绵羊卵巢卵泡FoxO1表达模式的研究

本研究旨在探究Fox O1在绵羊卵巢卵泡的表达模式。屠宰场取卵巢获得卵泡,分为小卵泡(直径≤3 mm)、中卵泡(3 mm<直径<5 mm)、大卵泡(直径≥5 mm)3组。利用免疫组化技术对不同直径卵泡的FoxO1进行定位分析,通过机械分离法分离卵泡颗粒细胞,qRT-PCR和Western blotting技术检测FoxO1在小、中、大卵泡颗粒细胞的表达量。结果显示:在绵羊卵泡中,FoxO1表达于颗粒细胞层;中卵泡的FoxO1 mRNA表达量高于小卵泡和大卵泡(P<0.01),小卵泡FoxO1mRNA表达量高于大卵泡(P<0.01);FoxO1蛋白在大卵泡的表达量低于小卵泡和中卵泡(P<0.01),但小卵泡和中卵泡表达量差异不显著。综上表明,FoxO1在绵羊卵泡颗粒细胞层表达,且在大卵泡中的表达量极显著低于小卵泡和中卵泡。     

牛卵泡颗粒细胞中生长相关基因的表达研究

随着卵巢卵泡的生长,卵泡内雌激素分泌量逐渐上升,雌激素通过其受体(Estrogen Receptors,Esrs)对卵泡的调节作用也在发生改变。该研究通过手术法获取牛卵巢上不同直径的卵泡颗粒细胞,对颗粒细胞中雌激素受体及相关基因表达进行研究。结果表明:Esr1和Esr2都能在牛卵泡颗粒细胞中表达,且随着卵泡的生长而显著下降(P0.05);Fshr的表达随着卵泡的生长而显著上升(P0.05),但在中、大型卵泡颗粒细胞中差异不显著(P0.05);Lhr在大型卵泡颗粒细胞中的表达量极显著高于小、中型卵泡(P0.01);随着卵泡的生长,Cox2在颗粒细胞中的表达显著上升(P0.05),而Hsd17b1的表达则显著下降(P0.05)。综上所述,随着卵泡生长,卵泡颗粒细胞对Esr1、Esr2作用的依赖性逐渐减弱;大卵泡在排卵前Lhr表达量急剧上升,同时诱导Cox2表达量显著上升而Hsd17b1表达量显著下降,表明大卵泡已启动排卵反应。     

牛次级卵泡和三级卵泡前期生长发育的组织学研究

通过对牛次级卵泡和三级卵泡前期生长发育的组织学研究 ,探讨了次级卵泡和三级卵泡前期的生长发育规律。结果表明 :在卵泡生长发育过程中 ,卵泡颗粒细胞层数达 5～ 6层时 ,开始出现不连续卵泡腔 ;其层数在 8层以上则以连续腔为主 (占 94 .74 % ) ,连续腔出现最多的层数为 8～ 16层 (占 84 .2 1% )。次级卵泡在颗粒细胞层数达到 3～ 4层时 ,已形成完整的透明带 ,颗粒细胞层数达到 5层时 ,透明带增厚。随着颗粒细胞层数的增多 ,卵泡直径和卵母细胞直径均增大。次级卵泡卵母细胞直径的增长和卵泡直径增长速度基本接近 ;而进入有腔卵泡阶段 ,卵母细胞直径的增长速度相对于其卵泡直径的增长缓慢。次级卵泡颗粒细胞层数在 2～ 5层 ;颗粒细胞层数达 5层之后进入三级卵泡初期阶段     

BMP4诱导的Smad9在小鼠卵泡发育中的作用及其机制的初步研究

本研究旨在探讨Smad9在小鼠卵泡发育中的作用,为卵泡生长发育及其调控机制的研究提供新思路。将6周龄的雌性昆明小鼠随机分成3组,分别腹腔注射生理盐水、骨形态发生蛋白-4（BMP4）和Smad9抑制剂（LDN-193189）,依次作为对照组、BMP4组和LDN组。48 h后收集卵巢制作石蜡切片,HE染色后观察卵泡发育情况并对各级卵泡进行计数;采用Western blotting和实时荧光定量PCR技术检测Smad9蛋白和mRNA水平。同时通过ELISA试验测定各组小鼠血清中雌二醇（E₂）、孕酮（P₄）、黄体生成素（LH）、卵泡刺激素（FSH）和芳香化酶等的浓度,并检测了CYP19a1、LHR、PRLR和FSHR基因的表达情况,进一步探究Smad9可能的作用机制。结果显示,与对照组相比,BMP4组Smad9蛋白和mRNA水平较高,而LDN组较低;BMP4组有腔卵泡显著增加（P<0.05）,而LDN组显著减少（P<0.05）。此外,ELISA试验结果显示,BMP4组血清E₂、FSH和芳香化酶含量增加,而P₄和LH含量降低;LDN组中E₂和芳香化酶的含量降低。实时荧光定量PCR结果显示,BMP4组FSHR和CYP19a1基因的mRNA水平升高,而LHR和PRLR基因的mRNA水平降低;LDN组PRLR基因的mRNA水平升高,而CYP19a1基因的mRNA水平降低。由以上试验结果可以得出,BMP4诱导的Smad9能促进小鼠有腔卵泡的发育,而其可能主要通过影响E₂、PRL和芳香化酶等的产生而起作用。     

牛卵巢内卵泡及卵母细胞生长发育的组织学研究

随机摘取牛离体卵巢18枚,常规石蜡切片,光镜下共观察卵泡5 818个,并测得卵泡、卵母细胞直径和透明带厚度（平均值）。结果:在整个卵泡发育过程中,卵泡与卵母细胞发育是完全显著正相关（P<0.01,R=0.9906）,其中腔前期P<0.01,R=0.9917,有腔期P<0.01,R=0.9951。腔前卵泡时期,卵泡和其卵母细胞直径增长幅度大体相等,而从有腔卵泡始,卵泡生长速度远远大于其卵母细胞。透明带与卵母细胞发育呈不显著正相关（P>0.05,R=0.9521）。     

牛卵泡颗粒细胞无血清培养的形态学观察

McCoy’s5a为基础培养液添加硒、转铁蛋白、雄烯二酮、谷氨酰胺 ,对牛卵巢上大 (直径 >8mm)、中 ( 4mm <直径 <8mm)、小 (直径 <4mm)非闭锁卵泡的颗粒细胞进行无血清培养。McCoy’s5a无血清培养中的颗粒细胞形态与分化特点类似于体内情况 ,说明颗粒细胞在该培养条件下 ,其功能可能更接近体内的生理状况     

牛卵泡卵母细胞体外受精和发育的研究

利用屠宰黄牛卵巢作为供试材料 ,对卵巢表面 2～8mm卵泡卵母细胞体外受精(IVF) -受精卵的体外发育 (IVD)进行了系列研究 ,采用上游法、Percoll法和本实验室沿用的直接洗涤法处理牛冻精 ,观察 3种精子处理方法处理牛冷冻精子对卵母细胞体外受精胚胎发育的影响。实验结果 ,就卵裂率指标 ,采用Percoll法处理的精子进行卵母细胞体外受精 ,和上游法及洗涤法分别比较 ,差异均不显著 (P >0 .0 5 ) ;桑囊率指标 ,只有上游法比洗涤法高 ,差异显著 (P <0 .0 5 ) ,其余差异均不显著。以FERT -TALP液作为受精液采用常规培养方法 ,精卵作用 18～ 2 0h后分开 ,与精卵作用 6～ 8h后分开卵母细胞受精后的 8-细胞发育率及桑囊率变化不大 (P >0 .0 5 ) ;卵裂率指标 ,18～ 2 0h处理组高于 6～ 8h处理组 ,但两组之间差异也不显著。表明 ,在生产中采用FERT -TALP液做为受精液 ,应用上游法处理精子 ,不需要另购试剂 ,精卵孵育时间由 18～ 2 4h缩短至 6～ 8h是可行的 ,其现实意义是可以简化胚胎体外生产的程序 ,节省人力 ,降低成本     

BMP15通过bta-miR-2285bc-BMPR2调控牛卵泡颗粒细胞功能的研究

本实验旨在探究牛卵泡颗粒细胞（Granulosa Cells,GCs）bta-miR-2285bc与BMPR2的靶标关系,及其作为BMP15下游关键因子对GCs增殖和卵泡发育的潜在调控作用。利用miRanda预测bta-miR-2285bc与BMPR2 3’UTR的结合位点,构建BMPR2 3’UTR野生型与突变型双荧光报告载体,并通过双荧光素酶报告试验验证其靶标关系;屠宰场获取牛卵巢并于实验室分离直径4～8 mm卵泡,刮取卵泡壁GCs进行体外培养。设置浓度梯度,根据BMPR2表达量确定BMP15最适添加浓度。转染bta-miR-2285bc mimics/inhibitor至GCs并添加BMP15,qRT-PCR和Western blotting分别检测BMPR2 mRNA和蛋白表达,随后qRT-PCR检测GCs BMP/Smad信号通路、增殖、凋亡和类固醇激素合成相关基因表达水平,Elisa检测细胞培养液中雌激素（E2）和孕激素（P4）浓度。结果显示：bta-miR-2285bc能够靶向结合BMPR2 3’UTR;向体外培养的GCs添加最适浓度BMP15(100ng/mL)并转染b...     

牛卵巢黄体类型与闭锁卵泡之间关系的探讨

通过对牛卵巢不同黄体类型和闭锁卵泡的组织学研究 ,探讨了不同黄体类型与闭锁卵泡数量和直径之间的关系。试验结果表明牛卵巢黄体类型其功能强弱不同直接影响正在闭锁、近完全闭锁和完全闭锁卵泡的数量和直径     

FSH和胰岛素对牛卵泡颗粒细胞长期培养的影响

McCoy’s5a为基础培养液添加硒、转铁蛋白、雄烯二酮、谷氨酰胺 ,对牛卵巢上大 (直径 >8mm)、中 (4mm <直径 <8mm)、小 (直径 <4mm)非闭锁卵泡的颗粒细胞进行无血清培养 ,研究添加不同浓度的促卵泡激素和胰岛素对颗粒细胞增生、分化和激素分泌的影响。结果 :FSH可以诱导颗粒细胞增生及雌二醇合成能力 ,颗粒细胞的雌二醇合成能力与生理浓度的FSH呈剂量依赖方式。胰岛素对大、中、小卵泡颗粒细胞增生和雌二醇分泌有促进作用。     

牛卵泡发育及其调控

扼要介绍了牛卵泡发育的一般规律,总结了近年来牛卵泡发育及其调控方面的研究成果,为进一步的研究工作提供了参考资料。     

牛卵泡颗粒细胞无血清培养的形态学观察

以McCoy＇s 5a为基础培养液添加硒、转铁蛋白、雄烯二酮、谷氨酰胺，对牛卵巢上大（直径＞8mm）、中（4mm＜直径＜8mm）、小（直径＜4mm）非闭销卵泡的颗粒细胞进行无血清培养。结果表明，McCoy＇s 5a无血清培养中的颗粒细胞形态与分化特点类似于体内情况，说明颗粒细胞在该培养条件下，其功能可能更接近体内的生理状况。     

牛卵泡TEDDM1表达特点及其功能分析

旨在研究牛卵泡跨膜附睾蛋白1(transmembrane epididymal protein 1,TEDDM1)的分子特征和立体结构,并结合TEDDM1在不同生理状态牛卵泡的表达特性分析其功能。本研究采集牛发情期第一卵泡波优势卵泡(dominant follicle,DF)和从属卵泡(subordinate follicle,SF),分别分离颗粒细胞(granulosa cells,GCs),提取总RNA后反转录,设计牛 TEDDM 1特异性引物进行PCR扩增、克隆、测序,获得全CDS区后运用生物信息学方法对序列结构进行分析;以牛 RPLP 0作为内参基因,在DF和SF中使用qRT-PCR对 TEDDM 1的表达量进行检测;兔抗TEDDM1一抗检测TEDDM1在牛卵泡中的表达和定位。结果表明, TEDDM 1基因CDS区全长903 bp,编码300个氨基酸,有7次跨膜的α螺旋结构,属于典型的G蛋白偶联受体,该基因氨基酸序列与非洲野牛( Bison bison bison )序列相似性最高,为99.4%;功能域分析表明,TEDDM1分子中存在未知功能结构域,蛋白家族716(domains of unknown function protein families 716,DUF716)结构域。qRT-PCR分析表明, TEDDM 1 mRNA在SF的表达量显著高于DF( P <0.05);免疫组化分析表明,TEDDM1在DF和SF的颗粒层和膜层细胞均有表达,特异性显色强度表明TEDDM1在SF颗粒层和膜层细胞表达量均高于DF。本研究为进一步探讨TEDDM1在牛卵泡发育过程中的调控作用及其在信号转导和激素调节中的功能提供了依据,为后期深入研究牛卵泡发育机理奠定基础。     

牛卵泡抑素基因克隆及真核表达载体构建

[目的]克隆牛的卵泡抑素基因（Follistatin,FSTN）基因,构建真核表达载体。[方法]用Trizol法从牛的卵巢中提取总RNA,反转录成cDNA,用带有酶切位点牛FSTN的特异性引物扩增其完整编码区序列,连接到T载体、测序,序列无误后亚克隆入真核表达载体pIRES2-AcGFP1中,酶切及PCR鉴定载体。[结...     

牛卵泡抑制素抗体对小白鼠和大白鼠卵巢与子宫的作用

从用牛卵泡抑制素α－亚基片段免疫过的健康鸡所产蛋的卵黄液中提取抗体。得粗提物：然后用不同剂量的粗提物被动免疫２０只性成熟小白鼠和２０只发情周期大白鼠。并以生理盐水处理作为对照。结果发现,小白鼠用０．３ｍｌ抗体处理后,卵巢与子宫增重显著高于对照组（Ｐ〈０．０５）。大白鼠用０．６ｍｌ抗体处理后,卵泡平均数显著高于对照组（Ｐ〈０．０５）。这些结果表明,牛卵泡抑制素抗体被动免疫对小白鼠和大白鼠的子宫和卵泡