不同苹果品种抗苹果绵蚜的漆酶基因表达模式及其原核表达载体筛选

【目的】明确不同苹果品种漆酶基因在抗苹果绵蚜过程中的差异表达模式，探索原核表达苹果漆酶蛋白的方法与条件。【方法】基于转录组测序分析抗蚜品种新红星(Starkrimson)、小国光(Ralls Genet)与感蚜品种红富士(Red Fuji)3个苹果品种被苹果绵蚜为害0 h、12 h、5 d后漆酶基因的表达模式，筛选抗蚜候选漆酶基因；选择pET-28a(+)、pET-32a(+)、pGEX-TEV、pHAT2 4种载体，对4个漆酶基因MdLac23、MdLac6、MdLac7、MdLac2进行原核表达，对表达产物进行Western-Blot验证，镍柱亲和层析纯化，以ABTS为底物分析其酶活性。【结果】与对照相比，不同苹果品种被害12 h、5 d后，苹果枝条中漆酶差异表达基因数量为27个。不同苹果品种的漆酶基因表达模式存在差异，抗蚜品种新红星及小国光漆酶差异表达基因上调表达居多，感蚜品种红富士下调表达居多，新红星12个基因上调表达，无下调表达基因；小国光9个基因上调表达，3个基因下调表达；红富士10个基因下调表达，4个基因上调表达。其中新红星特有的上调表达基因数量为6个，小国光特有的上调表...     

银耳芽孢内源gpd启动子的克隆与功能鉴定

利用反向长距离PCR技术从银耳(Tremellafuciformis)芽孢gpd基因出发克隆上游gpd启动子序列,将预测的gpd启动子片段与多功能纤维素基因(mfc)连接构建表达载体,与潮霉素抗性质粒pBgGl-hph共转化银耳芽孢,对拟共转化子进行酶活发酵试验。结果表明:4轮反向长距离PCR克隆得到了1761bp的上游序列,经预测启动子落在上游1000bp左右区域内,包含两个高分值的起始转录位点,将gpd启动子分成gpd-Tre1(885bp)、gpd-Tre2(708bp)、gpd-Tre3(466bp)3段区域,分别与多功能纤维素基因(mfc)构建表达载体pgTre1-mfc、pgTre2-mfc和pgTre3-mfc。拟共转化子酶活发酵试验结果发现3个表达载体的转化子均能检测到多功能纤维素酶活,转化子T1-2包含gpd-Tre1启动子大片段,整体酶活最高,CMC酶活为14.12U/mL,比出发菌株Tr01提高34.3%,比工程菌株yLes3提高25.7%,木聚糖酶活为34.8U/mL,比Tr01酶活提高26.3%,略低于yLes3。3个启动子片段均具有表达活性,相比之下885bp的大片段gpd启动子表达活性更高。     

杏鲍菇漆酶基因DNA片段的克隆及序列分析

参照Genbank中发表的杏鲍菇漆酶基因序列(No.AY686700),并根据真菌漆酶氨基酸序列保守区设计特异性引物。以杏鲍菇基因组DNA为模板,PCR扩增出长2 606 bp的漆酶基因片段,DNA经纯化后克隆到pGM-T载体上,经筛选、PCR鉴定和序列分析,证明该片段为完整的杏鲍菇漆酶基因(Genbank注册号KC789846)。通过对基因序列的内含子/外显子进行预测分析,获得漆酶编码区的cDNA,该基因的开放阅读框由1 596个核苷酸组成,编码一个由531个氨基酸组成的多肽,分子量大小约为56 682.0,等电点pI为4.56;比对结果发现该基因氨基酸序列与其他真菌漆酶的同源性最高达93%;进一步对X22-12漆酶二级结构进行分析,并通过SWISS-MODEL预测了该酶的三维结构。     

双价抗病虫基因植物表达载体Lc-ChiA pBI121的构建

采用35S启动子将抗病基因玉米Lc转录因子和抗病虫基因棉铃虫核型多角体病毒(HearNPV)的几丁质酶(ChiA),连接到高效植物表达载体pBI121中,进行酶切鉴定。结果表明:含有上述2个基因,且转录方向相同的双价植物表达载体已经构建成功;含有上述2个基因的双价载体国内外尚未见报道,用于植物转基因研究,可提高植物抗病虫害能力。     

食用菌中漆酶的研究进展(英文)

漆酶是已被广泛研究的用来降解酚类、苯胺等异生物质的酶之一,很多漆酶已经从真菌培养物中被提取。主要讨论从食用菌中获得的漆酶,包括漆酶的催化结构和机制,漆酶基因的克隆和表达以及对食用菌研究的潜在应用。     

草菇漆酶基因在子实体形成过程中的表达分析

为了探明草菇(Volvariella volvacea)漆酶基因的功能，采用实时荧光定量PCR方法对11个漆酶编码基因(lac1-11)在子实体不同发育阶段的表达水平进行研究，结果表明：草菇漆酶在针头期、纽扣期、蛋形期、伸长期和成熟期均发生转录；表达趋势分为三类：lac1、lac5、lac7和lac8表达量针头期最高；lac3、lac6和 lac11从针头期至蛋形期逐渐升高，自伸长期表达量有明显下降；lac2、lac4、lac9和 lac10在纽扣期最高，随后表达量逐渐降低，其中lac9与lac10在成熟期又有了小幅度的提高。这些结果说明草菇不同的漆酶在子实体发育中可能起到不同的作用。     

山楂过氧化物酶基因的克隆及在烟草中异位表达分析

【目的】从山楂(Crataegus pinnatifida)中克隆过氧化物酶(POD)编码基因,通过转基因验证其在木质素合成中的作用,为揭示山楂内果皮形成分子机制奠定基础。【方法】利用RT-PCR技术从山楂克隆基因,以p RI 101-AN为构建基因过量表达载体的基础载体,通过农杆菌介导的遗传转化方法将目的基因导入烟草。【结果】从山楂中克隆出编码序列长度为996 bp的POD72基因,命名为Cp POD72。山楂POD72与木本和草本植物POD72的氨基酸序列一致性均较高。构建了Cp POD72基因的过量表达载体,通过农杆菌介导的转化获得了66个烟草转化植株。RT-PCR检测结果显示Cp POD72基因在烟草转基因植物中异位表达,组织化学染色分析表明转Cp POD72基因烟草植株中木质素含量增加。【结论】Cp POD72基因可能参与木质素合成。     

韧皮部特异启动子驱动密码子优化的抗菌肽D基因的植物表达载体构建

根据177个GenBank中登录的柑橘编码蛋白密码子用法的分析结果,优化并重新设计和合成了含柑橘偏爱密码子、对柑橘黄龙病有杀灭作用的柞蚕抗菌肽D基因(命名为CAPD),克隆入pUC19克隆载体并经测序验证后,获得了含新抗病基因的重组质粒pUC19-CAPD。用限制性内切酶BamHI和SacI双酶切pUC19-CAPD克隆载体和pBI121植物表达载体的质粒DNA,回收pUC19-CAPD克隆载体中的CAPD基因小片段和pBI121植物表达载体中去掉GUS报告基因的大片段,经连接、转化和鉴定后,构建了由CaMV35S组成型启动子(35SP)驱动CAPD目的基因的新植物表达载体(命名为pHZ05);用限制性内切酶BamHI和HindIII双酶切含笋瓜韧皮部特异启动子(PSP)的pUCm-PSP克隆载体和pHZ05植物表达载体的质粒DNA,分别回收pUCm-PSP克隆载体中的PSP小片段和pHZ05植物表达载体中去掉CAPD目的基因上游35SP的大片段,经连接、转化和鉴定后,构建了由PSP驱动CAPD目的基因的新植物表达载体(命名为pHZ06)。利用细胞感受态法直接将2个由不同启动子驱动的含CAPD目的基因的新重组植物表达载体分别导入根癌农杆菌LBA4404、GV3101、EHA105和发根农杆菌Ri15834等4个农杆菌菌株中,为利用农杆菌介导的遗传转化技术培育抵抗由韧皮部传导的毁灭性和检疫性病害柑橘黄龙病的新种质奠定了基础。     

全局调控因子LaeA对蛹虫草生长发育和次生代谢的作用

通过克隆蛹虫草(Cordyceps militaris)野生型菌株Cm01的laeA基因(CmLaeA)、合成构巢曲霉(Aspergillus nidulans)的laeA基因(AsLaeA),构建不同过表达载体,利用农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导转化野生型蛹虫草菌株LN9、Cm01,...     

萝卜过氧化物酶基因片段的cDNA克隆及花期表达谱分析

通过研究过氧化物酶(POD)活性在心里美萝卜花期的变化以及萝卜POD基因的结构,探讨POD的基因结构和功能之间的关系。测定了萝卜花期 不同时间各个部位中POD活性,用改进的半定量RT-PCR分析了过氧化物酶基因(Rsprx)的表达谱,并通过RT-PCR克隆过氧化物酶基因的cDNA片段。结 果表明,心里美萝卜花期不同器官中的POD活性具有明显的变化,地上部分和地下部分POD活性差异显著,在结荚期的木质部II中达到峰值（17.53± 0.35）×10³ U•g^-1(FW)。不同器官中Rsprx的表达差异明显,花蕾和荚中表达最强。从花蕾和荚中得到4个长度为400 bp左右的cDNA克隆片段,序列 比对结果显示,与棉花的花器官过氧化物酶基因Ghpod具有较高的同源性和结构相似性。因此认为POD与萝卜花期生长发育有一定的关系,且有多种 过氧化物酶基因在该过程中表达。     

香菇、杏鲍菇与平菇部分胞外酶种类及活性变化规律的对比分析

为了比较不同腐生食用菌降解纤维素、木质素以及淀粉的能力,以平菇(Pleurotus ostreatus)、香菇(Lentinus edodes)和杏鲍菇(Pleurotus eryngii)为研究对象,采用平板变色圈法对胞外酶种类进行定性检测,选用36%木屑、43%锯末、20%麸皮、1%蔗糖,58%~60%水分,pH 6.6为栽培基质进行栽培出菇,再利用分光光度计法检测其中4种代表性胞外酶在生长发育各阶段的酶活性变化。结果表明:利用变色圈法在平菇、香菇和杏鲍菇中均检测到羧甲基纤维素钠酶(CMCase)、木质素过氧化物酶(Lignin peroxidase,LiP)、漆酶(Laccase)和锰过氧化物酶(Manganese peroxidase,MnP);在平菇及香菇中检测到淀粉酶(Amylase),在香菇中未检测到淀粉酶。杏鲍菇羧甲基纤维素钠酶、滤纸酶、淀粉酶活性与子实体形成正相关,子实体快速生长或者子实体成熟时活性峰值,在发菌及潮菇间期酶活性低;漆酶活性在发菌期有较高的水平,在菇蕾形成达到第一个活性高峰,随后逐渐下降直到子实体老化阶段酶活性升高到第二个高峰;表明杏鲍菇利用木质素先于纤维素和淀粉。平菇羧甲基纤维素钠酶、漆酶活性与子实体形成正相关,其活性峰分别出现在子实体快速生长及成熟阶段;滤纸酶及淀粉酶在整个生长发育阶段均维持价低水平,子实体形成过程无严格相关性。香菇羧甲基纤维素钠酶、滤纸酶在发菌阶段酶活性较高,在幼菇阶段达到峰值,之后逐渐下降;淀粉酶活性与子实体形成过程无严格相关性,始终维持在较低水平;在生长发育过程中几乎检测不到漆酶活性。在生长发育过程中,同种菌不同胞外酶之间、相同胞外酶在不同菌之间酶活性大小及变化规律存在一定的差异。     

桃漆酶家族基因鉴定及PpLAC21功能分析

利用生物信息技术鉴定了桃中漆酶（LAC）家族成员,分析其进化关系分析、基因结构、启动子区顺式作用元件以及表达模式。结果表明,在桃基因组中共鉴定出48个漆酶基因,通过在桃子叶愈伤组织中的表达模式分析,发现1个表达量很高的关键成员PpLAC21,在该基因沉默的桃愈伤组织中,木质素的含量下降,推测该基因可能参与桃愈伤组织的木质素合成。     

转基因抗病毒病四倍体西瓜的培育

利用西瓜花叶病毒2号(WMV-2)外壳蛋白(CP)基因、小西葫芦黄花叶病毒(ZYMV)复制酶(NIb)基因和黄瓜花叶病毒(CMV)复制酶基因构建三价基因的植物表达载体,通过农杆菌介导转化四倍体西瓜植株,经分子检测证明目的基因成功地导入西瓜植株,并在后代中稳定遗传。经温室及大田接种鉴定,T3代转基因西瓜抗病毒性达中抗水平,为抗病毒无籽西瓜新品种的培育提供了可能性。     

枯萎病菌胁迫下10个香蕉防御相关基因的表达分析

利用实时荧光定量PCR对香蕉枯萎病抗感品种受枯萎病菌浸染后不同时间内的10个防卫或潜在防御相关基因进行表达分析。结果表明,接种Foc4后,10个基因在抗病品种宝岛蕉和感病品种巴西蕉中均有表达,但相对表达量有差异。接菌后1~192h,漆酶4B、谷胱甘肽硫转移酶(9h和120h除外)、ClassⅢ型过氧化物酶、类几丁质酶(putative chitinase)和纤维素合成酶催化亚基等5个基因在抗病品种宝岛蕉中的相对表达量均高于感病品种巴西蕉。此外,接菌后除个别时间点外,漆酶4A、周质空间β-葡萄糖苷酶前体合成酶、过氧化物酶、类似烟草叶片表面抗性蛋白和抗菌肽等5个基因在宝岛蕉中的相对表达量均低于巴西蕉。     

湖北海棠二价融合表达载体MhT2AC的构建及转化烟草耐盐性分析

 利用口蹄疫病毒2A序列将湖北海棠MhTGA2转录因子和几丁质酶基因（Mhchitl）两个抗病相关基因融合在同一个开放阅读框下，构建二价融合植物双元表达载体，命名为MhT2AC。将该载体转化烟草，获得了8个转基因株系，MhTGA2基因和Mhchitl基因在烟草中共表达，并且转基因株系中NtSOD、NtAPX和NtPPO等抗逆基因的表达量均加强；转基因烟草T₁代植株抗盐性增强。     

苹果树腐烂病菌果胶裂解酶基因Vmpl4的致病功能研究

【目的】通过研究苹果树腐烂病菌果胶裂解酶(pectate lyase,PL)基因Vmpl4敲除突变体的致病力、对果胶的利用和基因敲除后家族内其他基因的表达水平变化,探明Vmpl4在致病过程中的作用。【方法】采用q RT-PCR技术检测Vmpl4在野生菌株03-8与寄主互作过程中的表达水平及Vmpl4敲除后PL家族内其他基因的表达水平,通过Doublejoint PCR构建基因敲除载体,并通过PEG介导原生质体遗传转化获取转化子、PCR及Southern blot验证基因敲除突变体。利用苹果叶片和枝条离体接种方法检测突变体致病力;接种至PDA及果胶培养基,观察突变体的营养生长和对果胶的利用情况。【结果】Vmpl4在病菌侵染过程中上调表达高达10.20倍;通过验证得到1个基因敲除突变体,其在叶片和枝条上的致病力均显著降低,在果胶培养基上生长速率也明显降低,Vmpl4敲除后家族内4个基因在病菌侵染过程中表达水平显著上调。【结论】果胶裂解酶基因Vmpl4通过降解果胶参与致病过程,PL家族内其他基因与Vmpl4在病菌致病性方面共同发挥作用。     

香蕉漆酶基因家族鉴定及低温胁迫下的表达分析

为研究香蕉漆酶基因家族成员的功能,采用生物信息学方法鉴定香蕉漆酶基因成员,分析其低温胁迫下的表达情况,为香蕉抗寒研究提供理论依据。从香蕉A（Musa acuminata）基因组筛选了22条漆酶基因（MaLAC）,从香蕉B（Musa balbisiana）基因组筛选了11条漆酶基因（MbLAC）,通过生物信息分析发现MaLAC比MbLAC更保守。分子进化树分析结果表明MaLAC可分为5类,MbLAC可分为4类。启动子顺式作用元件分析结果表明,MaLAC启动子序列包含大量光响应、激素应答及非生物胁迫等应激响应元件,推测MaLAC基因家族在响应逆境胁迫的过程中发挥重要作用。利用qRT-PCR技术对MaLAC部分成员在响应不同低温胁迫的表达情况进行分析,MaLAC3-2、MaLAC4、MaLAC4-5、MaLAC17在低温（13、4、0 ℃）处理下表达量均极显著高于对照（28 ℃）,推测可能在香蕉响应低温胁迫的过程中发挥重要作用。预测香蕉MaLAC家族有18个成员受miRNA调控,主要受miR397和miR408的调控;推测香蕉MaLAC可能参与miRNA调控途径。     

姬松茸4个品种菌丝体的生物酶活性测定

对本实验室保藏的4个姬松茸品种进行了菌丝发酵,以酪蛋白、PNPP和ABTS为底物测定了菌丝体细胞内的蛋白酶、磷酸酶和漆酶的活性。数据结果显示,被测定的4个姬松茸品种均具有磷酸酶的活性,其中姬松茸(巴西)的活性最高为48.1 U·g-1;蛋白酶和漆酶活性的检测中发现,只有姬松茸7号和姬松茸11号具有活性,其中姬松茸7号具有较高的蛋白酶活性(95.2 U·g-)1,姬松茸11号具有较高的漆酶活性(58.6 U·g-)1。姬松茸7号和姬松茸11号同时具有3种酶的活性,可以作为深加工的优势材料。     

马铃薯S病毒外壳蛋白基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

 以田间采集的马铃薯病叶中提取的马铃薯病毒s(PVS)总RNA为模板，通过RT—PCR获取长度为890 bp的P 一cp的cDNA，克隆至pGEM—T载体上。酶切回收该基因片段，并构建了该基因的原核表达质粒pBV—pvs。SDS—PAGE凝胶电泳和Western印迹分析表明：P 一印基因在大肠杆菌JM109中可特异地高效表达分子量约33kD的蛋白，且表达蛋白具有良好的抗原活性。利用该表达产物免疫动物家兔，获得的抗血清可用于大田马铃薯s病毒的快速检测。