甘蓝型油菜MAP激酶4的序列及其诱导表达分析

拟南芥MPK4（AtMPK4）在病害抗性中具有重要作用。本文克隆和分析了油菜MPK4（BnMPK4）的cDNA及其氨基酸序列和诱导表达变化。推导的氨基酸序列含有T201E202Y203磷酸化位点和CD锚定区域,与AtMPK4的序列相似性为95%。用化学物质苯丙噻重氮、甲基茉莉酸、草酸以及核盘菌（Sclerotinia sclerotiorum）分别处理油菜品种中双9号,采用荧光定量PCR方法测定BnMPK4在各诱导或处理后的表达量。结果表明,苯丙噻重氮快速诱导该基因的表达,甲基茉莉酸抑制其表达;草酸和核盘菌均快速诱导该基因上调表达,并且二者的上调表达趋势相似。结果表明油菜MPK4可能在油菜菌核病防卫反应中起作用。     

甘蓝型油菜BnTLP1基因的菌核病抗性研究

前期发现甘蓝型油菜类甜蛋白基因BnTLP1在菌核病抗性品种中的表达丰度高,为探究和解析其作用机制,通过叶片接种核盘菌,对拟南芥BnTLP1过表达转基因株系、野生型对照和突变体tlp1-1之间的抗菌核病效果进行分析。结果表明：过表达BnTLP1拟南芥的病斑面积显著小于野生型对照,而tlp1-1病斑扩展大于对照,即BnTLP1正调控菌核病抗性。亚细胞定位表明BnTLP1定位于细胞膜和细胞核,暗示其不仅在细胞膜发挥抑菌功能,而且在核内行使其它功能。不同防御反应信号通路的标志基因表达分析表明,茉莉酸/乙烯途径可能在早期参与了BnTLP1介导的菌核病抗性。     

核盘菌诱导下甘蓝型油菜宁RS-1 的SSH文库构建

以甘蓝型油菜宁RS-1为材料,用核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary)对6叶期幼苗进行接种。提取经核盘菌诱导前和诱导后的宁RS-1叶片mRNA,经反转录成cDNA,以及经过酶解后加接头和两次杂交,构建差异表达的抑制消减(SSH)cDNA文库。正向消减文库是以诱导后的宁RS-1 cDNA为tester,以正常的宁RS-1 cDNA为driver。所构建的正向文库重组率达到96.2%,反向文库重组率达到94.5%,文库容量均达到了2 190和2 780,表明所构建的文库质量良好。对从文库中随机挑取的克隆进行测序分析,获得了与抗病和代谢有关的基因,如γ-谷氨酰半胱氨酸酶基因、抗真菌蛋白基因、铁蛋白基因、ACC氧化酶基因等,为开展油菜抗菌核病重要功能基因的克隆和鉴定奠定了基础。     

甘蓝型油菜-核盘菌酵母双杂交cDNA文库构建及BnJar1互作蛋白筛选

油菜与核盘菌相互作用的过程中,JA（茉莉酸）合成相关基因表达量升高,但是JA信号传递却受到了抑制,推测核盘菌分泌的效应蛋白可能直接或间接作用于JAR1蛋白,使其活性降低,从而抑制依赖JA途径的油菜防御系统。前期通过转录组测序获得了差异表达基因BnJar1全长序列,为进一步揭示BnJar1基因参与油菜-核盘菌相互作用过程的机理,本研究对BnJAR1蛋白进行生物信息学分析和预测,构建了核盘菌-油菜互作表达基因酵母文库,并以BnJar1作为诱饵蛋白对文库进行酵母双杂交筛选,获得了5个来自油菜的互作蛋白：丙二烯氧化物环化酶2(BnAOC2)、COP9信号复合物（BnCOP9）、4a-羟基四氢生物蝶呤脱水酶（BnDcoH）、腈水解酶2(BnNIT2)和茎特异性蛋白（BnTSJT1）;2个来自核盘菌的互作蛋白：MFS结构域蛋白（SsMFS）和Rho3 GTP酶（SsRho3）。相关结果为研究油菜-核盘菌的相互作用,挖掘致病或抗病相关基因,进一步解析其机理奠定了基础。     

甘蓝型油菜AOC基因家族鉴定与表达分析

丙二烯氧化物环化酶(allene oxide cyelase,AOC)是茉莉酸(jasmonic acid,JA)信号途径中一个重要的合成酶,在植物生长发育、光合作用、物质代谢和逆境胁迫应答等多个方面发挥重要作用.为了探究AOC基因在甘蓝型油菜(Brassica napus L.)中的家族特征,本研究以4个拟南芥AtA...     

甘蓝型油菜BnADC基因的克隆及原核表达

利用同源克隆和RACE(Rapid amplification of cDNA ends)技术从甘蓝型油菜中克隆到精氨酸脱羧酶(Arginine decarboxylase,ADC)基因cDNA全长序列,命名为BnADC。BnADC全长为2 649bp,包含344bp的5′非翻译区(5′ Untranslated region,5′-UTR)、226bp的3′非翻译区(3′ Untranslated region,3′-UTR)和2 079bp的完整开放阅读框(open reading frame,ORF),编码75.1kD的蛋白质。5′-UTR中含有12bp的uORF (Upstream open reading frame),编码MIRE 4个氨基酸。氨基酸同源性比对表明,BnADC蛋白与其他植物ADC蛋白具有很高的相似性,与芥菜的同源性高达93%;系统进化树分析表明,BnADC与芥菜、拟南芥的ADC亲缘关系较近。在获得全长cDNA的基础上,构建融合表达载体pET30a(+)-BnADC,转化大肠杆菌（Escherichia coli）表达菌株BL21(DE3),SDS-PAGE检测到一个约81.1kD的融合蛋白被E. coil表达,且融合蛋白主要存在于菌体沉淀中。     

甘蓝型油菜BnERF104超表达增强了转基因拟南芥对核盘菌的抗性

根据拟南芥乙烯响应因子AtERF104的序列设计保守引物,从甘蓝型油菜品种中双9号中克隆到AtERF104的同源基因BnERF104。序列分析表明BnERF104蛋白含有一个典型的ERF domain保守结构域,属于乙烯响应转录因子ERF家族的成员。甘蓝型油菜用核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)接种6h后,BnERF104基因被诱导显著上调表达。BnERF104基因在拟南芥中的超表达提高了病原相关蛋白(PR)防御素PDF1.2和几丁质酶ChiB基因的表达量,显著增强了对腐生营养型真菌核盘菌的抗性。     

甘蓝型油菜种子贮藏蛋白遗传距离与杂种优势关系研究

对38份不同生态区来源的甘蓝型油菜种质进行了贮藏蛋白电泳多态性分析,并对165个杂交组合农艺、品质性状表现及杂种优势与亲本贮藏蛋白距离进行相关分析,探讨了贮藏蛋白标记遗传距离辅助甘蓝型油菜农艺及品质杂种优势利用的可能性。结果表明：甘蓝型油菜种子贮藏蛋白多态性丰富;谷蛋白标记遗传距离（GDglu）、清蛋白标记遗传距离（GDalu ）与农艺、品质性状杂种后代表现及中亲优势存在不同程度的相关性,可以利这种相关性及谷蛋白标记遗传距离聚类辅助甘蓝型油菜杂交育种和品质育种的亲本选配,提高选配效率。     

甘蓝型油菜BnERF50的超表达增强了转基因拟南芥对核盘菌的抗性

从接种核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)后的甘蓝型油菜品种中双9号cDNA芯片中筛选出一个新的抗性相关基因BnERF50。序列分析表明该基因产物BnERF50蛋白含有一个典型的ERF(乙烯相应转录因子)保守结构域,属于ERF家族成员。接种核盘菌24h后,该基因的表达量被诱导显著上调。在它的超表达转基因拟南芥中,病原相关蛋白(PR)防御素基因PDF1.2和几丁质酶基因ChiB的表达量升高,对腐生营养型真菌核盘菌的抗性显著增强。     

甘蓝型油菜生育期天数与产量构成性状的相关分析

对四川省大面积推广的甘蓝型油菜品种各生育期天数与单株产量及产量构成性状进行相关性和通径分析,结果表明:(1)营养生长天数和角果成熟天数均与单株产量显著正相关,开花天数与单株产量显著负相关;营养生长天数与每果粒数极显著正相关,但与千粒重负相关;开花天数与产量构成性状负相关;角果成熟天数与每果粒数及千粒重极显著正相关,但与单株有效角果数负相关.(2)各生育期天数对单株产量的作用主要通过产量构成性状的间接作用形成;生育期性状对每果粒数的作用大小为角果成熟天数＞营养生长天数＞开花天数;对千粒重的作用效果为角果成熟天数＞开花天数＞营养生长天数.因此,在甘蓝型油菜品种的选育中,在进行产量构成性状选择的同时,辅以生育期天数的选择,充分利用各性状间的相互作用,提高单株产量以到达高产的目的.     

油菜抗菌核病的部分生理生化机制

中感品种甘油5号植株组织中的钙含量高16.4%。油菜植株组织中的铁含量高，感病性强。而锰、锌、铜的含量与抗菌核病没有相关性。单宁含量与抗病性的关系，试验结果表明，各供试品种，接种处理比对照（不接种）的单宁含量高，品种间相比，无论对照还是处理，抗性强的品种单宁含量均高于高感品种（98C40）。丙二醛的含量与油菜对菌核病的抗病性没有明显的关系。油菜植株的内源草酸含量与品种的抗病性有关，高抗品种比感病病对照，其内源草酸含量高22.2%。苯丙氨酸解氨酶（PAL）酶活性品种间无显著差异。SOD酶酶活性与抗病性的关系，不同类型的品种在接种菌核菌后，叶片中SOD活性变化不同。感病品种受到菌核菌侵染后，叶片中SOD酶活性增加值大于抗病品种。呼吸强度与抗病性的关系，接种后呼吸强度下降快的品种抗性强。 矿质元素、单宁、内源草酸含量，超氧物歧化酶（SOD）的活性及呼吸强度均与油菜品种（系）的抗病性有关。矿质元素中钙含量与抗病性有关。三个抗病品种（M004、中R-888、085）组织中的钙含量均高于中感品种（甘油5号）和高感病品种98C40；高抗品种中R-888比     

抗菌核病双低油菜新品种中双9号的选育

中双9号是采用复合杂交和小孢子培养技术相结合选育的双低甘蓝型油菜新品种,具有高抗菌核病,高抗倒伏,丰产性突出,稳产性好,品质优良,适应性广等优点。2000-2002年湖北省区域试验中,菌核病抗性强,菌核病平均发病率为13.31%,比对照中油821降低了28%;病情指数为6.47,比对照中油821降低了36%,平均产量2482.2kg/hm^2,比对照中油821增产15.33%。种子芥酸含量0.23%,商品籽硫甙含量22.69μmol/g,含油量42.0%。2002年通过湖北省农作物品种审定委员会审定,是一个极具推广应用前景的优良品种,是油菜抗菌核病和抗倒性育种的优良资源。     

甲基茉莉酸、苯丙噻重氮、草酸 诱导油菜对菌核病的抗性

采用温室盆栽方法研究甲基茉莉酸(MeJA) 、苯丙噻重氮(BTH)和草酸(OA)诱导油菜对菌核病产生的 局部和系统抗性。结果表明, 0. 01～1. 0mmol/L BTH, 0. 1～1. 0mmol/L MeJA和0. 5～15mmol/L OA均能有效诱导 局部和系统抗性,系统抗性比局部抗性产生晚。Trypan blue染色结果表明,在MeJA,BTH和低浓度OA诱导过的油 菜叶片中,菌丝生长受到抑制,表现为菌丝变粗、弯曲。较低浓度(如0. 01mmol/L MeJA, 0. 5mmol/L OA)下虽然易 诱导局部抗性,而系统抗性较弱, 0. 01mmol/L MeJA几乎不诱导系统抗性。高浓度(如20mmol/L以上)OA有致病 作用。     

用基于PCR的分子标记分析甘蓝型油菜抗感菌核病品系间的遗传距离

用离体叶接种法鉴定了甘蓝型油菜选系对菌核病的抗感性,结果表明绝大多数抗性品系与感病品种间的差异达到显著或极显著水平。以两种基于ＰＣＲ的标记估计所选１０ 份材料间的遗传距离。１９ 个随机引物扩增出了２６ 条重复性很好的ＲＡＰＤ 标记,１ 对依据植物Ｒ基因的ＮＢＳ区段设计的简并引物扩增出了３ 条多态性的带。依据２９ 个标记进行聚类分析,结果表明抗、感性材料在遗传距离为０．１２０６ 处被明显地区分开。５份抗性材料中,宁ＲＳ—１ 与中油８２１、中Ｒ８８８ 等其它抗性品系的遗传距离较远     

甘蓝型油菜抗菌核病扩展的遗传分析

以核盘菌菌丝体接种11个油菜品种（系）的离体叶片，结果表明不同品种间病斑大小差异显著，病斑随接种后时间延长呈逻辑斯蒂曲线增长，抗、感品种之间抗病斑扩展的差异显著，条件方差分析表明，草酸浸根处理第3d到第4d，油菜抗毒素的条件广义遗传力达0．784；草酸浸叶柄处理第3d到第4d，加性方差占总方差23．1％，处理第4d到第5d加性方差下降为0，表明条件加性效应值和条件显性效应值在不同的时段是不同的。     

甘蓝型油菜远缘杂交新品系某些酶的活性与抗菌核病的关系

以中抗品种中油８２１和感病品系Ｓ—８９为对照,研究了甘蓝型油菜远缘杂交新品系９６２９和ＹＤ１６接种菌核病菌前后叶片中多酚氧化酶（ＰＰＯ）和过氧化物酶（ＰＯ）的活性变化。结果表明：４个材料接种菌核菌后的酶活性均较对照组高。ＰＰＯ的活性,抗病品系９６２９＞中抗品种（系）８２１和ＹＤ１６＞感病品系Ｓ—８９。抗病和中抗病品种（系）的ＰＯ活性高于感病品种。     

油菜F-box-LRR基因全基因组鉴定与核盘菌诱导应答分析

由核盘菌引起的菌核病是一种重要的真菌性病害,筛选菌核病抗病基因对抗病育种具有重要意义。F-box基因多参与植物抗逆反应,LRR作为抗病基因的重要结构域,在植物抗病防卫中起着重要的作用。本研究通过生物信息学方法在甘蓝型油菜基因组中对F-box-LRR基因进行了全基因组鉴定,基于已发表的中双11组织表达数据以及油菜不同品种中油821（抗病）和Westar（感病）接种核盘菌前后的转录组数据,对可能响应核盘菌诱导的BnF-box-LRR基因进行筛选,并结合荧光定量PCR进行验证。共鉴定到161个BnF-box-LRR基因,从系统进化树上可分为4个亚类（FBXLRR1,FBXLRR2,FBXLRR3和FBXLRR4）,其中第四亚类FBXLRR4在蛋白保守序列分布以及基因结构方面,与其它三个亚类具有较大差异,且与拟南芥参与植物抗逆的同源基因聚为一类,因此推测该分支可能主要参与植物胁迫响应。表达分析表明FBXLRR4家族基因在根和叶中有较高的表达水平,且在核盘菌诱导后具有明显的表达变化,暗示这些基因可能参与油菜菌核病抗性功能。