转化大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG诱导表达。SDSPAGE电泳分析显示,高效诱导表达了57k Da融合蛋白。用回收纯化的融合蛋白免疫家兔,获得多抗血清。间接ELISA测定多抗血清的效价为1/8192。用制备好的抗血清对TZSV感病病样进行Western blotting检测,能检测到特异性条带。结果表明该抗血清可用于TZSV的检测,并为进一步研究NSs功能奠定了基础。     

福建省番茄黄化曲叶病毒的分子鉴定分析

为了对福建省发生的番茄黄化曲叶病毒病的病原进行分子鉴定,并对其病原分子的变异和进化情况进行分析。根据已知的番茄黄化曲叶病毒(TYLCV)基因组序列设计特异引物进行PCR扩增,对获得的特异性片段回收、克隆并测序,结果表明,PCR分子标记反应扩增到541bp的特异性条带,将该特异性产物经回收和纯化并进行克隆与测序,测序结果经BLAST比对后,表明该分离物的序列与国内外的病毒序列相似度为97%~99%。试验结果表明福建省的5个地市的番茄均已被番茄黄化曲叶病毒病危害,应当加强防治。     

中国番茄黄化曲叶病毒编码的RNA沉默抑制子AC4蛋白的核酸结合特性

农杆菌共浸润试验结果表明:中国番茄黄化曲叶病毒(Tomato yellow leaf curl China virus,TYLCCNV)Y10分离物编码AC4蛋白是RNA沉默抑制子.为了研究RNA沉默抑制子AC4蛋白的作用机制,将TYLCCNV-Y10的AC4基因插入到原核表达载体pET-32a的多克隆位点上,构建重组原核表达载体pET32a-YIOACA.将重组载体导入BL21(DE3)pLysS进行ACA蛋白表达,并在自然条件下纯化蛋白.利用原核表达的ACA蛋白进行电泳迁移率变动试验(electrophoretic mobility shift assay,EMSA),分析ACA蛋白分别与单、双链siRNA和单、双链长RNA的结合情况.试验结果表明:TYLCCNV-Y10编码的ACA蛋白具有结合单链siRNA和单链长RNA特性,而不与双链siRNA和双链长RNA结合.     

山东省局部地区番茄黄化曲叶病毒的分子鉴定

近年来山东省部分地区发现番茄黄化曲叶症状。为了确定这种疑似病毒,利用双生病毒外壳蛋白（CP）基因及DNA—A基因组的引物对枣庄、菏泽和淄博的染病番茄叶片进行了检测,测序分析表明这种病毒是番茄黄化曲叶病毒（TYLCV）。系统发育分析结果表明,该病毒可能是由我国东南沿海地区和日本传人的。     

福州番茄黄化曲叶病毒的全基因组结构特征

为明确引起福建省福州市长乐地区番茄上曲叶症状的病原,提取样品总DNA,利用简并引物PA/PB进行PCR扩增,从10个样品中均可扩增到500 bp左右的特异条带.NCBI BLAST序列比对表明,该序列与番茄黄化曲叶病毒(TYLCV)核苷酸序列相似性最高,达99.0%.再根据已知500 bp序列设计1对反向引物,扩增TYLCV分离物Fz01全基因组近全长,克隆并测序.经序列拼接发现,TYLCV分离物Fz01基因组全长2781 nts(KP685598),与已报道的TYLCV其他各分离物相似性均在89.3%以上,而与来自中国不同地区的TYLCV分离物的相似性均在98.7%以上.因此,Fz01属于TYLCV的一个分离物.     

番茄黄化曲叶病毒辽宁葫芦岛分离物的检测和序列分析

采用已报道的菜豆金色花叶病毒属的通用引物PA/PB,从辽宁葫芦岛地区的3份番茄样品中扩增到Begomoviruses的保守区域,获得3个长度约500 bp的克隆序列,同源性为99.58%.DNA-A全基因组序列分析结果显示,3份样品DNA-A全长均为2 781 bp(分别命名为LNhud1、LNhud2和LNhud3分离物),具有典型双生病毒结构,与番茄黄化曲叶病毒(TYLCV)山东分离物(TYLCV-[CN:SD:SDWF-L7:12],KC999850)的核苷酸同源性最高(99.6%).根据双生病毒分类标准,认为LNhud1、LNhud2和LNhud3是TYLCV的辽宁分离物.系统关系树表明,这3个分离物属于TYLCV-Isreal株系.     

韭葱黄条病毒六安分离物CP基因原核表达与抗体制备

根据已报道的韭葱黄条病毒(LYSV)序列设计引物,扩增LYSV六安分离物的外壳蛋白(CP)基因,序列同源性分析结果表明,与目前已报道的LYSV不同分离物CP基因核苷酸序列同源性为84.0%～95.8%,相应推测出的氨基酸序列同源性为86.8%～97.6%.将CP基因插入原核表达载体pSBET后在大肠杆菌BL21(DE3)Plys S中诱导表达.通过12%SDS-PAGE和5%～20%梯度SDS-PAGE两次制备电泳纯化诱导产物,免疫家兔获得抗CP血清.Western blot分析对CP具有高度特异性.硫酸铵沉淀法与Protein A-Red Sepharose亲和层析相结合提取IgG,获得效价达1:3 700的一抗,可用于田间LYSV病样检测.     

基于微流控芯片电泳的番茄黄化曲叶病毒快速检测

【目的】探索微流控芯片电泳方法在PCR产物检测方面的效果,并建立针对番茄黄化曲叶病毒（Tomato yellow leaf curl virus,TYLCV）的微流控芯片电泳检测方法,弥补琼脂糖凝胶电泳方法在试剂消耗、所用时间、安全性方面的缺陷。【方法】通过对TYLCV的基因组进行分析后,在该基因组中相对稳定的位置设计引物,同时兼顾引用已被研究者研究过的引物,对这些选择的引物进行特异性、稳定性、灵敏度等方面的验证,筛选出用于后续试验的引物。选择DNA标准物φX174/BsuR I(Hae Ⅲ) marker,分别进行琼脂糖凝胶电泳和微流控芯片电泳,对二者在耗材、耗时和灵敏度方面进行比较,确定微流控芯片电泳在核酸检测方面的应用价值。利用筛选出的其中1对引物对番茄叶片的实际样品进行PCR扩增,随后通过微流控芯片电泳对其进行检测,以此探讨微流控芯片电泳在病毒检测方面的检测效果。【结果】共筛选出14对TYLCV备用引物,其中2对引自文献,12对为本文设计,每对引物均可满足微流控芯片检测要求。选择其中1对引物TYLCV-T作为随后的研究对象。利用琼脂糖凝胶电泳和微流控芯片电泳对DNA标准物检测,结果表明微流控芯片电泳在耗时方面不足琼脂糖凝胶电泳的1/10,约为13 min,试剂消耗为琼脂糖凝胶电泳的1/8,检测灵敏度方面至少比琼脂糖凝胶电泳高103倍,根据DNA标准物原液浓度计算可知,微流控芯片电泳至少可准确检测到浓度为5×10-6 μg?μL-1的核酸样品。利用微流控芯片电泳对TYLCV-T扩增的TYLCV PCR产物进行检测,将检测峰值图与DNA标准物的峰值图时间比较,就可判断出产物峰的大小范围。【结论】筛选出的关于TYLCV的备用引物可作为进一步研究微流控芯片技术在该病毒检测方面的基础;通过将琼脂糖凝胶电泳和微流控芯片电泳进行比较,确立了后者在核酸检测方面的应用价值;通过微流控芯片电泳对TYLCV PCR产物的检测,建立了基于微流控芯片电泳的TYLCV快速检测方法,为TYLCV的快速检测提供新的技术支持。     

胡葱黄条病毒外壳蛋白的原核表达与抗血清的制备

设计特异性引物PCR扩增得到胡葱黄条病毒(SYSV-O)的全长外壳蛋白(CP)基因,构建原核表达载体pET32a-SYSV-O CP,转化大肠杆菌诱导表达。结果表明,SYSV-O CP基因在大肠杆菌中得到了高效表达,分子量约为46 kDa。用纯化表达产物免疫小鼠制备抗血清,Western blot检测结果表明,抗血清与SYSV-O的CP发生了强烈的特异性反应。使用该抗血清进行了田间样品的带毒检测。     

鸭新城疫病毒M基因的原核表达与多抗制备

为制备鸭源新城疫病毒M蛋白的多克隆抗体,根据鸭新城疫病毒M基因序列设计1对特异性引物,RT-PCR方法扩增出M基因,克隆入原核表达载体p ET-30a,转化大肠杆菌BL21(DE3),在IPTG的诱导下成功表达重组蛋白,SDS-PAGE结果显示,表达的重组蛋白分子质量约为39 ku。将目的蛋白切胶免疫ICR小鼠,制备重组蛋白的多抗血清,Western blot分析显示,制备的多抗血清能与鸭新城疫病毒感染的SPF鸡胚尿囊液总蛋白发生特异反应。以上结果表明,M基因在大肠杆菌中获得了成功表达,且制备的鼠多抗血清可以用于M蛋白的检测。     

不同番茄品种对番茄黄化曲叶病毒的抗病性分析

【目的】番茄黄化曲叶病毒病 (Tomato yellow leaf curl virus,TYLCV) 是一种影响全世界番茄生产的病害,培育抗病品种是最有效、经济和持久的防控手段。目前生产上应用的抗病品种繁多,但存在对TYLVC不同抗性基因的抗性水平研究甚少、了解不够全面的问题。为了解带有不同抗性基因的番茄品种对番茄黄化曲叶病毒病的抗性,对北京市农林科学院蔬菜中心培育的番茄品种抗病性进行检测,并利用半定量RT-PCR方法分析抗病基因和抗病蛋白的表达水平。【方法】选取携带有Ty3a/Ty3a的番茄材料秋光285（Ty3a 纯合）、棚137×246（Ty3a 杂合）,携带Ty1+Ty3a纯合的秋光120、携带Ty1+Ty3a杂合的秋光81和感病对照M82为试验材料,观察番茄植株自然条件下发病情况。通过调查发病率和病情指数,考查这些番茄品种的抗病性,并利用RT-PCR方法分析抗病基因Ty1和Ty3a以及病程相关蛋白葡聚糖酶和几丁质酶基因的表达水平。【结果】携带抗性基因的杂合体、纯合体抗病性差异不明显,含有两个抗性基因和含有单一抗病基因品种的抗病性稍有差异,但差异不显著。半定量RT-PCR结果显示不同番茄品种在感染TYLCV后,体内抗性基因表达量随着发病时间的增加,Ty-3a和Ty-1的表达量逐渐增强。Ty-3a在4个番茄品种中表达水平由弱到强依次为秋光285（Ty-3a纯合）、棚137×246（Ty-3a杂合）、秋光120（Ty-1+Ty-3a纯合）和秋光81（Ty-1+Ty-3a杂合）,Ty-1在秋光81中的表达显著高于在秋光120中的表达。同时,植株体内葡聚糖酶和几丁质酶基因表达量均比对照显著增加,并随着发病时间的增加逐渐增强。在发病20 d和30 d后,携带Ty-1+Ty-3a杂合的秋光81的葡聚糖酶基因表达显著强于其他几个品种。【结论】几个番茄材料对TYLCV的抗性由弱到强依次为秋光285（Ty3a 纯合）、棚137×246（Ty3a杂合）、秋光120（Ty1+Ty3a纯合）和秋光81（Ty1+Ty3a杂合）。不同番茄抗病品种感染TYLCV后,体内抗性基因表达量随发病时间增加而增强,葡聚糖酶和几丁质酶基因表达量均比感病对照显著增加,表明番茄抗病品种在感染TYLCV后的抗病性除了与抗性基因的表达有关外,同时也与抗病相关蛋白表达增强有关。     

番茄黄化曲叶病毒病研究进展

论文从研究现状、植株症状、致病机理、检测方法、防治措施、抗病育种方法、鉴定手段等多方面阐述番茄黄化曲叶病毒病研究进展,对番茄黄化曲叶病毒病研究方向、防治工作等提出展望。