猪流行性腹泻病毒单克隆抗体的制备及胶体金免疫层析检测方法的建立

为了建立快速检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)的胶体金免疫层析方法(GICA),本研究用PEDV免疫BALB/c小鼠,制备杂交瘤细胞。分别采用间接ELISA和表面荧光吸附法(CSFIA)筛选,共得到33株能够稳定分泌抗PEDV单克隆抗体(MAb)的杂交瘤细胞株。通过制备小鼠腹水并纯化后测得其中21株细胞分泌的MAb的ELISA效价在1∶1.6×10~4以上,且均仅与PEDV反应,不与TGEV和PRV反应,特异性较强。采用双抗体夹心ELISA法筛选出能够配对检测PEDV的MAb有5株,以其中的4H7为检测抗体、5A9为俘获抗体初步建立了检测PEDV的GICA。该GICA特异性试验结果显示,除了PEDV检测结果为阳性外,该方法对伪狂犬病病毒、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒和传染性胃肠炎病毒的检测结果均为阴性,特异性较强;该方法针对PEDV的最低检测限为7.8×10~3TCID_(50)/mL,敏感性较高;批内和批间重复性检测样品结果无明显差异,具有较好的重复性;将该方法和RT-PCR方法同时检测115份临床样品,该方法与RT-PCR阳性符合率为93%。本实验制备的PEDV MAb,以及基于该AMbs初步建立的检测PEDV的GICA为开发快速检测PEDV的胶体金免疫层析试纸条奠定了基础。     

猪流行性腹泻病毒M蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

为制备猪流行性腹泻病毒(PEDV)抗M蛋白单克隆抗体(MAb),本研究以截短表达的His-M重组蛋白免疫BALB/c小鼠;以截短表达的GST-M重组蛋白作为包被抗原,采用常规的淋巴细胞杂交瘤技术制备杂交瘤细胞,通过间接ELISA进行筛选,得到一株稳定分泌抗M蛋白MAb.MAb亚类鉴定为IgG2b型,轻链为к链,杂交瘤细胞培养上清和诱导的小鼠腹水抗体效价分别为1:3000和1:2×105.Western blot试验表明该MAb能够识别重组及天然的PEDV M蛋白.间接免疫荧光试验表明该MAb能够与PEDV感染的Vero E6细胞产生特异性免疫荧光.     

猪伪狂犬病病毒HeN1株gB蛋白单克隆抗体的制备及B细胞线性表位鉴定

为制备抗猪伪狂犬病病毒(PRV)gB蛋白的单克隆抗体(MAb),本研究将PRV HeN1株全病毒免疫BALB/c小鼠,取免疫后小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0融合,用间接免疫荧光方法筛选,获得了一株稳定分泌抗PRV g B蛋白的杂交瘤细胞株1E7。Western blot结果显示,MAb 1E7与PRV全病毒和真核表达的g B蛋白均能够反应。阻断ELISA试验显示MAb 1E7与PRV的结合可以被猪阳性血清阻断。抗体亚类鉴定显示MAb 1E7的重链为Ig G2b亚类,轻链为kappa链。利用大肠杆菌原核表达系统,表达一系列截短的g B蛋白,最终确定1E7识别的抗原表位是~(81)SAEESLE~(87)。序列分析和western blot结果表明该表位在各PRV病毒株间相对保守。该MAb的制备为建立具有广泛适用性检测PRV野毒感染和疫苗免疫效果评价的阻断ELISA方法奠定了基础。     

猪初乳中PEDV IgA抗体捕获ELISA检测方法的建立及其初步应用

为建立评价猪流行性腹泻病毒(PEDV)疫苗免疫效力的方法，本研究利用纯化的PEDV免疫BALB/c小鼠，按照常规方法制备PEDV全病毒单克隆抗体(MAb)作为捕获抗体，PEDV细胞培养上清为夹心抗原，HRP标记的羊抗猪IgA为二抗，采用棋盘滴定法对各反应条件优化后建立了用于猪初乳中PEDV IgA检测的捕获ELISA方法，并确定其临界值为0.25。采用该捕获ELISA对PEDV、PCV2b、PRRSV、PRV、JEV、PPV、FMDV与CSFV IgA抗体阳性猪初乳进行检测，结果显示，除PEDV IgA抗体阳性猪初乳检测结果为阳性外，其他病毒抗体阳性猪初乳检测结果均为阴性，表明该方法特异性强。采用该方法和BIONOTE PEDV IgA试剂盒对从1∶10开始2倍倍比稀释的16个稀释度的阳性猪初乳样品检测，结果显示该方法对阳性样品检测的最大稀释度为1∶40 960，是BIONOTE PEDV IgA试剂盒敏感性的16倍(1∶2 560)，表明本研究建立方法的敏感性高。分别采用同一批次和不同批次制备的MAb包被的ELISA板分别检测5份PEDV IgA抗体阳性和1份PEDV IgA抗体阴性...     

抗蓝舌病病毒VP6和VP7蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

为制备针对蓝舌病病毒(BTV)的单克隆抗体(MAb),本研究利用血清型1型BTV(BTV1)免疫BALB/c鼠,将其脾淋巴细胞与SP2/0进行融合,并用BTV1包被ELISA板,通过间接ELISA方法筛选出3株稳定分泌抗BTV1的MAb的杂交瘤细胞株(2B10、3D4和4H8)。利用表达BTV1主要蛋白的真核表达重组质粒转染BHK-21后,对所制备的杂交瘤细胞株上清进行间接免疫荧光(IFA)以及western blot鉴定,结果显示:2B10和4H8与VP7蛋白反应,而3D4与VP6蛋白反应。同时,IFA鉴定结果进一步表明,3株MAb与24个血清型的BTV均可以发生反应。本研究制备的MAb为建立BTV免疫学检测方法和相关病毒蛋白的功能研究奠定了基础。     

细胞表面荧光免疫吸附法在猪流行性腹泻病毒N蛋白单克隆抗体杂交瘤筛选中的应用

为验证细胞表面荧光免疫吸附法(CSFIA)筛选高活性杂交瘤细胞的效果,本研究以原核表达的猪流行性腹泻病毒(PEDV)重组N蛋白为免疫原,免疫6周龄～8周龄的BALB/c雌性小鼠,取其脾细胞与SP2/0细胞融合,分别采用CSFIA和间接ELISA方法筛选杂交瘤细胞,并检测目的杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体(MAb)效价。结果显示,CSFIA筛选的MAb 1B1比间接ELISA筛选的MAb 3D3抗体效价高10倍,并且通过观察荧光强度能够实现杂交瘤细胞的一次性筛选,无需多次亚克隆,周期缩短约30 d。本研究表明CSFIA在筛选杂交瘤细胞中具有简单、直观和高效的优点,是一种值得推广的快速制备MAb的新方法。     

牛副流感病毒3型NP单抗的制备及初步应用

为制备牛副流感病毒3型(BPIV3)核衣壳蛋白(NP)单克隆抗体(MAb),本研究利用原核表达并纯化的重组NP (rNP)免疫BALB/c小鼠,取免疫后小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0融合.采用以BPIV3为检测抗原的间接ELISA方法筛选阳性细胞克隆,经3次克隆纯化后获得1株稳定分泌抗NP特异性MAb的杂交瘤细胞株(5E5)并制备腹水,采用rNP及BPIV3包被的ELISA效价分别是2×106和1.28×105.间接ELISA、western blot、IFA试验表明该MAb具有良好的反应性和特异性.经抗体亚类鉴定该MAb亚类为IgGl/κ.特异性试验表明该MAb不与牛传染性鼻气管炎病毒、牛病毒性腹泻病毒反应.免疫组化试验表明该MAb可以检测BPIV3感染动物体内的病原.该MAb还可用于建立检测BPIV3病原及抗体的诊断方法,同时为研究NP的结构和功能提供了条件.     

基于PEDV N蛋白双抗体夹心ELISA检测方法的建立

为了建立猪流行性腹泻(procine epidemic diarrhea,PED)快速病原学诊断方法,试验用纯化的猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)免疫Balb/c小鼠,取免疫小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合筛选阳性杂交瘤细胞,并进行间接免疫荧光试验。在此基础上,以单克隆抗体(MAb)为包被抗体,PEDV阳性猪源多克隆抗体(PcAb)为检测抗体建立检测PEDV抗原的双抗体夹心ELISA(DAS-ELISA)方法,并检测了该方法的特异性、灵敏度、重复性,以及与RT-PCR方法的符合率。结果表明:试验成功筛选到一株能够稳定分泌抗PEDV的MAb 13C3A10-2;通过间接免疫荧光试验鉴定,该MAb为PEDV型特异性MAb;建立的DAS-ELISA方法针对猪传染性胃肠炎病毒、猪德尔塔冠状病毒和猪轮状病毒的检测结果均为阴性;对PEDV CV777细胞毒的最低检出量为5×10~3 TCID_(50)/mL;具有良好的重复性,组内变异系数为4.57%～7.81%,组间变异系数为4.78%～7.36%;DAS-ELISA与RT-PCR比较,阳性符合率为94.7%。说明试验建立的PEDV DAS-ELISA方法可以初步用于PED病原学诊断。     

马传染性贫血病毒基质蛋白p15单克隆抗体的制备

为制备抗马传染性贫病毒(EIAV)的单克隆抗体(MAb),本研究用纯化的重组EIAV基质蛋白作为免疫原免疫BALB/c小鼠,采用淋巴细胞杂交瘤技术,建立了抗EIAV基质蛋白p15抗体的杂交瘤细胞.应用重组p15和EIAV总蛋白为抗原建立的ELISA以及EIAV感染细胞的间接免疫荧光法,对杂交瘤细胞进行了有限稀释法筛选,获得了7株稳定分泌抗p15抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为:1F12、1E2、1E3、4B10、4H7、5E5、4G5.这些抗p15 MAb均能与感染驴胎皮肤细胞的EIAV和经SDS-PAGE分离的EIAV总蛋白中的相应蛋白结合.抗体效价叠加实验表明,这7株MAb中含有至少3种识别不同抗原决定簇的抗体.这些p15 MAb的获得有助于对EIAV和慢病毒的深入研究.     

猪流行性腹泻病毒特异性SIgA抗体间接ELISA检测方法的建立及应用

为检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)特异性分泌性Ig A (PEDV SIg A)抗体,本研究以纯化的PEDV粒子作为包被抗原,以待检初乳或直肠拭子处理样品为检测样品,以HRP标记的鼠抗猪SIg A分泌成分(SC)的单克隆抗体(MAb)为酶标二抗,经过各条件优化,建立了检测初乳和直肠黏膜中PEDV SIg A的间接ELISA方法。并对该方法进行了特异性、敏感性、重复性试验。结果显示,PEDV粒子的最佳包被浓度为5.8 ng/孔,HRP标记的鼠抗猪SC抗体的最佳稀释度为1∶3 000。该方法与TGEV、Po RV感染的初乳样品无交叉反应,特异性较强。当初乳的稀释度在1∶6 400时,该ELISA方法检测结果仍为阳性,敏感性较高;批内和批间重复试验的变异系数均小于10%,表明其重复性较好。该方法的建立为研究猪群感染PEDV和PEDV疫苗免疫后特异性SIg A水平及黏膜免疫评价提供了有效的技术手段,具有很好的应用前景。     

犬细小病毒时间分辨免疫荧光分析方法的建立及初步应用

为建立犬细小病毒(CPV)的时间分辨免疫荧光分析(TRFIA)方法并制备试剂盒,本实验采用抗CPV单克隆抗体(MAb)7D5作为包被抗体,Eu3+标记的MAb 2F7作为检测抗体,对各反应条件优化后制备双抗体夹心TRFIA试剂盒.并评价了其灵敏度、准确度、特异性、重复性和稳定性.利用该试剂盒与RT-PCR方法同时检测了...     

抗蓝舌病病毒VP7和NS2蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

为建立蓝舌病病毒(BTV)的检测方法和研究该病毒蛋白的功能,本研究利用BTV血清8型(BTV8)免疫BALB/c小鼠,取免疫后的小鼠脾淋巴细胞与SP2/0细胞融合,制备单克隆抗体(MAb).并以BTV8作为包被抗原建立间接ELISA方法,经筛选获得了8株稳定分泌抗BTV8 MAb的杂交瘤细胞株(1B2、1F6、2B1、2D10、3B6、3D9、4D4和4D12).Western blot结果显示,MAb 1F6、2B1、2D10、3B6、3D9与BTV8 VP7蛋白反应,MAb B2、4D4、4D12与BTV8 NS2蛋白反应.间接免疫荧光结果显示,该8株MAb与24型BTV血清型呈不同的反应论系.本研究所获得的MAb为建立BTV免疫学检测方法和相关病毒蛋白的功能研究提供了实验依据.     

鲤春病毒血症病毒单克隆抗体的制备及其特性鉴定

为获得针对鲤春病毒血症病毒(SVCV)特异性的单克隆抗体(MAb),以纯化的SVCV为抗原,免疫BALB/c小鼠.将免疫鼠的脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,采用间接ELISA法筛选获得4个能稳定分泌抗SVCV MAb的杂交瘤细胞株;4个杂交瘤细胞制备腹水的MAb效价为1:160 000～1:640 000.亚型鉴定结果表明,这些MAb分属2个亚型(1F1、3E1,IgG2a;3F5、4F9,IgGl),轻链均为K链.Western blot分析显示,MAb1F1、3F5、4F9能特异性地识别SVCV的N蛋白(47 ku),3E1能特异性地识别SVCV的G蛋白(69 ku).采用相加ELISA法对抗原表位分析结果显示,1F1、3F5、4F9可能识别相同的表位,3E1则识别不同的表位.间接免疫荧光试验结果显示4株MAb均能对染毒病灶产生特异性的荧光染色.这些MAb的制备为SVCV免疫学检测方法的建立奠定了基础.     

鸭坦布苏病毒E基因主要抗原域的原核表达及单克隆抗体的制备

为制备鸭坦布苏病毒(DTMUV)E基因主要抗原域的单克隆抗体(MAb),本研究经DNAStar软件分析预测E蛋白含有的优势抗原表位区,以DTMUV QD株基因组RNA为模板,通过RT-PCR扩增涵盖编码主要优势表位的E基因片段(943 bp~1 287 bp),并将其克隆至表达载体p ET-28a中,转化于大肠杆菌中进行诱导表达。对表达的重组蛋白进行western blot鉴定,将纯化后的重组蛋白免疫BALB/c小鼠,取其脾脏细胞与SP2/0细胞融合,经筛选和鉴定,获得了两株能够稳定分泌抗E蛋白的杂交瘤细胞株,命名为4G8和6B12,其亚型均为Ig G1型,并且识别于不同的抗原位点。经间接免疫荧光检测,MAb 4G8和6B12均能够与DTMUV发生特异性反应。本研究所制备的MAb为进一步鉴定DTMUV以及分析囊膜糖蛋白E的结构和功能奠定了基础。     

抗鸭多杀性巴氏杆菌外膜蛋白H单克隆抗体的制备及鉴定

为制备抗鸭多杀性巴氏杆菌(P.multocida)外膜蛋白H(OmpH)单克隆抗体(MAb),本研究以原核表达并纯化的OmpH重组蛋白免疫BALB/c小鼠,将其脾淋巴细胞与SP2/0进行融合,并以重组OmpH蛋白为抗原,通过间接ELISA方法筛选出3株能够稳定分泌抗OmpH的杂交瘤细胞株(1A9、1E9、3G7)。MAb亚类鉴定表明,1A9、1E9和3G7均为IgG1亚类,轻链均为κ链。经western blot和间接免疫荧光检测证明3株MAb均具有良好的特异性。这些抗OmpH MAb的获得,为鸭P.multocida病的快速、有效、敏感的诊断方法建立奠定了基础。     

犬瘟热病毒F蛋白融合信号肽单克隆抗体的制备及其表位的鉴定

为制备犬瘟热病毒(CDV)F蛋白融合信号肽(FSP)的单克隆抗体(MAb)，本研究通过原核表达系统表达CDV HLJ1-13株重组FSP蛋白(rFSP)。将其免疫BALB/c小鼠，通过间接ELISA方法筛选到1株能够稳定分泌抗FSP蛋白MAb的杂交瘤细胞株G8D6E3E5，亚类鉴定结果显示该株MAb重链为Ig G2a型，轻链为κ型。构建一系列表达部分重叠的重组FSP片段，经western blot鉴定该株MAb识别的抗原区域为aa1～aa55，通过合成一系列重叠多肽，经ELISA进一步鉴定该株MAb识别的抗原表位为²¹QQHSTRSTET³⁰。采用western blot检测该株MAb与r FSP的反应原性；采用间接免疫荧光试验(IFA)检测该株MAb与天然FSP的反应原性。Western blot结果显示，CDV Snyder Hill和HLJ1-13株r FSP蛋白样品在34 ku左右均出现特异性条带；IFA结果显示，感染CDV Snyder Hill株48 h后的vero细胞出现红色荧光。以上结果表明，该株MAb既能够与原核表达的CDV...     

牛血清淀粉样蛋白A时间分辨荧光免疫层析检测试剂盒研制

本研究旨在研制一种牛血清淀粉样蛋白A(SAA)时间分辨荧光免疫层析定量检测试剂盒,用于牛奶中SAA含量的临床快速检测。采用双抗体夹心法结合荧光免疫层析技术,在结合垫上固定荧光微球标记的抗SAA单克隆抗体及荧光微球标记的鸡IgY的混合物,在硝酸纤维素膜的检测区包被另一株抗SAA单克隆抗体,在硝酸纤维素膜的质控区包被山羊抗鸡IgY。经抗体原料筛选及荧光微球标记抗体的工艺优化后,绘制标准曲线并对试剂盒的空白限、精密度、稳定性及样本测试性能进行初步评估。结果显示,Medix SAA-2单克隆抗体包被与YBX SAA-3单克隆抗体标记为最适抗体配对原料。荧光微球标记抗体的工艺中,荧光微球与抗体的质量投料比为40∶1、偶联剂与荧光微球羧基摩尔比为2∶1的条件为最优组合。试剂盒标准曲线的四参数拟合曲线方程为y=(1.03947-0.00182)/[1+(x/12.08222)×(-0.84692)]+0.00182,线性相关系数R~2=0.9997。研制的牛SAA检测试剂盒空白限为0.052 mg/L。精密度测试结果显示,批内变异系数15%,批间变异系数20%。室温稳定性试验表明,试剂盒在室温密封存放6个月的荧光T/C值相对跌幅约15%。自制试剂盒与上海蓝基试剂盒的样本对比测试相关系数R~2为0.97。综上所述,本试验研制的试剂盒具有操作简便、灵敏度高、成本低廉等优点,能满足临床测定需求,可作为一种新型牛SAA检测的快捷、准确的检测手段。     

猪流行性腹泻病毒N蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

为了制备猪流行性腹泻病毒(PEDV)的单克隆抗体,本实验以重组PEDV-N蛋白免疫BALB/c小鼠,利用细胞融合技术,经过3～5次亚克隆与筛选,获得了4株分泌抗PEDV McAb的杂交瘤细胞,分别命名为4A7、6C1、5E10和6F7。4株杂交瘤细胞分泌的McAb均为IgM,其轻链均为κ链。ELISA、Western Blot和免疫荧光鉴定结果表明,4株单抗均与N蛋白及PEDV具有良好的结合活性。复苏冻存的4株杂交瘤细胞,连续传代培养30代,4株杂交瘤细胞能够持续稳定分泌抗体,细胞上清的ELISA抗体效价均在1∶800以上。4株细胞诱生的小鼠腹水抗体效价为1∶10~5～1∶10~6。将单克隆抗体(4A7)用于免疫组化试验和IPMA时,其能够特异地识别PEDV人工感染猪小肠组织和Vero细胞内的病毒。上述实验结果表明,制备的单克隆抗体可以用于PEDV抗原检测以及体内病毒的组织定位分析,并可为进一步研发PEDV抗原或抗体检测技术奠定基础。     

检测猪瘟病毒野毒株胶体金免疫层析方法的建立

为建立快速、简便检测猪瘟病毒(CSFV)野毒的胶体金免疫层析方法(GICA),本研究采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒,标记纯化的抗CSFVE2蛋白的单克隆抗体(MAb)6E10作为捕捉抗体,将纯化的抗CSFVE2蛋白的MAbHQ06和兔抗鼠IgG抗体包被在硝酸纤维素膜上,分别作为检测线和质控线,优化反应条件,组装成胶体金免疫层析试纸条。结果表明,所制备的试纸条用于检测CSFV野毒感染的PK-15细胞培养物,在检测线和质控线处均呈现红色条带,健康PK-15细胞培养物对照仅在质控线呈现红色条带;试纸条检出病毒培养物的最低限为103.5 TCID50;用不同批次的试纸条重复检测,结果无差异;该试纸条不与猪瘟兔化弱毒(HCLV)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪轮状病毒(PRV)、伪狂犬病病毒(PrV)、猪细小病毒(PPV)和猪圆环病毒2型(PCV2)反应。所制备的试纸条具有良好的特异性、敏感性和重复性,初步达到了区分检测CSFV野毒株和弱毒株的目的。     

抗东方马脑炎病毒结构蛋白E2单克隆抗体的制备及其抗原表位的鉴定

为制备抗东方马脑炎病毒(EEEV)结构蛋白E2的单克隆抗体(MAb)并鉴定其抗原表位,本研究以Bac-to-Bac真核表达系统表达EEEV E2蛋白,纯化后作为免疫原免疫BALB/c小鼠,取其脾淋巴细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0进行融合.以原核表达载体pET-30a表达并纯化的EEEV E2蛋白作为包被抗原建立间接ELISA方法筛选杂交瘤细胞,获得4株稳定分泌抗EEEV E2蛋白MAbs的杂交瘤细胞株,分别命名为6F3、6F11、7C11、8B11.Western blot与间接免疫荧光试验结果表明,获得的4株MAbs均与EEEV呈阳性反应,而与西方马脑炎病毒、乙型脑炎病毒以及登革热病毒1型～4型呈阴性反应.利用部分重叠的原核表达的短肽对E2蛋白抗原表位进行鉴定,初步确定MAb 6F11、7C11和8B11识别的抗原表位均为E-33 (321EGLEYTWGNHPPKRVW336),而MAb 6F3无短肽与其反应,推测可能为构象表位.本研究结果为建立EEEV型特异性检测方法、研究E2蛋白结构功能及该病的进一步防制奠定了基础.