改良环介导等温扩增技术快速检测转基因大豆

采用改良环介导等温扩增(LAMP)技术,建立一套准确、快速、可靠的用于转基因大豆检测及DNA提取的方法.以CP4-EPSPS外源基因为检测的目的片段,设计内、外引物和环引物,并采用改进的方法提取DNA,进行LAMP扩增,实际检测已知转基因大豆和市售大豆,通过肉眼观察白色沉淀,判断检测结果.改进的DNA提取方法与经典的CTAB方法相比,提取时间至少缩短了1 h,降低了提取成本.环介导等温扩增(LAMP)技术对转基因大豆的检出限为0.01%,是普通PCR方法的20倍.因此,改良的LAMP检测转基因大豆方法灵敏度高,耗时短,方法简便.     

改良Chelex-100法和CTAB法用于转基因抗草甘膦大豆检测效果的比较

以转基因抗草甘膦大豆为研究材料,分别采用改良Chelex-100法和常规CTAB法提取基因组DNA,以提取DNA的浓度和纯度,同时以PCR扩增大豆的内源基因(lectin)及外源特异性序列(CaMV35S,nos,Cp4-epsps)的效果对两种方法进行比较和评价.结果表明:虽然改良Chelex-100法DNA提取纯度不高,但是提取效率与常规CTAB法相当,而且改良Chelex-100法能够快速在1 h之内从大豆中提取DNA,所提取的DNA可以直接用于PCR扩增反应,PCR扩增产物电泳条带清晰.因此,改良Chelex-100法可以替代CTAB法提取DNA用于转基因检测,该方法具有经济、简便、快速的特点.     

一种快速提取玉米基因组DNA的方法

实验以SDS为主要提取试剂,建立了用于玉米叶片基因组DNA的微量快速提取方法。结果表明:利用此方法提取的玉米叶片基因组DNA具有使用药品少、操作简单、迅速、成本低等优点,每人每工作日可以提取180～250个DNA样品,一个样品可供80～100次PCR反应使用。此DNA提取方法可有效用于玉米的转基因成分检测。     

适用于PCR的棉花基因组DNA快速、批量制备方法的探讨

通过筛选和优化传统CTAB SDS法的操作步骤,建立了一种快速、批量提取棉花基因组DNA的方法.结果表明:利用该方法提取的DNA含量高,能够满足PCR的要求.初步解决了棉花基因组DNA提取步骤复杂、耗时耗力的问题,为转基因作物育种领域的分子检测提供可行的方法.     

小麦幼叶DNA微量快速提取方法的改进

为满足对大批量材料进行分子标记检测的需要,以小麦幼叶为材料,探索了在液氮和无液氮条件下提取DNA方法的改进.结果表明,改进提取法Ⅰ(用液氮)中,水浴中加KCl抽提一次便可得到质量较好的DNA,且液氮用量是常规提取法的1/40～1/30;改进提取法Ⅱ(无液氮)中,水浴后加KCl比水浴前加KCl及不加KCl的RNA含量和杂质含量低,OD260/OD280比值大,DNA浓度和纯度有所提高.两种改进方法提取的DNA经琼脂糖凝胶电泳检测都能得到质量较高的DNA图谱,又经SCAR-PCR扩增均能得到2条片段大小相同的条带.     

小麦中转基因成分PCR与实时荧光PCR的定性检测低限

为了确定小麦转基因成分PCR和实时荧光PCR方法的定性检测低限,将转基因小麦B73与非转基因小麦(检测外源基因)、小麦与大米(检测内源基因)分剐进行质量分数配比后提取DNA用于测定相对检测低限,再将100%转基因小麦B73的DNA进行浓度稀释用于测定绝对检测低限,并应用已知的NOS、bar、ubiquitin,ui-dA(GUS)外源基因和肌Wx012、GAG56D内源基因的引物和探针时模板DNA分别进行PCR与实时荧光PCR扩增.结果表明,最终确定PCR方法检测小麦转基因成分的相对检测低限为0.1%(质量分数),绝对检测低限为0.5 ng/ⅡL;实时荧光PCR方法的相对检测低限为0.1%(质量分数),绝对检测低限为0.01 ng/μL.所确定的检测低限可满足国家对转基因产品的最低标识要求.     

马铃薯晚疫病种薯带菌的分子检测

从马铃薯块茎上分离纯化得到晚疫病菌、银腐病菌、癌肿病菌、红腐病菌、黑点病菌和镰刀菌等并提取它们的全基因组DNA,用引物08-3和08-4对这些真菌的DNA进行PCR扩增,以检验该引物扩增晚疫病菌DNA的特异性。取马铃薯种薯的芽眼、芽及其他不同部位并用NaOH法提取晚疫病菌DNA,再用引物08-3和08-4进行特异性扩增以检验种薯是否带晚疫病菌。结果表明:(1)引物08-3和08-4有很强的特异性,只能扩增出大小为257bp的马铃薯晚疫病菌DNA片段;(2)用该引物能扩增出种薯芽眼组织中大小为257bp的晚疫病菌DNA,说明通过PCR特异扩增,能直接检测出马铃薯种薯中潜伏的晚疫病菌。(3)本次检测的本地感病品种米拉有10%的种薯带晚疫病菌。该研究为种薯传播晚疫病菌的分子检测提供了依据和方法。     

柚基因组DNA提取方法的研究

以下河蜜柚的幼嫩叶片为材料,采用CTAB法、SDS法和SDS-CTAB法3种不同的DNA提取方法提取其基因组DNA,用紫外分光光度法和琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量。分析结果表明,无论从得率还是DNA质量上看, SDS-CTAB法明显优于其它两种方法。     

适用于多重荧光SSR检测的玉米基因组DNA提取方法

通过比较植物DNA提取试剂盒法、SDS法、磁珠法和质粒DNA小提试剂盒法提取玉米叶片全基因组DNA的质量,确定最适用于多重荧光SSR检测的方法。结果表明,4种方法获得全基因组DNA的ODA260/ODA280平均值分别为1.92、2.16、2.22和2.00;DNA浓度平均值分别为19.16、2 050.58、69.12、53.56 ng/μL。比较发现,SDS法和植物DNA提取试剂盒法因为提取DNA杂质多和提取成本高,均不适用于多重SSR-PCR大量样本的检测;质粒DNA小提试剂盒法和磁珠法提取的全基因组DNA都适用于多重SSR-PCR检测,分别适合人工操作和机械自动化提取。     

DNA分子标记检测方法及在茶树中的研究进展

DNA分子标记检测方法是分子标记研究中的一项重要技术,直接关系到分子标记研究的效率、准确性和成本等.本文概述了现有DNA分子标记检测方法的种类及技术原理、特点和应用情况,综述了DNA分子标记检测方法在茶树中的应用并探讨了其发展前景,为茶树DNA分子标记检测方法的研究提供参考.     

Rapid screening of genetically modified ingredients in soybean and cotton processing by-product and waste using direct qPCR

To develop a simple and fast method for screening genetically modified ingredients from processing by-product and waste, direct quantitative PCR (qPCR) kit-Taqman which omitting multi genomic DNA preparing steps was developed in this study. A total of 18 oil crop processing by-products and wastes including 10 soybean and 8 cotton materials were collected from food processing factories. Compared with 2 commercial direct qPCR kits, conditions of DNA releasing procedure and PCR amplification were optimized. Element screening was performed at the initial step of genetically modified (GM) ingredient testing procedure via direct qPCR. GM event identification was carried out in positive samples by initial screening. Totally 5 screening elements (P–35S, T-NOS, Cp4-epsps, bar and pat) for soybean materials and 6 screening elements (P–35S, T-NOS, NPTII, Cry1Ac, bar and pat) for cotton samples were detected. In GM event identification, MON531 and MON1445 were found in cotton materials. Results were further confirmed by real-time PCR with DNA extraction and purification. The direct qPCR system proposed by this research was convenient for rapid screening and identification of GM ingredients in oil crop primary by-product and waste.     

转基因大豆中外源基因g10evo-epsps的qPCR检测方法的建立和验证

耐除草剂基因g10evo-epsps在我国转基因农作物研发中常常被用作目标性状基因或筛选标记基因,因此可作为转基因成分检测的重要筛查基因,但目前缺少相应的检测方法.本研究旨在建立g10evo-epsps基因特异性的实时荧光定量PCR(qPCR)检测方法,从而为转基因大豆的监测提供一种稳定可靠的方法体系.本研究基于转基因...     

多聚酶对转基因产品PCR检测的影响分析

本文参考出入境检验检疫行业标准中转基因油菜外源基因的PCR检测体系,分析了18种不同DNA聚合酶对定性PCR检测转基因油菜OXY235中的CaMV35S启动子的影响。结果表明,不同DNA聚合酶对CaMV35S启动子定性PCR检测中非特异扩增的产生以及检测灵敏度影响较大。其中热启动Taq酶效果较好,目标条带清晰,检测灵敏度高,而且完全没有非特异性扩增条带,非常适合用于定性PCR检测。对于同样条件下无法有效扩增0.1%DNA样品的Taq酶,则不推荐用于检测途径。     

大豆和玉米加工产品中外源转基因成分检测技术的建立

采用PCR技术检测CaMV 35S启动子,并进一步通过PCR检测RoundUp Ready Soybean(RRS)和Btl76 Maximaizer的特异性DNA片段,判断大豆和玉米加工产品中是否含相应转基因成分.在1份豆粕和豆腐样品中检测到了RoundUp Ready大豆特异性的498 bp片段,而在玉米粒样品中检测到了Btl76特异性转基因成分.PCR检测的灵敏度达到0.1%,稳定性良好.结果表明,PCR技术检测外源基因是灵敏和准确的,可以广泛地应用到转基因作物及其加工产品的转基因成分检测中.     

706份常规大豆品系转基因成分筛查及检测

为调查分析我国的常规大豆育种材料中是否混入转基因大豆品系,选取706份大豆品系,对可能含有的外源转基因调控元件(CaMV35S启动子、FMV35S启动子和NOS终止子)以及针对我国批准进口的主要耐除草剂转基因大豆转化体(GTS40-3-2和MON89788)成分进行PCR扩增,同时根据MON89788转化体侧翼序列和目...     

多重PCR快速检测甘蔗转基因成分研究

以单子叶植物常见外源转基因元件Ubiquitin启动子、NOS启动子、NOS终止子、Bar基因和Bt基因序列设计多重PCR引物,通过对PCR扩增体系中退火温度、Premix TaqTM浓度、引物浓度的优化,建立一种快速检测转基因甘蔗成分的多重PCR方法。结果表明:建立的体系一次能有效检测5个参数,其检测的最低DNA质量百分比可达1.0%,并在多个转基因甘蔗品种检测中得到验证。     

一种快速微量提取橡胶树胚基因组DNA的方法

为了建立一套快速检测橡胶树早期胚基因组变异情况的微量检测体系,需先建立一种快速微量提取橡胶树胚中基因组DNA的方法。运用CTAB改良法、尿素改良法、SDS法分别对1 mm3橡胶树早期胚进行基因组DNA提取,并对其DNA进行质量检测和PCR验证。结果表明,尿素改良法的DNA提取率高于SDS法和CTAB改良法;样品的DNA适合PCR检测需要。因此尿素改良法是适宜于微量橡胶树胚基因组DNA提取的理想方法。     

第二代抗草甘膦大豆PCR检测方法研究

为建立转基因大豆Roundup RReady2Yield"(RR2Y)转化体特异性定性PCR检测方法,以lectin基因作为内参照基因,根据RR2Y外源插入片段5'端与植物基因组连接区序列设计特异性引物,从RR2Y中特异性地扩增出223bp的预期产物.对该方法进行重现性、特异性、灵敏度、稳定性和可重复性测试,结果显示:陔方法能够特异性检测出RR2Y转化体;将100%RR2Y基因组DNA用A3244基因组DNA进行梯度稀释,以100 ng DNA为模板,该方法的检测灵敏度达到0.05%,约为40个起始模板拷贝;以RR2Y DNA含量为10%、1%、0.1%的样品为模板,进行稳定性和可重复性,假阴性率为0.结果表明:此方法适用于RR2Y的转化体特异性定性PCR检测.     

A Simple Method for Preparation of Rice Genomic DNA

The extraction of DNA is often the most time consuming and laborious step in high-throughput molecular genetic analysis and marker assisted selection(MAS)programs.A simple method for preparation of rice genomic DNA was developed.A small amount(1-50 mg)of leaf tissue of rice seedling,500μL of extraction buffer,and one steel bead were put into a 2-mL microcentrifuge tube.After vigorously mashing for 2 min,5μL of supernatant was directly applied to PCR amplification.Otherwise,the supernatant was precipitated with two times volume of ethanol to obtain high quality genomic DNA.This method is simple,rapid,low cost,and reliable for PCR analysis.One person can manipulate as many as 96 samples for PCR in 10 min.It is especially suitable for genotyping of large number of samples.