鸽新城疫病毒分离株F0裂解位点的基因克隆及序列分析

为探索鸽新城疫的流行特点，在分子水平上阐明鸽新城疫病毒分离株鸡新城疫毒株之间的相互关系，我们用ＲＴ－ＰＣＲ技术获得了分离株Ｆ０裂解位点附近３００ｂｐ的基因片段，将其克隆到ｐＵＣ１９载体上得到一重组克隆ｐＮＤＶ２１，序列分析表明，插入片段与鸡析城疫强毒Ｔｅｘａｓ相应区域的同源性为８７．７％，而与弱毒株Ｄ２６／７６及Ｌａ Ｓｏｔａ的同源性分别是９１．７％和９８％。     

鸽新城疫病毒分离株的分子基础和免疫学研究报告

用电镜技术对鸽新城疫病毒分离株进行了形态学鉴定，ＡＧＰＣ法提取病毒的ＲＮＡ，反转录后用ＰＣＲ方法扩增到该分离株Ｆ０裂解位点附近的３００ｂｐ的基因片段。序列分析表明：该分离株与鸡新城疫强毒Ｔｅｘａｓ的同源性为８７．７％，而与弱毒株Ｄ２６／７６及Ｌａｓｏｔａ的同源性分别为９１．７％和９８％；证实其Ｆ０裂解位点的氨基酸顺序为Ｇｌｙ－Ａｒｇ－Ｇｌｎ－Ｇｌｙ－Ａｒｇ，属于新城疫弱毒。将分离毒株接种无新城疫母源抗体的９日龄鸡胚制成油乳苗，每只幼鸽接种０．２５ｍｌ，成年鸽接种０．５ｍｌ，１０天后即可产生坚强的免疫力，保护率达１００％，免疫效力可维持６个月。     

3株鸽源新城疫病毒陕西分离株F基因的克隆与序列分析

对3株鸽源性新城疫病毒F基因进行扩增和序列分析,探讨分离毒株相互之间以及与疫苗毒之间的遗传进化关系.采集病料,通过非免疫鸡胚接毒传代分离病毒,HA及HI试验鉴定其为ND病毒;设计特异性引物,RT-PCR扩增分离ND病毒F 基因的重要功能区片段(1 395 bp),并对其进行克隆、测序及序列分析.结果表明:3株鸽源NDV陕西分离株相互之间F 基因核苷酸序列的同源性在98.0%～99.3%,氨基酸序列同源性为98.5%～99.1%;其F 基因裂解位点的氨基酸组成与NDV 强毒株的特征性结构(112 R-R-Q-K-R-F117 )一致.系统发育进化树表明,此3 株强毒株与某贵州分离株(登录号:EF589137) 高度同源,处于进化树的同一分支,属于基因Ⅵ型.分离到的3株鸽源NDV之间同源性较高,鸡胚病变和序列分析表明其为强毒,与传统的La Sota,B1等疫苗株同源性很低.     

两株鸡新城疫病毒强毒株的分离与分子鉴定

从上海市发病鸡群中分离到两株新城疫病毒(NDV),其MDT分别为51.2 h和50.4 h,ICPl分别为1.850和1.875,均为强毒株.用RT-PCR扩增F基因cDNA片段,并将其分别克隆到pGEM-T easy载体中.序列分析结果表明,两分离株的F基因片段均为1 654 bp,编码551个氨基酸,其F蛋白的氨基酸序列同源性达100%,但与常见疫苗株的氨基酸同源性仅为78.3%～83.7%.F蛋白裂解位点序列均为112R-R-O-K-R-F117,属于基因Ⅶ型NDV.     

鸽副黏病毒Ⅰ型S-1株的分子特性分析

对从上海郊区发病鸽场分离鉴定的鸽副黏病毒Ⅰ型S-1毒株进行分子特性分析,选取融合蛋白F基因片段设计特异性引物,用RT-PCR扩增F基因cDNA片段,并将其克隆到pGEM-T载体中。序列分析结果表明,分离株的F基因片段为1666 bp,包含完整的F基因,编码553个氨基酸,其F蛋白与常见疫苗株B1、La Sota、V4的氨基酸同源性分别为89.2%、89.0%和91.5%;与国内鸽分离株YN P1、ch 98-1和STP96的氨基酸同源性分别为91.2%、93.9%和94.6%;与国外鸽分离株116600、248VB、Capital 397、IT-22782和Tigre 699的同源性分别为95.7%、96.0%、95.1%、99.1%和95.5%。PPMVS-1分离株的F蛋白裂解位点序列为112G-R-Q-K-R-F117,属于基因Ⅵ型中等毒力的鸽Ⅰ型副黏病毒。     

一株鸽副粘病毒分离株的毒力及免疫原性

从病/死鸽中分离到1株病毒,血清学鉴定该分离病毒为禽Ⅰ型副粘病毒(PPMV);该病毒经毒力测定结果显示,PPMV的毒力与鸡新城疫病毒(NDV)La Sota株的毒力相似,为自然弱毒株;对该分离株F基因裂解位点的序列分析结果表明,PPMV F裂解位点附近的氨基酸序列为112G-R-Q-G-R-L117,属于弱毒株的特征性序列.将该株病毒制备成灭活疫苗,分别免疫鸽、鸡,结果都能诱导鸽、鸡体产生较高水平的HI抗体;分别以鸡新城疫标准强毒株F48E9、本组分离于鸡的野毒株CPMV( MDT 45.4 h,ICPI 1.85,IVPI 2.42)和分离于鹅的野毒株GPMV( MDT 59 h,ICPI 1.88,IVPI 2.39)攻击免疫鸡群,免疫鸡群可得到保护,而非免疫鸡群被攻击后全部致死.结果表明,用该分离毒制成的油乳剂灭活苗对鸡安全,具有良好的免疫效果,可抵抗鸡新城疫、鹅副粘病毒的攻击.用HI方法检测该株病毒与La Sota株之间的交叉血凝抑制试验,结果显示La Sota株与PPMV两毒株间的抗原性差异较小.     

一株鸡新城疫病毒的分离与鉴定

从广东某发病鸡场分离鉴定出1株鸡新城疫病毒,采用RT-PCR法扩增出包括裂解位点在内的部分F基因,对其进行序列测定后与GenBank中的毒株进行比较。结果表明：所克隆片断长度为463bp;F基因的裂解位点序列为112R-R-Q-K-R-F117,并且第101位为K（赖氨酸）,121位为V（缬氨酸）,具有基因Ⅶ型副粘病毒强毒株的特征序列;分离株与Lasota株同源性为81.2%,与我国标准强毒F48E9的同源性只有82.4%,表明该基因已经发生了变化。     

广西山雉新城疫病毒分离株生物学特性测定

对1株从广西某山雉养殖场发病山雉中分离得到的新城疫病毒进行生物学特性测定.结果显示,分离株的鸡胚平均死亡时间(MDT)为50.4h,1日龄雏鸡脑内接种致病指数(ICPI)为1.58,F蛋白核苷酸序列与新城疫标准强毒株F48E9株的核苷酸同源性为84.5%,与Lasota的核苷酸同源性为81.8%,推导氨基酸在裂解位点的序列是112G-R-R-Q-K-R-F117.通过MDT、ICPI和推导氨基酸裂解位点分析,确定分离株是一株毒力较强的新城疫病毒强毒株.     

鸡新城疫病毒洛阳分离株HN基因的克隆和序列分析

应用RT PCR技术从新城疫病毒洛阳分离株中扩增HN的cDNA片段,并将其克隆至pMD18 T载体进行核苷酸序列测定。结果表明:新城疫分离株HN基因片段长度为1716bp,编码571个氨基酸;推测出的氨基酸序列中有5个糖基化位点,12个半胱氨酸残基;与国内外的14株新城疫毒株HN基因相比,核苷酸和氨基酸同源性分别为66.4%~98.5%和87.8%~98.3%;与标准毒株Lasota和Clone30的亲缘关系较远,核苷酸和氨基酸差异性较大,而与天津分离株和云南分离株的亲缘关系较近,基本属于同一基因群。     

鸽Ⅰ型禽副粘病毒F基因克隆及序列分析

利用ＲＴ－ＰＣＲ技术获得了编码鸽Ⅰ型禽副粘病毒ＧＤ－Ｐ１分离株Ｆ０裂解位点附件８８４ｂｐ的Ｆ基因ｃＤＮＡ片段,并将其克隆到ｐＧＥＭ－Ｔ Ｅａｓｙ质粒中,获得了重组质粒Ｔ－ｐＰＭＶ－Ｆ－Ｉ,核酸序列测定和分析表明,该片段与新城疫病毒强毒株Ｆ４８Ｅ９和ＨＥＲ／３３相应区域的同源性分别为８７．５％和８８．１９％,与新城疫病毒弱毒株ＬａＳｏｔａ和Ｂ１株的同源性分别为８３．８３％和８４．１５％。该病毒Ｆ０裂     

2株不同来源的新城疫病毒的F基因克隆和序列分析

以1株从发病鸽中分离到的新城疫病毒(PNDV／99株)和1株从发病鹅中分离到的新城疫病毒(GNDV／00株)为研究对象，用反转录—聚合酶链式反应(RT-PCR)对它们的F基因进行分段扩增、定向克隆到pUCll9质粒载体，然后测定它们的核苷酸序列，并推导出相应的氨基到序列。PNDV／99株和GNDV／00株的F基因全长1662bp，编码553个氨基酸，它们的裂解位点的氨基酸序列为112G-R-Q-G-R-L117，是NDV弱毒株特有的序列结构。序列分析结果表明，它们2株之间的核苷酸同源率高达99．28％，氨基酸同源率则为100％；它们与国内标准毒株F48E9的核苷酸同源率只有87．48％和87．36％，氨基酸的同源率都为91．68％；而它们与弱毒株La Sota的核苷酸同源率别为98．50％和98．74％，氨基酸同源率都为98．73％。     

肉鸽新城疫病毒山东分离株的分离鉴定及其F基因的分子特性分析

从山东某发病肉鸽的体内分离到一株新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV),命名为Pigeon-Shandong-JN-08(简写JN08),对其融合蛋白(fusion,F)进行序列和分子特性的分析,以了解肉鸽NDV的遗传起源和分子特性。JN08经病毒蚀斑克隆纯化后动物回归试验可产生典型的NDV病变。研究结果发现,F蛋白多肽裂解位点的序列为112RRQKRF117,符合鸽源NDV强毒氨基酸基序。F基因分型及同源性比较显示:JN08与绝大多数鸽源毒株同属于基因Ⅵ型;其F基因与基因Ⅱ型毒株LaSota,B1,Bingham,TEX-48氨基酸同源性为89.9%,89.7%,90.4%,89.7%,与基因Ⅰ型毒株Ulster67的氨基酸同源性为91.3%,与基因Ⅲ型传统强毒F48E9的氨基酸同源性为92.8%;与国内鸽分离株P1-03,CH98-98,JS1-06,PB01-96和GZ-07的氨基酸同源性分别为91.3%,94.6%,94.8%,95.1%,94.0%;与国外鸽分离株Capital3-97,Tigre6-99,1166-02,IT227-97,2736-00,NY-84,TX3503-04,248VB-98的同源性分别为96.2%,93.8%,98.0%,96.8%,97.1%,96.8%,96.8%,98.4%。从F基因遗传进化树上发现:JN08与国外分离株的遗传距离较近,处于同一基因亚型上,而与国内分离株的遗传距离较远。     

鸡新城疫病毒新乡株ND-XX10的分离与鉴定

2010年初,已免疫过新城疫疫苗的新乡市某鸡场蛋鸡出现以消化道、呼吸道出血为主要症状的疑似新城疫病例.将病料经10日龄SPF鸡胚增殖分离病毒,命名为ND-XX10.提取其病毒基因组RNA,并以此为模板,RT-PCR扩增获得F基因主要功能区(1～631 bp)片段并进行测序.结果显示,ND-XX10毒株F蛋白的裂解位点为...     

不同基因型NDV灭活油乳苗与La Sota株灭活油乳苗的免疫效果比较

用地方分离的基因Ⅵ型和Ⅶ型代表株 (LD - 3- 0 0株和LD - 7- 0 2株 )配以传统的LaSota株所制备的灭活油乳苗与LaSota株单价灭活油乳苗进行的免疫效果比较显示 :前者在接种后各个时期所产生的HI抗体效价与LaSota株灭活苗免疫鸡所产生的HI抗体效价无明显差异 ,至接种后第 4 2天两者均具有 7.3log2 的HI效价。在对具有不同HI抗体水平的试验鸡进行的攻毒试验中 ,对F4 8E9标准强毒株的攻击 ,无论是LaSota株疫苗免疫鸡 ,还是不同基因型灭活苗免疫鸡 ,在HI抗体效价为 6log2 以上时均能 10 0 %地被保护 ;但对不同基因型野毒株的攻击 ,尤其是基因Ⅶ型野毒株的攻击 ,2种疫苗则呈现出明显的差异。在LaSota株疫苗免疫鸡HI效价为 6log2 时 ,对不同基因Ⅶ型野毒株的攻击 ,保护率只有 0～ 2 0 % ;而具有 6log2 效价的不同基因型疫苗免疫鸡则对不同基因Ⅶ型野毒株的攻击具有 6 0 %～ 70 %的保护率 ;当HI效价达 8log2 左右时 ,LaSota株疫苗免疫鸡对基因Ⅶ型野毒株的攻击也只有 80 %的保护率 ,而不同基因型疫苗免疫鸡已能 10 0 %地被保护 ;LaSota株疫苗免疫鸡只有在HI效价在 9log2 以上时 ,方可 10 0 %地抵抗基因Ⅶ型野毒株的攻击。     

几株鸽新城疫病毒的核酸和蛋白质多态性分析

以La Sota毒株和分离到的4株分别来源于信鸽、肉鸽和鸡的新城疫毒株为研究对象，设计了3对引物用反转录－聚合酶链反应（RT－PCR）对它们的融合蛋白基因（F）进行分段扩增，并且采用SDS－PAGE进行结构蛋白分析。两者的综合结果显示毒株之间存在着差异关系，具有显著的多态性；来源于肉鸽的毒株与La Sota株最为接近，而来源于鸡的强毒株与La Sota株差异最显著；来源不同的2株信鸽之间有程度较轻的差异，肉鸽和信鸽的毒株之间差异较为明显，鸽新城疫和鸡新城疫之间的差异关系较为复杂。表明新城疫病毒存在高度变异性。     

NDV基因Ⅶ型与基因Ⅱ型感染CEF后microRNA表达谱分析

本研究旨在探究新城疫病毒（Newcastle disease virus,NDV）流行株HB株（基因Ⅶ型）与疫苗株La Sota株（基因Ⅱ型）在感染鸡胚成纤维细胞（Chicken embryo fibroblasts,CEF）36 h后宿主细胞microRNA(miRNA)表达谱变化情况。通过高通量测序技术分别对La Sota株与HB株感染CEF后36 h后的样本与参考鸡源基因组进行系统比对，筛选差异表达miRNA并对其靶基因进行GO功能注释以及KEGG通路富集。最后随机筛选5条miRNA通过实时荧光定量PCR(Real-time quantification PCR,RT-qPCR)进行验证。结果表明，La Sota与HB感染组中已知miRNA分别为56.9%和47.8%;La Sota与HB感染组通过差异性比较后共筛选出10条差异表达miRNA；通过对差异表达基因的靶基因进行GO与KEGG富集发现，其主要在细胞代谢、生物合成以及应激信号传导等通路上出现显著富集；RT-qPCR结果与RNA-seq结果趋势一致，证明了测序结果的可靠性。为进一步揭示不同NDV毒株感染CEF以及在感染过程中miRNA发挥的调控作用提供了研究基础。     

新城疫La Sota疫苗对不同基因型流行株的免疫保护

选取国内2001—2003年发生的5株NDV毒株,经CEF蚀斑纯化和SPF鸡胚增殖,克隆其融合蛋白（F）和血凝素—神经氨酸酶（HN）基因。利用F基因为Ⅱ型的疫苗La Sota活疫苗在隔离器中免疫SPF鸡,每7 d 采血监测NDV抗体,免疫后2周,利用经过鉴定的新城疫病毒（NDV）基因Ⅶ流行株潍坊毒SGM01,昌乐毒SCL03,东营毒SKY和莘县毒SSX03;基因为Ⅱ型日照毒SRZ03和基因为Ⅲ型经典强毒F48E9分别进行攻毒试验,同时设SPF 鸡对照。每天观察,及时剖检发病鸡,检查鸡群病变,观查疫苗的保护性,便于对常规生产中的免疫失败原因进行分析。     

新城疫病毒F蛋白的研究进展

对新城疫病毒F基因结构,F蛋白的存在形式、裂解位点、半胱氨酸残基、潜在糖基化位点、七肽重复序列、强疏水区域,三维结构和抗原位点的研究进展进行了综述,概括了F蛋白的作用,并对其应用前景作了展望。