2017年-2019年郑州地区猪圆环病毒3型分子流行病学调查及Cap基因序列分析

为了分析2017年-2019年郑州地区猪场中猪圆环病毒3型(PCV-3)分子流行情况及代表株Cap基因序列遗传情况,采集郑州地区规模化猪场、散养猪场中患病猪的淋巴结、脾脏、肾脏及血清样品1 175份,采用PCR进行PCV3检测,并选择代表株的Cap基因进行PCR检测与分析其遗传变异情况.结果表明,2017年-2019年...     

河北秦皇岛及周边地区PCV2流行病学调查及其ORF2基因遗传演化分析

为了解猪圆环病毒2型(PCV2)在河北地区流行特点及遗传演化规律,本研究参照GenBank登录的部分PCV2全基因序列,经序列比对后选取保守区域设计一对PCV2检测引物,利用PCR方法对2015年～2019年间在河北秦皇岛及周边地区收集的379份来源于不同病猪的肝、脾、肺、肾、肠、脑、淋巴结及血清等样品开展PCV2的分子流行病学调查,结果显示共检出203份PCV2阳性样品,阳性率为53.6%。根据阳性病料的采集时间、地点等特征选择47份阳性病料样品扩增其ORF2基因并测序,分析该基因及其氨基酸序列与GenBank登录的参考株和已知的疫苗株相应基因与氨基酸序列的同源性,并构建ORF2基因的遗传进化树。结果显示,2015年～2019年间河北秦皇岛及周边地区PCV2优势流行株为PCV 2b和PCV 2d亚型,但也有少量PCV 2e的流行,分离株ORF2基因与疫苗株的同源性较低,为87.3%～96.2%,可能影响疫苗保护效力,提示应密切监测PCV2的流行情况,并及时筛选更换疫苗株。本研究了解了不同基因型PCV2在河北秦皇岛及周边地区的流行及遗传演化情况,并发现少量PCV2e毒株在秦皇岛地区的流行可能具有时间和地域特异性,以上结果充实了河北地区PCV2的流行病学调查数据的同时也为PCV2的防控提供了参考依据。     

山西省猪圆环病毒3型感染调查及其Cap基因的遗传进化分析

为了解山西省各地市养猪场中猪圆环3型病毒(PCV3)的感染及其Cap基因的遗传变异情况,本研究通过PCR方法对2019年6月～7月采集的山西省11地市共521份猪肺脏组织样品进行PCV3检测,结果显示,山西省PCV3的总体感染率高达85.22%(444/521),大同市、长治市、吕梁市、临汾市的阳性检测率高达90%以上,朔州市、太原市的阳性检出率较低为65.38%、64.00%,说明山西省PCV3的感染率总体较高。随机抽取山西省各地市11份PCV3阳性肺脏样品进行Cap基因的PCR扩增并测序,利用DNAStar软件将其与30株PCV3参考株、3株PCV2疫苗株进行同源性及遗传进化分析。Cap基因同源性分析结果显示,11株PCV3间Cap基因的同源性为97.8%～99.5%,与PCV3参考株Cap基因的同源性为97.7%～99.7%;11株PCV3 Cap基因编码氨基酸比对分析结果显示,其与PCV2 Cap蛋白氨基酸序列的同源性为27.1%～29.0%,与PCV3参考株Cap基因编码的氨基酸同源性为97.7%～100%;11株PCV3 Cap基因进化树结果显示,4株PCV3属于PCV3b型,7株PCV3属于PCV3a型;选取的11株病毒与PCV3参考株仅于aa24、aa27、aa77、aa150有散在变异位点,且与3株PCV2疫苗株抗原表位有明显差异,据此分析可知山西省各地市流行的PCV3株同源性及整体保守性均较高。对所有病料样品进行PCV2、PRV等病毒的检测,结果发现PCV3与PCV2的混合感染率为44.53%(232/521),与其他病毒的混合感染率较低。本研究首次对山西省11地市PCV3的感染情况进行了调查,结果表明PCV3感染率较高,该地区流行的PCV3株相对保守,且与PCV2混合感染率较高,上述结果为山西省PCV感染的防控提供了参考依据。     

PCV2、PCV3和PCV4三重荧光PCR鉴别检测方法的建立及应用

根据猪圆环病毒2型(porcine circovirus 2,PCV2)、猪圆环病毒3型(porcine circovirus 3,PCV3)和猪圆环病毒4型(porcine circovirus 4,PCV4)保守区域基因序列合成特异性的引物和TaqMan探针,通过优化反应条件,建立了一种可同时快速高效鉴别检测PCV2、PCV3和PCV4的三重荧光PCR方法。结果显示,所建立的三重荧光PCR方法仅对PCV2、PCV3和PCV4出现阳性扩增,与猪伪狂犬病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪支原体肺炎(M.hyo)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)和猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)等猪常见病原无交叉反应;对PCV2、PCV3和PCV4的最低检出限分别为1.69×10¹,1.38×10²,1.42×10²拷贝;组内和组间试验变异系数均小于1.6%,重复性好。进一步应用所建立的PCV2、PCV3和PCV4三重荧光PCR方法对263份猪临床样品进行检测,结果检出168份PC...     

猪圆环病毒4型实时荧光RAA检测方法的建立

为快速检测猪圆环病毒4型(PCV4),本研究根据PCV4的Cap基因片段保守区设计引物和探针,建立了PCV4重组酶介导核酸等温扩增荧光法(RAA),并应用该方法对40份猪组织样品进行检测。结果表明,该方法可在20 min内,42℃恒温条件下特异性检测出PCV4,以猪圆环病毒2型(PCV2)、猪圆环病毒3型(PCV3)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)等病毒核酸为模板进行反应的扩增结果均为阴性;最低检出限至7.42×10¹拷贝/μL,灵敏度较高。利用建立的RAA检测方法和常规PCR法分别对猪组织样本进行检测,均未检出,表明当前猪场流行率较低。综上所述,本研究建立的PCV4实时荧光RAA检测方法快速简便、特异性强、灵敏度较高,可应用于PCV4的临床筛查与流行病学研究。     

TaqMan-MGB多重荧光定量PCR检测PCV2、PCV3和PCV4方法的建立和应用

为建立一种可同时鉴别致病性猪圆环病毒(PCV)不同基因型的检测方法，本试验针对PCV2、PCV3和PCV4的ORF2基因保守区域设计引物和探针，将人工合成目的基因与质粒连接，构建阳性质粒PCV2-ORF2、PCV3-ORF2和PCV4-ORF2。通过优化引物浓度、探针浓度、退火温度等参数，建立PCV2、PCV3和PCV4 TaqMan-MGB多重荧光定量PCR检测方法，并验证该方法的特异性、敏感性和重复性。应用建立的方法对38份临床样品进行应用检测，对24个养猪场(户)进行流行病学调查。结果显示，建立的方法能特异性区分PCV2、PCV3和PCV4,且与其他常见猪病病原不发生交叉反应；对PCV2、PCV3和PCV4的最低检出浓度分别为1.56×10、1.28×10和1.76×10拷贝/μL;批内和批间变异系数均小于2%,重复性好；38份临床样品中PCV2、PCV3和PCV4阳性样品分别为17、3和1份，从24个养猪场(户)采集的689份样品中PCV2、PCV3和PCV4阳性率分别为33.33%、12.50%和8.33%。结果表明，本试验建立的PCV2、PCV3和PCV4 TaqMan-M...     

犬的病料中检测到猪圆环病毒3型

为进一步弄清我国犬是否感染猪圆环病毒3型(porcine circovirus 3,PCV3),本试验对山东省青岛市某宠物医院采集发病犬的48份样品进行PCV3荧光PCR检测,发现7份病料呈现明显阳性,对这7株阳性样品继续用普通PCR扩增,有3份可以扩增出228 bp的特异性条带。这些条带测序后与圆环病毒的其他参考序列进行同源性分析,结果显示这3份样品的病毒序列与其他PCV3参考序列处于同一个进化分支,与PCV3的同源性为93.3%～99.5%,表明我国犬确实存在PCV3感染。     

西宁市猪圆环病毒2型感染的流行病学调查

用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测了西宁市8个规模养殖场和部分散养户的161份猪血清样品的猪圆环病毒2型（PCV2）抗体。结果显示，所有被检猪场均有PCV2抗体阳性猪存在，161份血清样品中PCV2抗体阳性率为86．95％。从上述样品中随机抽取28份样品，用PCR方法检测了PCV2ORF1基因；结果，从13份血清中扩增到了特异性PCV2ORF1基因，阳性率为46．42％。证实，西宁市猪场和散养猪群中存在PCV2感染。     

PCV2和PCV3双重纳米PCR方法的建立及初步应用

本研究旨在建立一种同时检测猪圆环病毒2型（PCV2）和猪圆环病毒3型（PCV3）的双重纳米PCR（nano-dPCR）方法,同时应用该方法对PCV2和PCV3进行检测。参考GenBank中登录的PCV2和PCV3型基因序列分别设计特异性引物,对nano-dPCR的反应条件进行优化;同时考察所建立的nano-dPCR检测方法的特异性和敏感性。结果显示,所建方法的特异性和敏感性良好,对PCV2和PCV3两种病毒的最低核酸检测量分别为93.2和91.6拷贝/μL,其敏感性比普通PCR高100倍。应用该方法对送检的265份临床样本进行检测,结果显示,PCV2和PCV3在猪群中存在普遍感染,PCV3和PCV2的阳性率分别为16.6%和14.7%,混合感染阳性率为6.8%。临床样品的检测结果表明,本试验建立的nano-dPCR方法为PCV2和PCV3早期感染进行快速、敏感鉴别诊断提供了新方法。     

四川省部分地区猪圆环病毒2型流行病学调查

以四川省7个市县地区14个猪场为研究对象,采集疑似圆环病毒2型感染的死猪、病料、精液、血样等样品181份,进行PCR检测。结果显示:猪圆环病毒2型(PCV2)阳性有89份,阳性率49.2%;14个规模化猪场中均检测出了PCV2阳性。在死亡的43头猪中有21头PCV2阳性。病料中PCV2的阳性检出率54.0%。该病在春夏季节感染率最高,并存在病毒混合感染和继发细菌感染情况。根据临床症状和病理变化分析,大部分猪场因感染PCV2而致断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS),其中遂宁市和绵阳市的6个规模化猪场中检测到PCV2感染所引起的猪皮炎肾病综合征(PDNS)。结果表明,四川省部分地区的规模化猪场中已经广泛存在猪圆环病毒2型感染。     

2019—2021年江苏地区PCV3感染情况调查及其Cap基因的遗传演化分析

为了解猪圆环病毒3型(PCV3)在江苏地区规模化猪场的感染及病毒演化情况,对2019—2021年收集的113份临床组织样品进行Cap基因的检测,应用DNAStar和MEGA软件对获得的序列进行遗传演化分析。结果显示：PCV3样品阳性率为37.17%(42/113),猪场阳性率为73.91%(17/23)。对29个阳性样品的PCR产物直接测序,显示核苷酸序列高度同源,同源性为97.3%～100.0%。挑取其中的12个阳性样品,扩增Cap全长序列,连接至pMD19-T平末端载体后测序,显示12条序列的核苷酸同源性为97.5%～99.8%,与国内外其他PCV3毒株Cap基因的同源性为97.0%～100%。遗传演化分析显示,3条序列与国内外PCV3亚群3a的毒株处于一个大的分支,6条序列属于3b, 3条序列形成独立的分支(3c)。推导编码氨基酸后对24和27位氨基酸位点进行分析,1条序列为A²⁴K²⁷, 2条序列为A²⁴R²⁷,9条序列为V²⁴K²⁷。本试验丰富了...     

福建省新发猪圆环病毒3型分子流行病学调查及其Cap基因分子特征

为了解2015―2017年福建省新发猪圆环病毒3型(PCV3)的流行现状、分子生物学特征和遗传演化规律,收集福建省不同地区186个猪场的267份疑似PCV3感染猪的组织病料进行分子流行病学调查,并对其Cap基因进行了遗传变异分析。结果显示,福建地区PCV3猪场总阳性率为30.11%,疑似样品总阳性率为21.72%,且呈逐年增高的趋势;17株PCV3福建分离株与其他17株国内外参考毒株Cap基因核苷酸序列及氨基酸序列同源性较高,分别为96.0%～100.0%和96.3%～100.0%,表明这些毒株可能有相同的进化来源;氨基酸多序列比对发现,Cap基因氨基酸序列最有特征性的是第168位(R→K)和173位(L→F)的氨基酸替换,该位点的突变可能是该地区流行的PCV3毒株的一个重要分子特征;同时,抗原性分析发现第173位(L→F)的突变还位于Cap蛋白的抗原表位区内。遗传进化树分析结果表明,17株PCV3福建分离株中有2株属于3a亚型,其余15株属于3b亚型,表明当前福建地区PCV3流行毒株主要为3b亚型。     

河南地区猪圆环病毒3型的PCR检测

为调查河南地区猪圆环病毒3型(PCV3)的感染情况及流行特点,对2015—2017年河南不同地区猪场采集的152份临床样品进行PCR检测PCV3。结果显示,152份临床样品中检测到46份PCV3,阳性率为30.26%(46/152),在开封、新乡、鹤壁等7个地市均检测出PCV3,说明PCV3在河南省部分地区存在并且已呈现流行趋势;152份临床样品中有105份样品PCV2为阳性,阳性率为69.08%,且所有PCV3阳性样品均可检测出PCV2,推测PCV3与PCV2的共感染可能广泛存在。本研究对河南省猪圆环病毒病的防控提供基础信息。     

四川地区一株PCV2的分离鉴定及基因组序列分析

为了解猪圆环病毒2型（PCV2）当前流行分离株的基因型和进化特征,本研究对PCV2阳性临床样品进行分离鉴定,并对分离毒株进行全基因组序列扩增、测序及遗传进化分析,利用MegAlign7.0和DNAstar软件对分离株ORF2基因编码的Cap蛋白进行氨基酸变异分析和抗原指数预测分析。测序结果显示,PCV2分离株（SMU-2022）的全基因组序列长度为1 767 nt。全基因组和Cap蛋白的遗传进化树结果均显示分离株属于PCV2d基因型,与国内外46株参考毒株的相似性在91.8%～99.1%之间,其中与QZ1410毒株的相似性最高,亲缘关系最接近。关键氨基酸位点变异分析表明,在Cap蛋白上有2个氨基酸特异性突变位点,分别是V30L和T232K。抗原指数分析发现,分离株的Cap蛋白抗原指数与4株疫苗株相比差异较大,主要集中在第20-30、40-75、90-100、130-140、195-205、210-220位氨基酸这6个区域。     

猪圆环病毒2型及3型快速二重PCR检测方法的建立及其应用

针对猪圆环病毒2型(PCV2)和猪圆环病毒3型(PCV3)基因的保守序列设计了2对扩增PCV2和PCV3的特异性引物,通过优化各反应条件,建立同时检测PCV2和PCV3的二重PCR检测方法。敏感性和特异性结果显示,1.08×10~(-8)μg/μL是对PCV2和PCV3的最低检测限具有较好的灵敏度;而对猪细小病毒(PPV)、伪狂犬病病毒(PRV)、大肠杆菌、链球菌、副猪嗜血杆菌、胸膜肺炎放线杆菌的检测结果均无条带,表明所建立的方法具有较好的特异性。应用该方法检测了2017年9月—2018年8月从广西14个地市猪场采集的533份病猪死猪内脏组织,结果显示:PCV2阳性率为23.8%,PCV3阳性率为14.8%, PCV2和PCV3混合感染率为2.8%。广西14个地市中有12个地市的猪场送检样品检测出PCV2,有10个地市的猪场送检样品检测出PCV3,表明PCV2和PCV3在广西受检猪群中普遍存在,要重视和做好PCV2和PCV3感染的防控工作。     

河北北部猪圆环病毒2型流行毒株的遗传变异分析

为了掌握河北北部地区猪圆环病毒2型(PCV2)流行病学特点和遗传变异情况,应用PCR检测方法对2015—2017年间收集的河北北部猪场86份临床病料进行PCV2检测,并对阳性毒株的全基因进行扩增、克隆和测序。结果显示,86份临床样品中,有38份样品为PCV2阳性,阳性率为44.19%,选取11株进行病毒全基因扩增,并利用序列比对软件进行遗传变异分析发现,11株病毒之间同源性为95.9%～99.9%,与各参考毒株之间同源性为93.5%～99.9%。在遗传进化关系上,11株病毒分别处于2个分支:PCV2b和PCV2d,表明河北北部地区PCV2流行比较广泛,并且以PCV2b和PCV2d毒株流行为主。本研究充实了河北北部地区PCV2流行病学调查资料,也为河北PCV2疫苗株的研发和选择提供了依据。     

吉林地区部分规模化猪场猪圆环病毒流行情况调查

为了解猪圆环病毒(Porcine circovirus,PCV)在吉林部分规模化猪场的流行情况,对吉林部分地区的10家规模化猪场的704份样品进行PCR检测,分析猪场PCV流行情况、感染季节及感染地区情况.结果 表明,2017-2019年吉林地区部分规模化猪场PCV2的阳性率为42.0％(296/704),PCV3阳性...     

陕西部分猪场PCV2抗体及病毒检测分析

为了解陕西省猪群中猪圆环病毒2型(PCV2)感染及其免疫抗体情况,2016-2017年间,在陕西省7个地区21个猪场采集544份血清样品(其中8个免疫猪场进行PCV2疫苗免疫,采集320份血清样品;13个非免疫猪场未进行PCV2疫苗免疫,采集224份血清样品),分别通过ELISA方法检测PCV2血清抗体及PCR方法检测PCV2核酸。结果显示,采集的544份血清中PCV2血清抗体平均阳性率为68%(368/544),其中免疫猪场为85%(271/320),非免疫猪场为43%(97/224);PCV2核酸平均阳性率为19%(103/544),其中免疫猪场为10%(32/320),非免疫猪场为32%(71/224)。结果表明,在PCV2疫苗免疫猪场和非免疫猪场均存在PCV2感染情况,疫苗免疫在一定程度上可以减少PCV2的感染,但是并不能完全阻止PCV2的感染。在防控PCV2感染工作中,除了做好生物安全工作以外,疫苗免疫接种是防止病毒感染的有效措施,但还要做好免疫猪抗体检测工作,减少病毒感染,防止猪圆环病毒相关疾病的发生。     

四川省PPV与PCV2的病原流行病学调查

从四川省21个规模化猪场采集样品273份,利用PCR方法检测并分析了猪细小病毒和猪圆环病毒的感染及混合感染情况,结果共检出PPV病原阳性样品47份（占17．22％）;PPV阳性猪场8个（占38．1％）;种猪的感染率较高,仔猪感染率相对较低;检出PCV2病原阳性样品143份（占52．38％）,PCV2阳性猪场18个（占85．7％）;PCV2感染随猪年龄的增长而升高;检出PPV和PCV2混合感染样品29份（占10．62％）;同时存在PPV和PCV2的猪场6个（占28．7％）,混合感染主要集中在母猪和保育仔猪阶段。仅有3个猪场未检出PPV和PCV2病原,占14．3％。该结果说明PPV与PCV2及其混合感染在四川省流行广泛,对养殖业构成了较严重的危害。     

福建省猪圆环病毒4型PCR检测及全基因组序列分析

为了解福建省猪圆环病毒4型(PCV4)流行株的现状和遗传演化,收集了2018年-2019年福建省规模化猪场200份疑似断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)的猪组织病料或血清,通过荧光定量PCR方法进行PCV4的核酸检测。结果表明,200份检测样品中PCV4核酸阳性的有4份,检出率为2%(4/200),成功克隆了1个PCV4全基因组序列(FJ-PCV4)。FJ-PCV4的基因组全长为1 770 bp,与国内PCV4代表毒株(GenBank登录号MK948416和MK986820)核苷酸序列同源性为98.8%～99.2%,与PCV1、PCV2及PCV3代表毒株Eng-1970、AF055392、AF055394、DK1980PMWSfree、BDH、 MN2016和MO2015等的核苷酸同源性为43.3%～52.0%,而与水貂圆环病毒Mink circovirus strain SD16、Mink circovirus strain MiCV-DL13同源性为68.1%～68.2%,表明PCV4是一种不同于PCV1、PCV2和PCV3的新型圆环病毒。研究结果为PCV4的分子流行病学研究提供了基础资料。