草鱼MHCⅡα基因cDNA的克隆与组织表达分析

采用快速扩增cDNA末端方法,获得1007bp草鱼MHCⅡα基因全长eDNA片段,序列包括717bp的开放阅读框、34bp的5’端非编码区以及256bp的3’端非编码区．氨基酸序列比对和同源性比较分析结果表明,草鱼MHCⅡα与鲤鱼MHCⅡα相似性最高,为79％,与斑马鱼的相似性为75％,与人的相似性最低,为34％．RT-PCR组织表达分析,MHCⅡα基因在正常草鱼组织中除了肌肉中没有扩增出MHCⅡα基因转录本外,在所检测的其他组织中都有不同程度的表达,其中脾脏、头肾有较强的表达,血液有中等程度的表达,肝脏、眼与肌肉相对表达较弱．     

草鱼hepcidin基因cDNA克隆、序列分析与表达

运用RT-PCR和快速扩增cDNA末端(rapid amplication ofcDNA Ends,RACE)技术获得草鱼(Ctenopharyngodon idellus)hepcidin基因全长cDNA,为774 bp,包括ORF 282 bp、5’UTR 117 bp和3’UTR 383 bp,3’UTR存在1个多聚腺苷酸加尾信号(AATAAA)和1个mRNA不稳定基序(ATTTA)。推定编码93个氨基酸,与其它鱼类hepcidin的序列同一性为27.9%～51.6%;SignalP 4.0软件预测信号肽位于1～24位。在邻接(neighbor-joining,NJ)法构建的系统进化树中,草鱼hepcidin前体肽和其他已报导的鱼类hepcidin前体肽聚为一枝。实时定量PCR(quantitative real-time polymerasechain reaction,qPCR)检测结果显示hepcidin基因mRNA主要表达于肝脏、脾脏、头肾和眼等组织;柱状黄杆菌注射后4～48 h,hepcidin基因在肝脏、脾脏和头肾中表达均显著上调。研究亮点:克隆到草鱼抗菌肽hepcidin一个新基因的全长cDNA,阐明了其所编码的hepcidin与其它脊椎动物hepcidin具有类似的结构与功能;证明其广泛分布于各组织中,参与了对细菌的免疫应答,是固有免疫的重要组成部分。     

草鱼CRP基因全长cDNA的克隆及其表达分析

利用草鱼C-反应蛋白(CRP)的EST序列(CK233056)设计引物,采用快速扩增cDNA末端(SMART-RACE)的方法克隆CRP基因的5′末端,获得1个约520 bp的cDNA片段.将该片段与EST拼接,得到CRP基因全长cDNA,长度为889 bp,含有1个672 bp的开放阅读框,两侧分别有74 bp和143 bp的5′和3′非翻译区域(open reading frame, ORF),CRP基因编码224个氨基酸残基,N端含有15个氨基酸残基的信号肽.利用RT-PCR半定量法对健康及被嗜水产气单胞菌人工感染的草鱼的心脏、脑、前肠、肾脏、肝胰脏、肌肉、脾等组织CRP的mRNA表达水平进行检测,结果表明,CRP基因在7种组织中均有表达,表达水平差异不明显.在人工感染24 h后,各组织中CRP的mRNA水平平均升高5倍左右,与哺乳动物和一些鱼类在炎症反应中血清CRP水平升高一致,而人工感染48 h后,除心脏和肌肉组织中有显著降低外,其他组织没有明显变化,仍维持较高水平.     

草鱼MyoD cDNA的克隆和序列分析

 用RACE技术从受精后约22 h的草鱼胚胎总RNA中扩增获得了草鱼MyoD基因的全序列,并对其序列进行了分析。结果表明，草鱼MyoD基因全长cDNA为1 597 bp,其中开放阅读框为825 bp，共编码275个氨基酸，结构分析表明该肽链第1～84个氨基酸为草鱼MyoD基因的Basic区,第98～142个氨基酸为草鱼MyoD基因的HLH结构域，该序列所编码的肽链没有信号肽；通过对比分析已知的GeneBank中其它脊椎动物MyoD基因发现，该基因编码的氨基酸肽链随动物由低等向高等进化有加长的趋势,且核苷酸以及推测的氨基酸同源性和动物之间的亲缘关系相一致；草鱼MyoD基因的克隆为研究家鱼的肌肉发育调控的机理以及肉质改良奠定了基础。     

草鱼Pim-1基因克隆、组织表达及多克隆抗体的制备

【目的】旨在进一步研究草鱼（Ctenopharygodon idella）莫洛尼鼠白血病病毒前病毒整合基因1(Proviral integration of moloney murineleukemia virus, Pim-1)的功能。【方法】采用RACE法克隆草鱼Pim-1(CiPim-1)的全长cDNA序列,并对其全长序列进行生物信息学分析。采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测CiPim-1在健康草鱼肝脏、肾脏、头肾、脾脏、肠、心脏、鳃、皮肤、肌肉及血液中的相对表达量,同时将CiPim-1基因（246～318 aa）片段克隆到原核表达质粒pGEX-4T-1中,转入E. coli Rosetta菌株,经IPTG诱导后成功表达重组蛋白pGEX-4T-1-Pim1,随后采用纯化后的融合蛋白免疫新西兰大白兔获得抗血清,并通过ELISA测定抗血清效价,最后采用免疫印迹（Western Blotting）分析抗体的特异性。【结果】CiPim-1基因序列全长1 082 bp,编码318个氨基酸,分子量为36.14 ku,具有1个蛋白激酶结构域（Protein kinase domain...     

牡丹PoCCS1基因的克隆与表达分析

铜/锌超氧化物歧化酶铜伴侣基因(copper chaperone for superoxide dismutase,CCS)负责将铜离子转运至Cu/Zn-SOD,从而激活SOD酶活性,参与植物活性氧清除,在植物抗逆中发挥重要作用。研究旨在克隆牡丹PoCCS1基因,并对基因序列特征、组织表达模式、盐胁迫和干旱胁迫下的表达模式、不同牡丹品种氧化胁迫下的表达模式进行分析,为深入研究PoCCS1在牡丹非生物胁迫响应中的功能奠定基础。利用RT-PCR技术克隆‘凤丹’PoCCS1基因(GenBank登录号:MZ574405),利用生物信息学方法分析PoCCS1序列特征,利用实时荧光定量PCR (qRT-PCR)分析PoCCS1的表达模式。结果表明,PoCCS1基因编码区全长为996 bp,编码蛋白含331个氨基酸,相对分子量为34.98 ku,包含植物CCS蛋白的3个典型结构域,进化分析表明PoCCS1与多种植物的CCS同源性较高,且与葡萄VvCCS亲缘关系最近;PoCCS1在‘凤丹’的根、茎和叶中表达水平相近,‘凤丹’盐胁迫8 h后,PoCCS1在叶片和根中的表达受到显著诱导,干旱胁迫8 h后,PoCCS1在叶片中的表达下调,根中表达无显著变化;4个抗氧化能力不同的牡丹品种‘鲁荷红’‘凤丹’‘香玉’和‘乌云集盛’氧化胁迫处理后PoCCS1表达模式差异显著,随处理时间增加,在抗氧化能力强的‘乌云集盛’和‘香玉’中PoCCS1的表达显著上调并在处理4 h后保持较高水平,在抗氧化能力较弱的‘凤丹’中表达稳定,在抗氧化能力最弱的‘鲁荷红’中先升后降并在处理4 h后显著下调。综上,PoCCS1基因编码蛋白具有植物CCS的完整典型结构,可能参与牡丹响应盐胁迫和干旱胁迫,并可能与不同牡丹品种抗氧化能力差异相关。     

草鱼转铁蛋白受体cDNA序列克隆及其组织表达差异

根据斑马鱼血清转铁蛋白受体(TfR)序列(NM_001009918)设计并合成一对引物,提取草鱼肝脏组织总RNA,RT-PCR扩增获得草鱼TfR cDNA部分序列873bp,获得GenBank登陆号为FJ613322.将测序结果用DNAman软件与斑马鱼的序列进行比对,发现核苷酸同源性为84%,氨基酸同源性为81%.利用半定量RT-PCR技术检测TfR草鱼脂肪、肌肉、肠、脑、黏液、性腺、鳔、肝脏、心脏、脾脏、鳃、鳍12种组织的表达差异结果表明,TfR在草鱼12种组织中均可表达,其中在脑与鳍中表达量最高,但与在心脏、性腺中的表达量无显著差异(P0.05),在黏液与鳔中表达量最低,二者之间无显著差异(P0.05).     

草鱼细胞凋亡抑制蛋白基因cDNA的克隆与表达分析

利用快速扩增cDNA末端(rapid amplification cDNA end, RACE)技术获得草鱼细胞凋亡抑制蛋白基因全长cDNA序列为2 093 bp,含有1个1 944 bp的开放阅读框,5′非编码区长25 bp,3′非编码区长124 bp,可编码647个氨基酸.生物信息学分析表明,在IAP的N端无氨基酸残基组成的信号肽;与斑马鱼的同源性最好,其次是斑猫鲿;在系统进化上,与斑马鱼、斑猫鲿共聚为1支.用半定量RT-PCR分析正常及细菌诱导下草鱼细胞凋亡抑制蛋白基因在不同组织中的表达分布,正常情况下,凋亡抑制蛋白基因在所取的7种组织中均有表达,其中脑、肠和肾表达最高,肝和心脏次之,鳃和肌肉最低,但差异不显著;用嗜水气单胞菌人工感染24 h后,所有组织中的IAP mRNA水平平均降低约26%,以肝脏和肌肉降低较为明显,在感染48 h后,所有组织中的IAP mRNA水平平均升高约4%,其中心脏、肝脏和鳃分别升高8%、16%、19%,这表明草鱼细胞凋亡抑制蛋白可能参与了机体对嗜水气单胞菌感染的免疫应答.     

草鱼TGF-β1、Smad4基因的克隆及真核过表达和RNA干扰表达载体的构建

为研究TGF-β1/Smad4信号通路在草鱼(Ctenopharyngodon idellus)肌肉发育过程中的作用机制,首先克隆了草鱼TGF-β1、Smad4基因开放阅读框(ORF,Open reading frame)序列各1 134和1 644bp。其次,在TGF-β1、Smad4序列两端分别加上相应的酶切位点,同时对pcDNA3.1(+)真核表达载体进行双酶切,将带酶切位点的片段正向插入到真核表达载体pcDNA3.1(+)中,构建TGF-β1、Smad4基因的真核过表达载体pcDNA3.1(+)-TGF-β1、pcDNA3.1(+)-Smad4。另一方面,根据TGF-β1、Smad4基因序列全长分别设计3对长度为48bp的shRNA,然后将构建好的shRNA插入到载体pRNA-U6.1/Neo中,即可成功构建TGF-β1、Smad4基因的RNA干扰表达载体pRNA-U6.1/Neo-TGF-β1和pRNA-U6.1/Neo-Smad4。     

人pot1基因cDNA的克隆及其在HeLa细胞中的表达

目的：克隆人端粒保护蛋白（human proteetlon of telomeres 1.pot1）基因cDNA全编码区,构建成真核表达质粒并实现在HeLa细胞中的表达。方法：RT-PCR法扩增出HeLa细胞hpot1基因cDNA编码区全序列,定向克隆至真核表达载体pcDNA3,阳性重组质粒经插入片段测序验证;重组的pcDNA3-hpot1质粒瞬时转染HeLa细胞,RT-PCR和EMSA法（电泳迁移率改变分析）检测hpot1基因的表达水平。结果：来自Hela细胞的hpot1基因cDNA编码区全序列构建成的真核表达质粒pcDNA3-hpot1,经测序分析序列和ORF正确;该重组质粒转染在HeLa细胞48h后,hpot1基因表达水平增高。结论：真核表达载体pcDNA3-hpot1构建成功,并实现了hpot1在Hela细胞中的表达。     

微囊藻毒素-LR对草鱼肝脏超微结构的亚急性毒性影响

微囊藻毒素-LR(microcystin-LR, MC-LR)是一种由蓝藻水华产生的环状肝毒素,对鱼类存在不可忽视的影响.草鱼(Ctenopharyngodon idella)经腹腔注射MC-LR(纯度>98%,50 μg/kg体重),在注射后1、2、7、14和21 d采集肝脏样品,用透射电镜的方法研究发现,MC-LR除可导致线粒体水肿、内质网扩张外,还可引起草鱼肝脏细胞连接间隙增宽,胆汁淤积,炎性细胞浸润,细胞质中大量脂滴及脂褐素、溶酶体增多等一系列的病变;但在注射MC-LR 21 d后草鱼肝脏细胞连接又基本恢复正常.结果表明,MC-LR在低剂量下除了对膜系结构存在影响外,对细胞连接间隙等还存在影响,然而随着时间的延长,这些病变可逐渐修复.     

不同地理来源草鱼群体杂交后代的生长性能分析

[目的]该研究旨在评估10个不同地理来源草鱼群体(佛山群体、肇庆群体、荆州群体1、荆州群体2、荆州群体3、鄂州群体、益阳群体、长沙群体1、长沙群体2和江苏群体)杂交后代的生长性能.[方法]以该10个群体为亲本构建了15个杂交组合进行同塘生长对比.对4月龄、7月龄、8月龄、10月龄、12月龄、15月龄和18月龄的杂交组合后代的体质量进行测量.以4月龄体质量为协变量,运用协方差分析对不同杂交组合后代进行生长性能分析.[结果]在18月龄时荆州群体2♀×佛山群体♂杂交组合后代平均体质量最高,为1 892.90 g,比其他杂交组合平均体质量分别高3.51％～32.36％.经多重比较分析结果显示,荆州群体2 ♀×佛山群体♂和荆州群体1♀×佛山群体♂杂交组合后代的体质量显著高于其他杂交组合(P＜0.05).[结论]生产上,应用这2个具有生长优势的组合生产优质苗种进行推广,可大幅度提高渔民的经济效益,另外该结果可为快速生长草鱼核心群体的确定奠定基础.     

不同地理来源草鱼群体杂交后代的生长性能分析（英文）

[目的]该研究旨在评估10个不同地理来源草鱼群体(佛山群体、肇庆群体、荆州群体1、荆州群体2、荆州群体3、鄂州群体、益阳群体、长沙群体1、长沙群体2和江苏群体)杂交后代的生长性能。[方法]以该10个群体为亲本构建了15个杂交组合进行同塘生长对比。对4月龄、7月龄、8月龄、10月龄、12月龄、15月龄和18月龄的杂交组合后代的体质量进行测量。以4月龄体质量为协变量,运用协方差分析对不同杂交组合后代进行生长性能分析。[结果]在18月龄时荆州群体2♀×佛山群体♂杂交组合后代平均体质量最高,为1 892.90 g,比其他杂交组合平均体质量分别高3.51%~32.36%。经多重比较分析结果显示,荆州群体2♀×佛山群体♂和荆州群体1♀×佛山群体♂杂交组合后代的体质量显著高于其他杂交组合(P<0.05)。[结论]生产上,应用这2个具有生长优势的组合生产优质苗种进行推广,可大幅度提高渔民的经济效益,另外该结果可为快速生长草鱼核心群体的确定奠定基础。     

肠道菌群与草鱼个体大小相关性研究

[目的]探讨草鱼肠道菌群与草鱼个体大小之间的相关性。[方法]采用DGGE方法对同一批孵化并在同一池塘中养殖的个体大小显著差异的草鱼肠道样品进行分析。[结果]无论大个体草鱼还是小个体草鱼,其肠道优势菌群均为厚壁菌门和变形菌门,但2组草鱼在其肠道菌群的结构和多样性等方面存在差异。大个体草鱼肠道中存在着更多比例的厚壁菌门以及具有纤维素降解能力的细菌,而小个体草鱼肠道中存在较多的潜在致病菌。[结论]草鱼肠道微生物可以作为内在因素影响草鱼的生长性能,这一结果也为进一步开发可促进草鱼生长性能的益生菌奠定了研究基础。     

戊糖乳杆菌R1对草鱼幼鱼养殖水体和肠道菌群的影响

[目的]进一步评价戊糖乳杆菌R1作为益生菌的应用效果。[方法]在草鱼幼鱼中投喂添加由单一戊糖乳杆菌R1制备的微生态制剂和黄霉素,在60 d的投喂期内,采用平板计数法检测好氧性异养菌的总数、总弧菌数和戊糖乳杆菌R1的数量。[结果]结果表明,在投喂菌液和冻干菌粉后,养殖水体和草鱼肠道的戊糖乳杆菌R1数均呈上升趋势,在30 d后数量达到稳定并在肠道内定植;由于戊糖乳杆菌R1的抑制作用,弧菌的数量下降,以肠道中的弧菌最明显;乳酸菌对养殖水体和草鱼肠道的好氧性异养菌没任何影响;乳酸菌对养殖水体和肠道菌群的影响与抗生素具有相近的效果。[结论]乳酸菌作为饲料添加剂可以取代抗生素应用在草鱼的养殖中。     

氧化鱼油对草鱼幼鱼磷酸酶和转氨酶活性的影响

为研究不同程度的氧化鱼油对草鱼幼鱼体内2种磷酸酶及2种转氨酶活性的影响。选取平均初始体质量为(30.0±2.6)g的健康草鱼幼鱼204尾,随机分成4组,每组3次重复。在草鱼幼鱼饲料中分别添加不同鱼油,分别为对照组(新鲜鱼油,过氧化值4.54 mmol/kg)及鱼油氧化程度逐渐加深的3个氧化鱼油组(OX1过氧化值24.86 mmol/kg,OX2过氧化值72.32 mmol/kg,OX3过氧化值172.73 mmol/kg)。试验58 d后取样,分别测定草鱼幼鱼血清、肝胰脏、脾脏、肾脏等组织中碱性磷酸酶(AKP)、酸性磷酸酶(ACP)、谷草转氨酶(AST)及谷丙转氨酶(ALT)活性,并计算血清和肝胰脏AST/ALT值。结果表明:与对照组相比,3个氧化鱼油组肝胰脏和脾脏中AKP活性显著升高(P0.05),OX3组血清及OX1、OX2组肠道中AKP活性显著升高(P0.05);OX2组肝胰脏和脾脏中ACP活性显著升高(P0.05)。与对照组相比,OX3组血清、OX2组肝胰脏及OX2、OX3组肠道中AST活性显著升高(P0.05),而OX3组肾脏中AST活性显著降低(P0.05);OX1、OX2组背肌及OX2、OX3组肠道中ALT活性显著升高(P0.05);OX3组血清和肝胰脏中AST/ALT值显著升高(P0.05)。综上所述,氧化鱼油对草鱼幼鱼血清及不同组织中的AKP、ACP、AST及ALT活性变化存在较大差异;同时随着鱼油氧化程度加深,草鱼幼鱼各组织细胞受损,免疫功能降低。     

铁观音茶树RING型E3泛素连接酶基因克隆及其干旱胁迫下的表达分析

以铁观音茶树为试材,对其中E3泛素连接酶基因进行克隆和生物信息学分析,并采用qPCR进行不同干旱条件下的定量表达分析。研究结果表明,该序列全长为1 138bp,开放阅读框(ORF)为810bp,编码269个氨基酸(GenBank登录号KR819177)。生物信息学分析发现该铁观音茶树E3泛素连接酶基因不含跨膜结构以及信号肽,具有多个磷酸化位点,亚细胞定位于叶绿体中。经BLAST比对,该基因编码的氨基酸序列与烟草、亚麻荠、葡萄、醉蝶花、芜菁中的E3泛素连接酶基因编码的氨基酸序列分别有51%、50%、50%、50%和49%的同源性,且相关保守功能结构域翻译的蛋白质序列具有RING-finger结构,初步确定该基因为铁观音茶树的E3泛素连接酶基因。qPCR分析结果显示在不同干旱胁迫处理下铁观音茶树的E3泛素连接酶基因的表达量,与对照组相比显著增加。本研究认为铁观音茶树RING型E3泛素连接酶基因参与茶树抗旱响应机制。     

南方鲇摄食不同含量纤维素和草鱼肠后的代谢反应

[目的]研究鱼类生化SDA(特殊动力作用)和机械SDA的大小。[方法]在水温25℃条件下用草鱼肠衣(0.25 g)包埋的方法测定了南方鲇摄食不同含量(0.25、0.75和1.5 g)纤维素和能量(草鱼肠)后的代谢反应。[结果]摄食不同食物后南方鲇代谢出现先迅速上升然后缓慢回落的过程,食物纤维素导致SDA时间的延长和SDA总耗能量的增加,但不同纤维素组间没有差异,摄食代谢峰值不受食物纤维素的影响;随着摄食草鱼肠重量的增加SDA时间、摄食代谢峰值和SDA总耗能量均线性上升。[结论]南方鲇摄食代谢主要由生化SDA构成,与食物可利用能量密切相关而与体积相关不大。     

草鱼不同类群淋巴细胞的分离及鉴定

用白细胞分离分质Histoque-1077将草鱼外周血液中淋巴细胞分离后，依据它们对尼龙毛的粘附特性分为粘附性细胞和非粘附性细胞两个类群。分别检测分离前、后的淋巴细胞的细胞表现超微结构、α-醋酸萘酯酶活性及膜表面球蛋白。结果表明：表面粗糙细胞、α-醋酸萘酯酶阳性细胞和膜表面球蛋白阳性（SIg)细胞在外周血液总淋巴细胞中的比例分别为47．8％、15．2％和53．8％，在粘附性淋巴细胞中的比例分别为82．3％、0．1％和76．2％，在非粘附性淋巴细胞中的比例为18．3％、24．2％和25．5％。