重组牛分枝杆菌CFP-10蛋白间接ELISA检测方法的建立

[目的]建立检测牛分枝杆菌的间接ELISA方法,快速区分致病性与非致病性牛分枝杆菌,为净化牛结核病提供技术支撑.[方法]以体外扩增表达并纯化的重组牛分枝杆菌CFP-10蛋白为包被抗原,建立检测牛分枝杆菌的间接ELISA,并应用方阵法优化间接ELISA的检测条件.[结果]重组CFP-10蛋白间接ELISA的最佳检测条件为：以8μg/mL重组CFP-10蛋白包为被抗原,37℃下包被1h,再以5％脱脂奶封闭1h,血清（一抗）经1∶200倍稀释后作用1h,然后以1：500倍稀释的辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG（二抗）作用1h.该间接ELISA的阴阳临界值为0.281,仅与牛分枝杆菌呈阳性反应,与牛布鲁氏杆菌、牛口蹄疫病毒无交叉反应;其敏感性能检测1：320倍稀释的血清,批内与批间的变异系数均小于5.0％.[结论]建立的重组牛分枝杆菌CFP-10蛋白间接ELISA具有特异、敏感等优点,临床上可用于致病性牛分枝杆菌的检测.     

结核分枝杆菌和牛分枝杆菌的二重PCR快速检测试剂盒的研究

根据已发表的结核分枝杆菌23S rRNA和牛分枝杆菌特殊基因序列,设计并合成了2对可扩增结核分枝杆菌和牛分枝杆菌特异性基因片段的引物,建立二重PCR快速检测结核分枝杆菌和牛分枝杆菌的方法,并研制出检测试剂盒。结果表明,该检测试剂盒对结核分枝杆菌能特异性地扩增出838 bp条带而扩增不出631 bp条带,牛分枝杆菌能特异地扩增出838 bp和631 bp条带,而对其他牛菌株的DNA扩增结果均为阴性;敏感性试验表明最低能检测出50 pg的结核分枝杆菌和牛分枝杆菌DNA模板;保存期测定结果表明,在-20℃条件下保存至1、3、6、9个月时,试剂盒的敏感性无明显变化,仍能检测到50 pg的DNA模板,保存至12个月时其敏感度仍能100%检出阳性样品。     

几种牛副结核琼扩抗原的比较

利用免疫学方法制备了牛副结核细胞浆抗原、细胞壁声波粉碎抗原、Sephadex-G200层析抗原和草柱亲和抗原，分别与牛副结核阳性、弱阳性及阴性血清进行琼扩散试验。结果表明：细胞浆抗原、细胞壁超声波粉碎抗原与阳性、弱阳性血清之间，以及层析抗原和草柱亲和抗原与阳性血清之间有沉淀线出现，而其它的均无沉淀线出现。12个月后，重复该试验，结果细胞浆抗原、细胞壁超声波粉碎抗原阳性血清之间有沉淀线出现，而与弱阳性血清之间以及层析抗原和草柱亲和抗原与阳性血清之间均推动了沉淀线。结果显示：细胞浆抗原和细胞壁声波粉碎抗原在用作牛副结核琼护抗原时，优化层析抗原和草柱亲和抗原。     

牛结核分枝杆菌抗原蛋白Ag85B的表达及纳米疫苗的制备

以牛结核分枝杆菌(Mycobacterium bovis,MTB)C68001株基因组DNA为模板,克隆免疫优势抗原基因Ag85B,构建重组表达质粒p ET-28a-ag85b,转化入大肠埃希菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达重组蛋白,对表达产物进行SDS-PAGE和Western blot分析。以明胶为佐剂,Ag85B为目的抗原制备纳米疫苗,并对其进行了相关的工艺检测。以BCA法建立测定蛋白质含量的标准曲线,在此基础上检测纳米疫苗的载药率和包封率。结果显示,明胶佐剂疫苗的载药率为71.83%,包封率为41.03%,符合纳米疫苗的工艺要求。     

除草剂2,4-D完全抗原的合成与鉴定

通过活化酯法和混合酸酐法,用牛血清蛋白(BSA)和卵清蛋白(OVA)合成2,4-D免疫抗原和包被抗原,再分别采用紫外分光光度法和酶联免疫吸附法(ELISA)进行鉴定.结果是:2种方法合成的完全抗原中2,4-D和蛋白质的偶联比分别为24:1和17:1,抗血清效价为1.28×104～2.56×104.     

牛源分枝杆菌变应原对免疫豚鼠变态反应试验

本文采用牛结核PPD检出阳性牛分离的分枝杆菌(包括有牛分枝杆菌、瘰疬分枝杆菌、乌胞内分枝杆菌2型及9型、副结核分枝杆菌、偶发分枝杆菌以及草分枝杆菌等),制成灭活免疫原进行豚鼠接种,并以各种分枝杆菌PPD进行变态反应检查,以观察其发生交叉反应的情况。试验结果表明:各种分枝杆菌除发生主反应外,均表现出明显的相互交叉的变态反应,尤以瘰疬分枝杆菌、乌胞内分杆菌2型及9型、副结核分枝杆菌以及牛分枝杆菌等交叉严重。提示:在牛结核及副结核的检疫中出现其它分枝杆菌干扰的假阳性反应。     

副结核分枝杆菌McAb的某些特性鉴定

以超声波粉碎的副结核分枝杆菌地方株Ｃ２抗原免疫Ｂａｌｂ／ｃ小鼠，经与ＮＳ－１骨髓瘤细胞三次融合，获得了３株能稳定分泌抗副结核分枝ＭｃＡｂ的杂交瘤细胞系，其染色体数目为７８－１１０条，分别为ＩｇＭ和ＩｇＧ２。应用间接ＥＬＩＳＡ法测定细胞培养液，腹水和血清效价为１０＾－２～１０＾－７。交叉试验证明，ＭｃＡｂＯ１与受试的各株副结核分枝杆菌反应强烈，与牛分枝杆菌和草分枝杆菌有微弱特异性抗原之一。ＳＤＳ－Ｐ     

口蹄疫病毒3AB试剂盒的检测及比较

以重组口蹄疫病毒非结构蛋白3AB为检测抗原,研制了口蹄疫病毒非结构蛋白ELISA检测试剂盒,该试剂盒可用于判定被检动物是否感染口蹄疫病毒。重组口蹄疫病毒非结构蛋白3AB作为检测抗原包被酶标板反应孔,以辣根过氧化物酶标记的重组蛋白A/G作为第二抗体,建立了抗非结构蛋白抗体检测的方法。结果表明,在1 746份免疫猪血清中,3AB-ELISA对免疫猪血清的特异性为98.68%;在1 077份健康非免疫猪血清中,3AB-ELISA对健康非免疫猪血清的特异性为98.68%;在36份人工感染猪血清中,3AB-ELISA对阳性检出率为100%。而牛的特异性的各项指标和阳性检出率分别为94.04%,97.96%和100%。猪/牛口蹄疫病毒非结构蛋白酶联免疫吸附试验检测试剂盒与国外同类试剂盒比较,阳性检出率高出12.5个百分点。     

牛布鲁菌与牛分枝杆菌双重PCR方法的建立及应用

根据GenBank中已发表的流产布鲁菌种特异的omp25基因序列及牛分枝杆菌特异保守的16S rRNA加工蛋白rimM基因序列设计了2对特异性引物,通过对PCR条件的优化,建立了快速鉴别检测牛布鲁菌Brucella abortus和牛分枝杆菌Mycobacterium bovis的双重PCR方法.对建立的方法进行特异性和敏感性试验,结果显示,在牛布鲁菌和牛分枝杆菌中分别扩增出448、269 bp的特异性目的条带,作为对照的大肠杆菌Escherichia coli、沙门菌Salmo-nella typhimurium、八叠球菌Sarcina lutea、金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus、巴氏杆菌Pasteurella multocida、军团菌Legionella pneumophila、枯草杆菌Bacillus subtilis及溶血性链球菌Streptococcus pneumonia均未扩增出任何条带.牛布鲁菌和牛分枝杆菌的DNA最低检出量均为10 pg;牛奶样品中人工污染的牛布鲁菌和牛分枝杆菌的检测敏感性分别为7.9×103CFU/mL、3 ng/mL.     

BA—Dot—ELISA检测牛结核血清抗体的研究

利用BA—Dot—ELISA检测72份结核变反阳性牛血清,阳性率为69.5％,比常规ELISA(44.4％)高。用该法检测布鲁氏菌病、粘膜病、传染性鼻气管炎、白血病病牛血清及堪萨斯分枝杆菌、偶发分枝杆菌高免牛血清均无交叉反应,但对50份副结核变反阳性牛血清出现了一定的交叉。该法重复性好,简便快速,结果判定不需特殊仪器。     

PPA-ELISA与常规方法诊断奶牛结核病的比较研究

应用Mycobacterum bovis SAg_2抗原的PPA—ELISA检测了32例奶牛血清样本,其中20例呈阳性反应,12例阴性反应。应用牛PPD变态反应检查这20例ELISA阳性奶牛,全部呈阳性反应,另12例则为阴性反应。病理学检查,20例中18例发现结核病理变化,细菌学检查,其中17例呈阳性反应,另12例阴性奶牛,经病理学,细菌学检查,全部阴性。     

牛巴贝斯虫GST-MSA-2c融合蛋白抗象间接ELISA检测方法的初步建立

以纯化的牛巴贝斯虫GST-MSA-2c融合蛋白作为检测抗原,通过优化ELISA反应条件,初步建立了检测牛巴贝斯虫血清特异性抗体的间接ELISA方法。方阵试验确定的GST-MSA-2C抗原的最适包被浓度为2.5μg／mL,血清最佳稀释倍数为20倍,ELISA阳性反应的临界值为OD450≥0.347,批内和批间重复试验的变异系数均小于10％。经对多例血清检测表明,所建ELSIA检测法重复性好、特异性强、灵敏度高。     

蓝舌病多克隆抗体C-ELISA检测方法的建立和比较研究

 为建立一种检测成本低、操作简便的蓝舌病血清抗体监测方法,本研究通过制备群特异性的蓝舌病多克隆检测抗体和优化抗原固定技术,建立了蓝舌病多克隆抗体C-ELISA检测方法。通过对150份牛羊已知阴性血清的检测确定该检测方法的cut-off值为40%;对58份已知阳性血清样品同时进行中和实验和C-ELISA检测,检测结果经SPSS软件进行t检测统计分析,Sig.（双侧）=0.651,相关性0.912,相关性显著。对24个BTV血清型阳性血清,2份牛BVD阳性血清,2份羊口蹄疫阳性血清,2份羊痘阳性血清进行检测。结果表明,24个BTV血清型阳性血清为阳性,其他血清全部为阴性。对150份已知阴性血清和55份已知阳性血清用中和试验、美国VMRD 公司试剂盒和本方法分别进行检测。结果表明,本检测方法与中和试验检测结果符合率达100%,进口试剂盒符合率为96.7%。     

酮病对荷斯坦奶牛抗氧化系统和一氧化氮含量的影响

[目的]研究新疆荷斯坦奶牛酮病血清中的部分生化指标的变化及其酮病致病机理的探讨。[方法]以新疆荷斯坦奶牛为试验动物,用酮粉法和改良的水杨醛检测法对其血清进行检测,应用硝酸还原酶法测定血清中一氧化氮(NO)含量和一氧化氮合酶(NOS)活性;应用DTNB显色法测定血清中GSH-Px活力,应用黄嘌呤氧化法测定血清中T-SOD活力,应用硫代巴比妥酸法测定血清中MDA含量。[结果]酮病奶牛血清中GSH-Px活力极显著降低(P0.01),T-SOD活力显著降低(P0.05),血清中MDA含量显著增高(P0.05);对照组奶牛血清中的NO含量和NOS活性均显著高于阳性组。[结论]酮病不但影响奶牛的抗氧化系统而且也会降低一氧化氮含量和一氧化氮酶的活性,对于揭示奶牛酮病的发生机理具有重要意义。     

荷斯坦奶牛和藏系绵羊不同怀孕期血清骨型碱性磷酸酶活性的测定

[目的]探讨奶牛和绵羊血清骨型碱性磷酸酶活性在不同怀孕期的变化。[方法]采用磷酸苯二钠法,对33头荷斯坦奶牛和29只藏系绵羊不同怀孕期血清碱性磷酸酶活性及其酶保存率进行了测定。[结果]所有奶牛和绵羊血清碱性磷酸酶活性均在正常范围内,但奶牛怀孕中期的碱性磷酸酶活性比未怀孕、怀孕前期、怀孕后期明显降低(P<0.05);碱性磷酸酶保存率均低于26%,表明奶牛和绵羊血清碱性磷酸酶均来自骨骼。[结论]奶牛和绵羊血清骨型碱性磷酸酶活性在怀孕中期呈下降趋势。     

壳聚糖对奶牛隐性乳房炎血清蛋白质的影响

为研究壳聚糖对隐性乳房炎奶牛血清蛋白质含量的影响,选择体重、胎次、泌乳期、泌乳量相近的隐性乳房炎奶牛30头,随机分成5组,每组6头。组成对照组和试验1、2、3、4组。每天在各组奶牛的基础日粮中分别添加0g、10g、20g、40g、80g壳聚糖,连续饲喂两周,每周每头定期采集静脉血约10ml,测定血清中总蛋白、白蛋白、球蛋白的含量。结果表明,试验1、2组血清总蛋白和白蛋白有升高趋势,但差异均不显著(P>0.05),而3、4组均显著升高(P<0.05),其中试验4组总蛋白差异极显著(P<0.01)。结论:壳聚糖能够提高血清总蛋白和白蛋白的含量,有利于恢复患病奶牛的血浆胶体渗透压,增强机体抗病能力,促进康复过程。其用量以40￣80g/(d·头),持续两周以上为宜。     

几种人工牛黄新配方与天然牛黄护肝作用的比较

用比较药理学研究方法，在同等条件下，对人工件黄新配方Ｈ、Ｉ和Ｊ与牛黄（天然、人工）在护肝作了步比较观察，结果表明：人工牛黄、新配方Ｈ、Ｉ和Ｊ都具有降低ＣＣＩ４诱发小鼠血清谷丙转氨酶升高的作用；新配方Ｈ和Ｉ还具有降低Ｄ－半乳糖胺诱发小鼠血清谷丙转氨酶升高的作用。     

双翅目昆虫侵袭对奶牛内分泌的影响

[目的]揭示双翅目昆虫侵袭时奶牛血清中激素的变化规律。[方法]选择9头成年健康的荷斯坦奶牛作为试验牛,按不同泌乳阶段分3组,采用个体跟踪法观察并记录侵袭试验牛双翅目昆虫的数目,自尾静脉无菌采血,提取血清,采用放射性免疫法和荧光分光光度法测定血清中AGTH、COR、PRL、GH和NE的水平。[结果]在双翅目昆虫开始侵袭的6月,血清中ACTH和COR含量较高,在双翅目昆虫频繁侵袭的7月奶牛血清中ACTH和COR水平下降,一直持续至9月。在昆虫活动嚣张期,血清中GH和PRL水平显著降低（P〈0．05）,但NE水平明显提高,9月开始下降。[结论]该研究为制定缓解昆虫应激的技术措施提供了理论依据。     

饲料中添加不同水平的锌、硒、铜对奶牛奶量、乳品质及相关血清酶的影响

采用三因素,三水平,按L9(34)正交设计。进行了奶牛饲粮中添加不同水平(高、中、低)的Zn,Se,Cu饲喂试验。结果表明,补饲牛的健康良好,换毛提早,受孕率增高,日平均产奶量明显提高,乳品的乳蛋白。乳糖含量、乳脂率等乳品质量指标均有不同程度的增加。血清铜氧化酶和碱性磷酸酶活性,补饲牛比对照牛高,补饲后比补饲前高。