bta-miR-145通过负调控MYO5A参与布莱凯特黑牛骨骼肌发育的机制研究

骨骼肌的发育是畜禽生长过程中的重要阶段,miRNA作为肌肉生成和骨骼肌再生的基本调节因子具有重要作用,本研究旨在探究bta-miR-145参与调控布莱凯特黑牛背最长肌发育的分子机制。采集布莱凯特黑牛和鲁西黄牛背最长肌进行sRNA建库,通过GO功能注释和KEGG富集分析筛选与骨骼肌功能相关的bta-miR-145,生信分析进行保守性分析及预测其靶基因;以布莱凯特黑牛骨骼肌细胞为细胞模型,转染btamiR-145 mimic和inhibitor,48 h后2%马血清诱导并观察分化过程,CCK-8试验和EdU染色法检测细胞增殖率;qRT-PCR检测靶基因MYO5A以及增殖分化标志基因（PCNA、CDK2、Myf5、Myh1）的表达量。结果表明,转染bta-miR-145 mimic可降低布莱凯特黑牛骨骼肌细胞分化（Myf5、Myh1）和增殖（PCNA、CDK2）标记基因的表达（P<0.01）,抑制MYO5A的表达（P<0.01）,转染bta-miR-145 inhibitor则促进骨骼肌细胞分化和增殖标记基因的表达（P<0.05）,促进MYO5A的表达（P<0.01）...     

BMP15通过bta-miR-2285bc-BMPR2调控牛卵泡颗粒细胞功能的研究

本实验旨在探究牛卵泡颗粒细胞（Granulosa Cells,GCs）bta-miR-2285bc与BMPR2的靶标关系,及其作为BMP15下游关键因子对GCs增殖和卵泡发育的潜在调控作用。利用miRanda预测bta-miR-2285bc与BMPR2 3’UTR的结合位点,构建BMPR2 3’UTR野生型与突变型双荧光报告载体,并通过双荧光素酶报告试验验证其靶标关系;屠宰场获取牛卵巢并于实验室分离直径4～8 mm卵泡,刮取卵泡壁GCs进行体外培养。设置浓度梯度,根据BMPR2表达量确定BMP15最适添加浓度。转染bta-miR-2285bc mimics/inhibitor至GCs并添加BMP15,qRT-PCR和Western blotting分别检测BMPR2 mRNA和蛋白表达,随后qRT-PCR检测GCs BMP/Smad信号通路、增殖、凋亡和类固醇激素合成相关基因表达水平,Elisa检测细胞培养液中雌激素（E2）和孕激素（P4）浓度。结果显示：bta-miR-2285bc能够靶向结合BMPR2 3’UTR;向体外培养的GCs添加最适浓度BMP15(100ng/mL)并转染b...     

bta-miR-205和bta-miR-497调控牛病毒性腹泻病毒复制的研究

为探究bta-miR-205和bta-miR-497对牛病毒性腹泻病毒(BVDV)复制的调控作用,在前期建立BVDV感染MDBK细胞miRNAs差异表达谱的基础上,筛选出表达量显著差异的bta-miR-205和btamiR-497,通过生物信息学软件预测、荧光素酶报告基因检测等方法鉴定bta-miR-205和bta-miR-497的靶基因。应用RT-qPCR和病毒滴度测定等方法验证bta-miR-205和bta-miR-497对BVDV复制的影响。结果发现,bta-miR-205能显著抑制BVDV的复制,而bta-miR-497显著促进BVDV的复制。研究结果为BVD防控提供了新的思路和依据。     

CRTC2基因在不同品种和月龄肉牛的表达分析

为了研究肉牛CREB转录激活因子2(CRTC2)基因在肌肉组织中不同品种和月龄的表达情况,探讨CRTC2基因与生长发育的关系,利用qRT-PCR技术检测CRTC2基因在不同组织和不同月龄的表达规律;运用Western blot和免疫组化方法对CRTC2蛋白进行定量定位分析,探讨CRTC2蛋白的表达规律。结果显示:布莱凯特黑牛胰脏中CRTC2基因mRNA的表达量极显著高于其他组织(P0.01),睾丸中CRTC2基因mRNA的表达量最低;CRTC2基因在不同时期随着月龄的增加表达量逐渐降低,其中2和6月龄mRNA表达量极显著高于10和18月龄(P0.01),18月龄表达量最低;4个月龄布莱凯特黑牛的CRTC2表达量均高于鲁西黄牛,且2和6月龄品种间差异极限著(P0.01);CRTC2蛋白随着月龄的增加呈现逐渐降低的趋势,其中2月龄表达量极显著高于其他月龄(P0.01),18月龄相对表达量最低;4个月龄布莱凯特黑牛蛋白表达量均极显著高于鲁西黄牛(P0.01)。提示:CRTC2基因主要在肌肉组织的肌原纤维中表达,可能参与动物的早期分化和生长相关过程,对调控肌肉生长发育发挥重要作用。     

MYLPF基因在肉牛肌肉生长过程中的功能研究

试验旨在探究快肌肌浆球蛋白可调节磷酸化轻链（myosin light chain,phosphorylatable,fast skeletal muscle,HUMMLC2B或MYLPF）基因在布莱凯特黑牛各组织中的表达情况,以及布莱凯特黑牛与鲁西黄牛背最长肌中MYLPF基因表达量的变化规律,为探讨其与肌肉生长发育关系奠定基础。以布莱凯特黑牛和鲁西黄牛为研究对象,利用实时荧光定量PCR检测其背最长肌、心脏、肺脏、肝脏、脾脏等10个组织中MYLPF基因的表达情况,并对布莱凯特黑牛和鲁西黄牛2、6、10和12月龄4个不同时期背最长肌中MYLPF基因的表达量变化进行研究。结果表明,MYLPF基因在背最长肌中高表达,在心脏中少量表达,在其他组织中几乎不表达。MYLPF基因在2、6、10和12月龄牛背最长肌中均高表达,但随着年龄的增加MYLPF基因的表达量逐渐降低,2月龄的表达量最高,极显著高于其他3个时期（P<0.01）,12月龄表达量最低。4个时期布莱凯特黑牛背最长肌中MYLPF基因的表达量均高于鲁西黄牛,其中10月龄差异极显著（P<0.01）,2和12月龄差异显著（P<0.05）,6月龄差异不显著（P>0.05）。综上结果表明,背最长肌中MYLPF基因可能对骨骼肌生长发育起调节作用,可为研究肉牛骨骼肌生长发育机理和阐明肌肉生长的分子机制提供参考。     

miR-1对牛骨骼肌卫星细胞增殖的影响

探讨miR-1对牛骨骼肌卫星细胞增殖的影响,为改善牛肉品质提供重要的理论基础。首先构建miR-1的过表达载体并进行牛骨骼肌卫星细胞的转染,然后采用Ed U法检测发现miR-1抑制牛骨骼肌卫星细胞的增殖。双荧光素酶报告表明PAX3为miR-1的靶基因。最后检测出miR-1过表达后PAX3在mRNA和蛋白表达水平均下降。试验结果提示:miR-1能够通过抑制PAX3的表达而抑制牛骨骼肌卫星细胞的增殖。     

牛畸胎瘤衍化生长因子TDGF1基因过表达对成肌细胞增殖的影响

为明确牛畸胎瘤衍化生长因子(TDGF1)对成肌细胞(C2C12)增殖的影响,利用定向克隆和细胞转染技术获得可稳定过表达牛TDGF1基因的C2C12细胞系,Western blot(WB)和荧光定量PCR技术检测TDGF1在C2C12细胞系中的表达量,MTT法检测C2C12细胞的增殖。结果表明,成功构建了pIRES2-EGFP-TDGF1真核表达载体,牛TDGF1基因在C2C12细胞中的表达量显著上调,并成功表达出TDGF1蛋白,且过表达牛TDGF1基因可抑制C2C12细胞增殖,在转染30h时抑制作用最显著。     

牛骨骼肌卫星细胞的分离鉴定和诱导分化

为了在体外研究西门塔尔牛的肌肉生长发育过程并建立牛骨骼肌卫星细胞的原代细胞模型。本研究采用0.2%的Ⅱ型胶原酶消化后再使用0.25%胰酶消化获得牛骨骼肌卫星细胞（bovine skeletal satellite cell,BSSC）,并利用差速贴壁法分离获得纯化后的BSSC,使用RT-PCR、免疫荧光染色和Western blotting等方法鉴定BSSC,使用成脂诱导剂诱导其分化为脂肪细胞,油红O染色鉴定分化后细胞的成脂能力,使用2%马血清诱导其分化为肌细胞,RT-PCR鉴定静止期PAX7基因和肌细胞的标记基因MyoG在诱导前后表达量的变化。结果发现,分离纯化得到的BSSC呈梭形或纺锤形,细胞形态饱满,折光性强,随着培养时间的延长,细胞由原来的无序生长变为有序生长;RT-PCR检测发现,BSSC表面标志基因Desmin、c-Met、Myf5和特异性标志基因PAX7均呈阳性表达;免疫荧光染色及Western blotting结果显示,PAX7和MyoD基因均呈阳性表达;成脂细胞诱导分化后被油红O大量染色并观察到大量脂滴出现;成肌细胞诱导分化后静止时期PAX7基因表达量诱导前高于诱导分化后,而成肌标记基因MyoG表达量诱导前低于诱导分化后。综上,本研究成功分离获得BSSC,并证明BSSC具有分化成脂肪细胞和肌细胞的能力,为体外研究西门塔尔牛肉制品调控机制提供原代细胞模型。     

牛UCP3和MYH1基因启动子在C2C12和3T3-L1细胞中的启动活性分析

为阐明牛解偶联蛋白3（uncoupling protein 3,UCP3）和肌球蛋白重链1（myosin heavy chain 1,MYH1）基因启动子的核心区及其在小鼠C2C12和3T3-L1两种细胞株中的启动活性,本研究利用PCR、双荧光素酶和脂质体转染等方法进行关岭牛UCP3和MYH1基因启动子的扩增、重组载体构建和启动子活性分析。结果显示,试验成功构建了pGL3-Basic-UCP3-pro和pGL3-Basic-MYH1-pro重组真核表达载体,分别转染至小鼠C2C12和3T3-L1细胞后发现,UCP3、MYH1基因启动子的核心区分别为UCP3-P6（－385~+3 bp）和MYH1-P5（－255~+15 bp）区域;pGL3-Basic-MYH1-P2~pGL3-Basic-MYH1-P5在C2C12细胞中启动子活性均高于3T3-L1细胞,表明MYH1基因启动子活性在成肌细胞C2C12中较高。本研究阐明了UCP3和MYH1基因启动子的核心区及其启动子活性,为进一步研究UCP3和MYH1基因的转录调控机理提供了科学依据。     

PARK7基因对氧化应激的调控研究进展

在规模化养殖模式下,畜禽在生长过程中会不可避免地面对各种不利因素,导致体内产生氧化应激,严重影响其生长发育。畜禽体内存在多种抗氧化因子来应对氧化应激。其中,帕金森相关蛋白7(Parkinson’s Disease-Associated Protein 7,PARK7)基因是细胞氧化应激中重要的调控因子之一。PARK7通过自身半胱氨酸的氧化水平感受氧化应激信号,并通过Nrf2、ERK1/2和PI3K/Akt等途径促进抗氧化酶的生成,提高细胞的抗氧化能力,从而减轻氧化应激引起的损伤。本文对PARK7基因在氧化应激中的调控作用和通路进行综述,将有助于畜禽氧化应激的调节机制研究。     

猪IRS1基因对C2C12细胞系增殖分化的影响

本课题组在前期研究中发现IRS1是民猪和大白猪背最长肌中存在表达差异的一个关键基因,为了深入探讨IRS1在骨骼肌细胞中发挥的生物学功能,本研究首先将猪的IRS1基因完整编码区序列连入pcDNA3.1载体内,构建过表达质粒,同时人工合成IRS1的siRNA干扰序列,在C2C12细胞系内过表达或干扰IRS1基因,使用qRT...     

let-7g对小鼠乳腺发育和泌乳相关功能基因Tgfbr1的作用及其机理

运用生物信息学方法对let-7g进行靶基因预测,构建含有与其结合位点互补序列的荧光素酶报告质粒将其与phRL-TK及let-7gmimics或negative control共转染小鼠乳腺上皮细胞,双荧光素酶报告系统检测试剂盒测定荧光素酶的表达;用let-7ginhibitor和let-7g mimics或negative control分别转染小鼠乳腺上皮细胞,并应用细胞活力分析技术、qRT—PCR技术、Western blotting、HPLC分析let-7g的表达变化及其对小鼠乳腺上皮细胞的影响。结果显示：经酶切及测序证实荧光素酶报告质粒构建成功;将荧光素酶报告基因、phRL—TK与let-7g mimics共转染小鼠乳腺上皮细胞,荧光素酶活性与对照组（即共转染荧光素酶报告基因、phRL-TK与Negative Control的小鼠乳腺上皮细胞组）相比显著降低（P〈0．05）;与阴性对照组和空白对照组相比较,let-7g inhibitor转染后,TGFβ3RI蛋白表达量显著增加（P〈0．01）,细胞活性显著增强（P〈0．05）,β-酪蛋白表达量增加（P〉0．05）,而let-7g mimics转染后,TGFβRI蛋白表达量显著减少（P〈0．01）,细胞活性显著降低（P〈0．05）,β-酪蛋白表达量显著减少（P〈0．05）。结果表明,在小鼠乳腺上皮细胞中,let-7g能够靶向结合Tgfbr1,且负调控其表达;let-7g可通过抑制靶蛋白TGFβRI的表达,进而调控小鼠乳腺上皮细胞的增殖及β-酪蛋白的分泌。     

MiR-106a-5p靶向E2F3和SP-1抑制C2C12细胞成肌分化的研究

为探究miR-106a-5p对成肌分化的作用及潜在调控靶点,在线预测miR-106a-5p潜在靶基因,通过RT-qPCR及Western blot检测miR-106a-5p对靶基因的调控作用,利用双荧光素酶报告系统验证miR-106a-5p与靶基因之间的互作,并以C2C12细胞系为实验模型,采用过表达技术,在细胞形态学水平初步探索其对成肌分化的作用。在线预测发现E2F3和SP-1可能是miR-106a-5p的潜在靶基因;RT-qPCR分析表明,miR-106a-5p与E2F3和SP-1的表达模式相反;Western blots结果发现,miR-106a-5p抑制E2F3和SP-1蛋白翻译;双荧光素酶报告载体系统表明,E2F3和SP-1是miR-106a-5p调控成肌分化的靶基因;此外,超表达miR-106a-5p抑制C2C12细胞分化,肌管数目显著减少。结果表明,E2F3和SP-1是miR-106a-5p抑制C2C12细胞成肌分化的靶基因。     

JMJD1C对牛卵丘细胞H3K9me1、H3K9me2的去甲基化作用

KDM3家族成员中KDM3A、KDM3B能够特异性去除H3K9me1与H3K9me2的甲基化修饰,而JMJD1C作为KDM3家族成员之一,与KDM3A、KDM3B即JMJD1A、JMJD1B含有相似的Jmj C结构域,但JMJD1C是否也具有对H3K9的催化作用或活性一直不明确。本研究利用RNAi方法抑制JMJD1C的mRNA表达水平,随后通过免疫荧光方法检测H3K9me1与H3K9me2的甲基化程度。结果表明,3T3-L1细胞和卵丘细胞中均存在JMJD1C的表达,并且存在H3K9me1与H3K9me2的甲基化修饰。通过siRNA对牛卵丘细胞中JMJD1C mRNA的表达进行成功抑制后,转染组JMJD1C的表达量明显下降,但免疫荧光结果显示H3K9me1、H3K9me2表达量无明显变化,即JMJD1C在mRNA水平上对去除H3K9me1与H3K9me2的甲基化修饰并无明显作用。     

过表达MyBPC1对牛骨骼肌卫星细胞增殖分化的影响

旨在探究肌球蛋白结合蛋白C1（myosin binding protein C1,MyBPC1）对牛骨骼肌卫星细胞增殖与成肌分化的影响,为进一步研究MyBPC1在细胞分化和肌肉发育过程中的调控作用提供依据。本研究利用西门塔尔胎牛原代牛骨骼肌卫星细胞体外诱导成肌分化模型模拟牛骨骼肌的生长发育过程。采用qRT-PCR和Western blot检测MyBPC1的细胞时序表达谱。试验分为两组。在RNA水平每组4个重复,每个重复20 μL;在蛋白水平每组3个重复,每个重复15 μg。采用qRT-PCR和Western blot检测牛骨骼肌卫星细胞转染MyBPC1的过表达效果,并进一步检测细胞增殖期标志因子Pax7、Ki67以及细胞分化期标志因子MyHC、MyOG的表达变化情况,观察牛骨骼肌卫星细胞肌管形成状态。结果,MyBPC1在牛骨骼肌卫星细胞分化前后表达水平存在极显著差异,牛骨骼肌卫星细胞诱导分化后MyBPC1的mRNA和蛋白表达量均极显著高于增殖期（P<0.01）。过表达MyBPC1后,细胞分化形成的肌管数量明显多于对照组,增殖标志因子Pax7的mRNA水平和蛋白表达水平无显著差异,分化标志因子MyHC的mRNA水平和蛋白表达水平极显著高于对照组（P<0.01）。过表达MyBPC1可以促进牛骨骼肌卫星细胞体外成肌分化,为进一步开展MyBPC1对牛骨骼肌卫星细胞的调控机制奠定基础。     

绵羊干扰素调节因子-1基因在COS-7细胞中转染表达的研究

本研究旨在构建真核表达载体pIR ES2-EGFP-IR F1,并在COS-7细胞中过量表达。根据绵羊IRF1基因cDNA序列设计、合成引物,构建真核表达载体pIR ES2-EGFP-IR F1质粒,用电穿孔法,以表达质粒转染COS-7细胞,并用LPS刺激,用定量PCR方法检测IRF1基因的表达量是否升高。结果表明:重组质粒pIR ES2-EGFP-IR F1转染细胞后,可以观察到绿色荧光蛋白的表达,并且可以过量表达,与空白对照组相比差异极显著(P<0.01),说明通过转染的确会对细胞造成影响,排除转染试剂及未融合GFP的作用后,效果仍然明显。利用LPS刺激后,随着作用时间延长至24 h,IRF1基因的表达量较未用LPS作用的对照组有更高倍数的提高。     

P7C3-A20对创伤性脑损伤的PC12细胞凋亡和氧化的影响

旨在研究3,6-二溴-beta-氟-N-(3-甲氧基苯基)-9H-咔唑-9-丙胺(P7C3-A20)对大鼠肾上腺髓质嗜铬瘤分化细胞株(PC12细胞)创伤性脑损伤(TBI)的修复作用。将细胞分为对照组(A组)、模型组(B组)、0.03 μmol·L^-1药物治疗组(C组)、0.3 μmol·L^-1药物治疗组(D组)、3 μmol·L^-1药物治疗组(E组)和药物空白组(F组),TBI细胞模型通过使用10 μL枪头划出横竖相间4 mm的直线来制备。使用CCK8试剂盒检测细胞活力,荧光显微镜观察细胞凋亡、活性氧(ROS)情况,荧光定量PCR仪检测半胱氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)、B细胞淋巴瘤/白血病-2基因(Bcl-2)、血红素氧合酶1(HO-1)、NAD (P) H:醌氧化还原酶1(NQO1)和谷氨酸半胱氨酸连接酶催化亚基(GCLC)的mRNA相对表达量。结果显示：TBI造模后细胞活力极显著降低(P<0.01),0.03 μmol·L^-1浓度的P7C3-A20能显著提高TBI后的细胞活力(P<0.05),0.3 μmol·L^-1浓度的P7C3-A20能极显著提高TBI后的细胞活力(P<0.01)。TBI造模后细胞早晚期凋亡细胞比例极显著增加(P<0.01),0.03 μmol·L^-1浓度的P7C3-A20能显著减少TBI后的早期凋亡细胞比例(P<0.05),极显著减少TBI后的晚期凋亡细胞比例(P<0.01),0.3和3 μmol·L^-1浓度的P7C3-A20能极显著减少TBI后的早晚期凋亡细胞比例(P<0.01)。TBI造模后活性氧细胞比例极显著增加(P<0.01),0.03和3 μmol·L^-1浓度的P7C3-A20能显著减少TBI后的活性氧细胞比例(P<0.05),0.3 μmol·L^-1浓度的P7C3-A20能极显著减少TBI后的活性氧细胞比例(P<0.01)。0.3 μmol·L^-1浓度的P7C3-A20能极显著减少TBI后Caspase-3的mRNA相对表达量(P<0.01),显著提升TBI后Bcl-2、HO-1、NQO1和GCLC的mRNA相对表达量(P<0.05)。P7C3-A20对TBI后的PC12细胞有抗凋亡、减轻氧化应激的修复作用。