利用搭桥PCR技术对蛋白质内含子HP进行改造(英文)

[目的]利用搭桥PCR技术对蛋白质内含子HP进行改造。[方法]根据搭桥PCR中寡聚核苷酸链之间重叠的部分互相搭桥、互为模板的原则设计多对引物,通过多次PCR扩增获得目的基因片段,进而实现对蛋白质内含子HP在基因水平上进行多个位点同时定点突变和添加Linker。[结果]搭桥PCR产物克隆经DNA测序分析,证明蛋白质内含子HP内部的4个半胱氨酸成功突变成丝氨酸,几个PCR前体片段也无缝的融合成HP基因片段,而且没有引进任何其他突变;经DNA测序,46bp的DNALinker成功的插入到设计好的HP基因序列中,且没有任何碱基突变和错配。[结论]该研究不仅实现了对蛋白质内含子HP的快速改造,而且扩大了搭桥PCR的应用范围,同时也为蛋白质内含子的基础改造提供了低成本、简捷、高效的方法。     

基于dnaJ基因的弧菌PCR检测方法

[目的]建立一种能扩增dnaJ基因全长的PCR检测方法,为弧菌的快速筛查及种类鉴定提供技术支持.[方法]以弧菌dnaJ基因为靶基因,在其首尾的保守区域设计一对简并引物,经优化退火温度和引物浓度,建立能扩增弧菌接近全长dnaJ基因的PCR检测方法,并通过特异性试验、灵敏度试验和临床应用评价等验证其适用性.[结果]优化后的PCR反应体系50.0 μL:2×F8 FastLong PCR MasterMix 25.0 μL,上、下游引物(20 μmol/L)各2.0 μL,DNA模板5.0 μL,灭菌水补足至50.0 μL.扩增程序:94℃预变性3 min;94℃ 10 s,55℃ 15 s,72℃ 15 s,进行35个循环;最后72℃延伸5 min.该PCR检测方法对副溶血弧菌、哈氏弧菌、创伤弧菌、河流弧菌、溶藻弧菌、拟态弧菌、霍乱弧菌和栖黑海弧菌等8种弧菌属细菌具有很强的特异性,对弧菌的最低检出限为102CFU/mL.应用建立的PCR检测方法对51株分离自海水样品的弧菌和32株分离自对虾样品的弧菌进行检测,结果显示全部为阳性,其中,海水样品中包括有副溶血弧菌、溶藻弧菌、创伤弧菌、河流弧菌、哈氏弧菌和栖黑海弧菌,对虾样品中包括副溶血弧菌、溶藻弧菌、创伤弧菌、河流弧菌和哈氏弧菌;经测序及同源性比对分析发现,种间菌株的dnaJ基因序列相似度为79.5%~92.8%,种内菌株间的dnaJ基因序列相似度为98.2%~99.9%.[结论]基于dnaJ基因建立的弧菌PCR检测方法能扩增出弧菌接近全长dnaJ基因,具有快速便捷、灵敏准确、适应性好等优点,结合测序技术,可为弧菌快速筛查及种类鉴定提供更全面和更准确的技术手段.     

志贺菌ipaH基因PCR检测方法的建立及应用

为了掌握青海省4种食源性动物体内志贺菌的分布情况,针对志贺菌属侵袭性质粒抗原H基因(invasive plasmid,ipaH)设计1对特异性引物,建立志贺菌的PCR检测方法,优化反应体系,检测该方法的敏感性和特异性,并将该方法应用于临床样本检测。结果表明,建立的PCR方法能特异性扩增志贺菌ipaH基因,而沙门氏菌、大肠杆菌、葡萄球菌、枯草杆菌、变形杆菌等均未扩增出条带;最低检测限值为1.8 pg/μL。在临床样本检测中,100株疑似菌株的阳性率为62.00%,其中牦牛源75.00%(3/4),鸡源35.29%(12/34),羊源44.44%(8/18),猪源88.64%(39/44);新鲜鸡粪和羊粪的阳性率分别为91.67%(11/12)和90.91%(10/11)。这说明试验所建立的PCR方法具有良好的敏感性和特异性,可应用于志贺菌的实验室诊断;4种动物体内均不同程度带菌,在临床诊断和治疗时不可忽视该菌的致病作用。     

CPT-I基因荧光定量PCR检测方法的建立

CPT-ImRNA的表达对研究奶牛肝脏脂肪酸氧化代谢具有重要作用,CPT-I在肝脏中脂肪酸从细胞浆转移到线粒体过程中起关键作用。本研究应用双标准曲线方法,建立了CPT-I基因的相对荧光定量方法。结果表明,所建立的SYBRGreenI荧光定量PCR方法检测CPT-I基因具有较好的效果,为肝细胞CPT-I基因定量分析奠定了基础。     

利用PCR进行基因定点突变方法的改进

本研究旨在对利用PCR进行定点突变的方法进行改进。设计1对含突变碱基对的互补引物,以插入目的外源基因的质粒为模板,经过20个循环的PCR扩增出质粒的全长序列之后,用氯仿抽提PCR产物,然后转化感受态细胞TOP10,通过测序验证阳性克隆。利用这种改进的方法可以简单、快速对质粒上的外源基因进行定点突变,降低了构建突变体的成本。     

鹅细小病毒vp3基因PCR检测方法的建立及应用

本试验根据GenBank上发表的鹅细小病毒B株基因序列,针对vp3基因设计并合成了一对特异性引物,建立GPV vp3基因的PCR诊断方法。结果表明,该方法扩增的产物与预期大小相符(约654bp),而其他相关病毒均为阴性反应,敏感度为12.4pg。对15份GPV疑似病例检出的阳性率为100%,而琼脂扩散试验(AGP)检出的阳性率为60%。证明建立的PCR方法特异性强、敏感性高,可用于临床病料的快速诊断。     

安氏隐孢子虫ITS-1基因PCR检测方法的建立

[目的]建立针对安氏隐孢子虫的PCR快速检测方法,为安氏隐孢子虫的检测和分子流行病学调查提供技术支撑.[方法]根据GenBank中安氏隐孢子虫的ITS-1基因序列设计1对特异性引物,建立基于ITS-1基因的PCR方法,并通过特异性试验、敏感性试验、临床检测以及与经典巢式PCR检测方法进行比较等,验证其可行性.[结果]基于ITS-1基因的PCR检测方法能扩增出安氏隐孢子虫的特异条带,而对猪源隐孢子虫、贝氏隐孢子虫、微小隐孢子虫、牛泰勒氏虫、牛巴贝斯虫、伊氏锥虫、食道口线虫的扩增结果均为阴性;将测序结果进行BLAST比对,发现其与GenBank中安氏隐孢子虫的同源性均在99%以上.敏感性最低可检测每克牛粪中5个卵囊;用于检测广西不同地区的1613份牛粪样品时,与经典巢式PCR检测方法相比,发现两者的阳性检出率均为11.72%,且吻合率达100%.[结论]安氏隐孢子虫ITS-i基因PCR检测方法具有快速、敏感、特异的特点,适用于安氏隐孢子虫的检测和分子流行病学调查分析.     

以PCR为基础的基因破坏技术在酿酒酵母中的应用

酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)是一种已知全序列的重要模式生物,具备单双倍体特性、乙醇耐受性强、高效体内重组的能力、可操作性强等优点.同时酿酒酵母是第一个完成基因组测序的真核生物,各种遗传操作技术业已成熟,因此它在基因操作和生物能源方面是首选的研究对象.以PCR为基础的基因破坏方法第一次在酿酒酵母中被报道后,其方法和技术得到了迅速的改进和发展,目前在酵母中已经广泛应用.文章主要介绍这种方法在酿酒酵母中应用的基本原理和研究方法,以及与其他传统基因破坏方法相比较的优缺点、存在的问题等.说明以PCR为基础的基因破坏方法能够避免繁琐的基因克隆操作,省时、省力、方便.     

利用梯度PCR和降落PCR扩增CIRP基因的比较

提取SD大鼠总RNA,同时应用降落PCR和梯度PCR在常规PCR反应体系和低模板浓度PCR反应体系中扩增CIRP基因片段,对两种方法的扩增效果进行比较。结果表明：降落PCR法可以通过一次反应即顺利扩增出CIRP基因特异性条带,并且在模板浓度降低后也能扩增出产物;梯度PCR法扩增结果不稳定,不但有非特异性条带出现而且不能...     

采用优化的数字PCR方法分析转基因小麦外源基因拷贝数

【目的】探索基于数字PCR的小麦基因拷贝数分析技术,提高目标基因拷贝数的分析通量,促进小麦基因组研究及基因工程研究。【方法】采用中国农业科学院作物科学研究所小麦抗逆分子育种课题组创制的高抗小麦黄花叶病转nib8小麦为试验材料,使用小麦D基因组中的单拷贝纯合内源基因PINb-D1b(籽粒硬度基因)为内参基因,根据转化的抗病基因nib8序列设计4对特异性引物及相应探针,通过试验确定探针和引物的最优浓度,优化体系的退火温度,寻找最合适的模板浓度。然后用数字PCR检测转nib8小麦中外源基因的拷贝数;同时用Real-time PCR和Southern blot 2种不同方法分析的拷贝数结果,验证上述采用数字PCR方法分析拷贝数的准确性;以PINb-D1b内参基因检测Wx012(蜡质基因)和SSII(淀粉合成基因)2个内参基因的拷贝数,以Wx012和SSII为内参基因检测转nib8小麦中外源基因的拷贝数,验证以PINb-D1b内参基因的检测结果准确性;在nib8的不同区段设计特异性引物来检测转nib8株系拷贝数分析结果是否有差异。最终,建立基于数字PCR技术的高通量检测小麦目标基因拷贝数的分析方...     

猪巨细胞病毒的PCR检测及其gB基因特征分析

根据GenBank登录的猪巨细胞病毒(PCMV)gB基因序列设计检测引物和全长gB基因引物,对来自湖南浏阳和江西景德镇不同养殖场的猪鼻拭子样品(51份)进行PCR检测,60.78%(31/51)的鼻拭子样品扩增出了260 bp的特异性条带.再以阳性样品为模板扩增全长gB基因,并将其克隆到pMD18-T载体,核苷酸序列测定和结果分析表明,所获得PCMVgB基因序列全长2 580 bp,编码860个氨基酸,与国外PCMV分离株的核苷酸同源性为97.6% ～ 98.9%,氨基酸同源性为97.0%～98.6%,且 PCMV可分为2个群:一群为中国湖南株、英国株和德国株,命名为A群;另一群为日本株、瑞士株和西班牙株,命名为B群.抗原表位优势、亲水性、表面可及性预测分析表明,PCMVgB蛋白是理想的免疫学抗原候选蛋白.     

猪源2型链球菌福建株CPS2J基因PCR检测及序列分析

设计并合成一对扩增2型猪链球菌CPS基因的特异性引物,以猪2型链球菌福建株DNA为模板,筛选最佳反应条件,建立检测CPS2J基因的PCR方法,并对PCR扩增产物进行序列测定和同源性比较分析。结果如下：应用该方法对猪2型链球菌福建株和标准阳性株进行扩增,均获得与预期大小一致的675bp特异性目的片段,而对8株非2型猪链球菌的扩增结果均呈阴性;敏感性测定最低可检出100cfu细菌量或50pg 细菌DNA;SS2PFJ06CPS2J 基因部分核苷酸及其推导的氨基酸序列与猪链球菌2型不同菌株的同源性分别达98.7%-100%和97.8%~100%。上述结果表明建立并优化的猪2型链球菌CPS2J基因的PCR检测方法敏感性好、特异性高,能用于2型猪链球菌的分子流行病学调查和快速检测; 序列分析表明猪2型链球菌福建株与国内外8株标准株之间同源性高、亲缘关系密切。     

特异性检测植物乳杆菌的多重PCR方法

【目的】建立特异性检测植物乳杆菌的方法,排除近缘菌的干扰。【方法】利用SMM系统筛选植物乳杆菌种特异序列,根据特异序列设计引物进行不同乳制品的多重PCR检测。【结果】设计的7对引物具有良好的种特异性,其中3对引物可以排除戊糖乳杆菌和副植物乳杆菌的干扰,可扩增获得植物乳杆菌的特异条带101bp（引物LP-1和LP-2）、189bp（引物LP-5和LP-6）、378bp（引物LP-9和LP-10）。该方法的检测限为2.2×10CFU/mL。采用多重PCR检测与琼脂糖凝胶电泳图谱分析对自制含有各种乳酸菌酸奶产品、自然发酵产品及市售酸乳产品中植物乳杆菌进行定性检测,可以特异性检测出植物乳杆菌,准确区分植物乳杆菌的近缘菌株。【结论】该多重PCR方法成本低、步骤简单、耗时短、灵敏度高,具有特异性,可作为快速检测植物乳杆菌种的方法在生产中使用。     

鼻气管鸟杆菌PCR诊断方法的建立与应用

根据GenBank已发表的鼻气管鸟杆菌(Ornithobacterium rhinotracheale,ORT)16S rRNA基因序列,设计1对可扩增671 bp目的片段的引物,建立了检测ORT的PCR方法.该方法能在ORT参考菌株中扩增到特异性片段,而鸡大肠杆菌、副鸡嗜血杆菌、鸡白痢沙门氏菌、禽多杀性巴氏杆菌的扩增结果均为阴性;敏感性试验表明该方法最低检出限量为90 pg DNA.表明所建立的PCR方法具有敏感性高、特异性强的特点.利用建立的方法对分离菌株进行检测,2株为阳性.     

菌落PCR技术在重组质粒筛选与鉴定中的应用

应用以菌落为模板的聚合酶链反应(PCR)技术,筛选插有酒类酒球菌苹果酸-乳酸酶基因mleA和苹果酸通透酶基因mleP序列的重组阳性克隆,筛选到的阳性克隆分别扩增到约1600bp及900bp的条带,且与两个目的基因片段大小一致。提取阳性克隆的质粒进一步进行双酶切(EcoR -Kpn )及质粒PCR鉴定,证明结果正确。菌落PCR技术的应用使重组质粒的筛选和鉴定得以优化和简化。     

鹦鹉热衣原体rrn操纵元序列双重PCR检测方法的建立

为快速检测鹦鹅热衣原体，基于鹦鹅热衣原体rrn操纵元序列（即16S-23S rRNA间隔区基因和23S rRNA基因序列）建立了双重PCR法，对100份临床标本进行检测，并与单一PCR法、免疫荧光法进行了比较。结果显示：双重PCR法特异性与敏感性均高于单一PCR法、免疫荧光法。双重PCR平均阳性检出率为83．496～97．296，敏感性为500fg／μL。结果显示鹦鹅热衣原体rrn操纵元序列双重PCR法不仅能够检测衣原体和非衣原体感染，而且能够同时实现鹦鹅热衣原体检测和鉴定，从而克服了单一引物应用时的不足，为未来鹦鹅热衣原体病分子流行病学调查及临床早期诊断提供了有效的检测手段。     

抗草甘膦转基因大豆PCR定量检测研究

试验建立大豆中转基因成分的定量测定方法。采用双链DNA SYBR Green I结合染料实时荧光定量PCR技术，扩增编码大豆凝集素的内参照基因lec和抗草甘膦转基因大豆中的外源花椰菜花叶病毒CaMV35s基因。绘制2种基因扩增的循环数一拷贝数标准曲线图，根据标准曲线方程计算样品中的转基因含量；并作重现性和熔解曲线分析。结果表明，lec和CaMV35s基因标准曲线方程线性好，R^2值分别达到0．9997和0．9992。不同转基因含量的标准及模拟大豆样品定量显示，实测值与实际值接近，相对偏差5％～11％。SYBR Green I实时定量PCR方法可用于定量测定大豆中转基因品种的含量。     

猪链球菌2型溶血素基因PCR快速检测方法研究

根据猪链球菌2型的溶血素(haemolysin)的基因序列设计一对引物,成功地扩增了溶血素基因,并建立了检测溶血素的PCR方法.用EcoRⅠ限制性内切酶进行酶切,获得了与预期大小一致的869 bp和633 bp的两个片段.同时另设计一对内引物,进行巢式PCR,亦能扩增出预期片段.PCR检测的敏感程度可达100个细菌;对马链球菌兽疫亚种、猪丹毒杆菌和猪放线杆菌等的PCR检测结果均呈阴性.表明建立的猪链球菌2型溶血素PCR检测方法,其特异性和敏感性均很高,可作为猪链球菌病快速诊断的方法.     

转基因大豆及其深加工产品的PCR检测

以PCR技术为基础,建立了从大豆及其深加工产品中检测转基因成分的方法。大豆及其深加工产品采用改良的CTAB法进行DNA提取纯化,大豆色拉油DNA则用试剂盒方法进行了提取纯化。对提取的DNA用PCR方法对大豆特异性内源基因lectin进行扩增,设计CaMV35启动子和NOS终止子特异性引物对其是否含有转基因成份进行初步的定性PCR筛选,并用抗除草剂基因CP4EPSPS对阳性结果进行确证。实验结果表明,改良的CTAB法对大豆深加工产品的DNA有很好的提取效果,而试剂盒方法对色拉油的DNA有良好的提取效果;PCR检测转基因的方法快速高效,检测结果与标准相符。