铜绿假单胞菌OprL基因DNA疫苗的免疫效果

为研究铜绿假单胞菌OprL基因DNA疫苗在小鼠体内的免疫效果,本研究利用PCR技术扩增得到铜绿假单胞菌的OprL基因,将其克隆于真核表达载体pcDNA3.1(+)中构建重组质粒pOPRL。将BALB/c小鼠分为5组,分别免疫pOPRL、油乳剂灭活疫苗、OMP疫苗、pcDNA3.1(+)空载体和PBS。每两周免疫一次,共免疫3次。间接ELISA检测免疫后血清特异性抗体水平,MTT法检测免疫小鼠脾淋巴细胞增殖情况,双抗夹心ELISA检测IFN-γ分泌情况,计算强毒攻击后各组小鼠的存活数及保护率。结果表明,随着免疫次数的增加,pOPRL、灭活疫苗和OMP疫苗免疫组小鼠产生的抗体水平逐渐升高,与两对照组相比差异极显著(p0.01),且灭活疫苗组和OMP疫苗组小鼠血清抗体水平高于pOPRL组(p0.05);灭活疫苗组和OMP疫苗组小鼠脾淋巴细胞的刺激值(SI值)和IFN-γ水平也高于pOPRL组(p0.05);pOPRL组、灭活疫苗组和OMP疫苗组对小鼠的保护率分别为53.3%、86.7%和73.3%,表明pOPRL疫苗虽可为小鼠提供一定的保护,但效果不如传统的灭活疫苗,还需采取措施进一步增强其免疫原性。     

铜绿假单胞菌flgE基因菊粉季铵盐纳米DNA的制备与免疫效果研究

为提高铜绿假单胞菌flgE基因DNA疫苗的免疫效果,本实验对菊粉进行阳离子化后获得带正电荷的菊粉季铵盐,以其包裹裸DNA疫苗后制备成菊粉季铵盐纳米DNA疫苗,结果显示,flgE基因壳菊粉季铵盐纳米DNA疫苗在扫描电镜下呈现较为规则的圆球型,粒径100 nm～200 nm。以裸DNA疫苗和菊粉季铵盐纳米DNA疫苗免疫BALB/c小鼠,同时设置灭活疫苗、pcDNA3.1(+)空载体和PBS对照组。免疫1周时经断尾采血并分离血清,采用间接ELISA检测免疫后血清特异性抗体水平,结果显示小鼠免疫后菊粉季铵盐纳米DNA疫苗诱导的血清抗体水平虽低于灭活疫苗,但明显高于裸DNA疫苗(p0.05)。同时每次免疫2周后,每组各随机取5只小鼠分离制备脾淋巴细胞悬液,采用MTT法检测免疫小鼠脾淋巴细胞增殖情况,双抗夹心ELISA测定脾淋巴细胞分泌的IFN-γ和IL-2的水平,结果显示,纳米DNA疫苗组小鼠的刺激指数(SI)及脾淋巴细胞分泌的IFN-γ和IL-2含量与灭活疫苗组相当,显著高于裸DNA疫苗组(p0.05)。三免2周后以1.8×1010cfu/只铜绿假单胞菌CAU0792菌液攻击各组小鼠,且计算存活数及保护率,结果显示灭活疫苗组、菊粉季铵盐纳米DNA疫苗组和裸DNA疫苗组的保护率分别为90%、75%和55%,表明菊粉季铵盐可增强裸DNA疫苗诱导的免疫应答水平和保护效果。本实验首次将菊粉进行季铵盐化后使其带有正电荷,有利于结合DNA分子形成纳米颗粒,从而增强了DNA疫苗的免疫原性,为铜绿假单胞菌DNA疫苗的研制及新型DNA疫苗佐剂的开发奠定了基础。     

菊粉对铜绿假单胞菌flgE基因DNA疫苗的免疫增强作用

为研究菊粉对铜绿假单胞菌flgE基因DNA疫苗的免疫增强作用,本研究将铜绿假单胞菌的flgE基因克隆于真核表达载体pcDNA3.1(+)中制备DNA疫苗,分别以该DNA疫苗(100μg/只)和菊粉佐剂+DNA疫苗免疫BALB/c小鼠(质粒100μg/只,终浓度20%菊粉),同时设置菊粉灌胃对照组(600 mg/kg)以及灭活疫苗(100μL/只)、鞭毛蛋白(100μL/只)、pcDNA3.1(+)空载体(100μg/只)和PBS对照组(100μL/只)。每两周免疫一次,共免疫3次。利用间接ELISA检测免疫后血清特异性抗体水平,MTT法检测免疫小鼠脾淋巴细胞增殖水平,双抗夹心ELISA检测IFN-γ分泌情况,计算强毒攻击后各组小鼠的存活数及保护率。结果显示,菊粉佐剂组和菊粉灌胃组小鼠产生的抗体水平与DNA疫苗组相比无明显差异(p0.05),且显著低于灭活疫苗组和鞭毛蛋白组(p0.05);菊粉佐剂组对小鼠脾淋巴细胞的刺激值(SI值)和IFN-γ水平与鞭毛蛋白组相当,明显高于菊粉灌胃组和DNA疫苗组(p0.05);菊粉佐剂组和菊粉灌胃组对小鼠的保护率均高于DNA疫苗组,但低于灭活疫苗组,表明以菊粉预先灌胃和以菊粉为佐剂均可在一定程度上提高flgE基因DNA疫苗对小鼠的保护效率,但仍不及传统的灭活疫苗。本实验为铜绿假单胞菌DNA疫苗的研究及菊粉在DNA疫苗中的应用奠定基础。     

铜绿假单胞菌flg E基因壳聚糖纳米DNA疫苗的免疫效果评估

为评价铜绿假单胞菌flgE基因壳聚糖纳米DNA疫苗的免疫效果，本研究经PCR扩增flgE基因，将其插入真核表达载体pcDNA3.1(+)中，构建flgE基因的重组质粒pflgE，进一步以壳聚糖为佐剂制备了纳米DNA疫苗CpflgE，通过测定OD260nm值检测纳米DNA疫苗的包封率、加入DNA酶后经琼脂糖凝胶电泳检测其抗DNA酶降解的能力、37℃恒温静置1 d,3 d和5 d后经琼脂糖凝胶电泳检测稳定性。结果显示CpflgE的包封率为94.69%，可有效抵抗DNaseⅠ的降解，具有较强的稳定性。以pflgE和CpflgE免疫BALB/c小鼠，共免疫3次，同时设置灭活疫苗免疫组、铜绿假单胞菌鞭毛蛋白亚单位疫苗免疫组以及PBS对照组。免疫后不同时间经间接ELISA测定各组小鼠血清抗体水平，MTT法检测小鼠脾淋巴细胞增殖水平，采用检测试剂盒测定各组小鼠血清中IFN-γ、IL-2和IL-4的水平。结果显示，Cpflg E诱导小鼠的血清抗体水平、脾淋巴细胞增殖水平及血清中IFN-γ、IL-2和IL-4的浓度总体上虽均低于灭活疫苗，但与鞭毛蛋白亚单位疫苗相当，且显著高于pflgE (P<0....     

铜绿假单胞菌oprH基因DNA疫苗的构建与检测

研究旨在构建铜绿假单胞菌oprH基因的DNA疫苗。试验根据GenBank中已发表的铜绿假单胞菌的oprH基因序列,设计合成了一对特异性引物,利用PCR技术由铜绿假单胞菌基因组DNA中扩增获得该目的基因,进行胶回收纯化并与T载体进行连接,经双酶切和PCR鉴定后将重组质粒进行酶切回收目的基因片段,并将其亚克隆于真核表达载体pCAGGS-HA中,以双酶切和PCR方法进行鉴定。结果显示：PCR成功扩增出约600 bp的oprH基因,连接T载体后的重组质粒经双酶切和PCR鉴定,均可获得大小正确的目的基因片段。真核重组载体鉴定结果显示,oprH基因成功克隆于真核表达载体pCAGGS-HA中。研究表明,试验成功构建了oprH基因的DNA疫苗,为进一步研究其免疫效果及铜绿假单胞菌新型疫苗的研制提供参考。     

不同生产工艺的重组禽流感病毒(H5+H7)二价灭活疫苗(H5N1 Re-8株+H7N9 H7-Re1株)对鸡的免疫效果对比试验

为评价不同生产工艺制备的重组禽流感病毒(H5+H7)二价灭活疫苗(H5N1 Re-8株+H7N9 H7-Re1株)(简称"H5+H7二价灭活疫苗")对SPF鸡的免疫效果,将3批不同生产工艺制备的(H5+H7)二价灭活疫苗,分别为2017001批(试行规程组)、2017002批("生物工艺"组)和2017003批("生物工艺"+增强剂组),免疫21~28日龄的SPF鸡,免疫后14、21、28、35天采血测定各免疫组的HI抗体效价。在免疫后14~35天,3批不同生产工艺制备的H5+H7二价灭活疫苗组的HI抗体几何平均滴度(GMT)均高于规程要求的6 log_2,在免后14天HI抗体效价开始逐渐升高,在免疫后14~35天,可维持较高的HI抗体水平;2017002批的HI抗体几何平均滴度(GMT)居中,2017003批的HI抗体几何平均滴度最高。试验结果表明:不同生产工艺制备的重组禽流感病毒(H5+H7)二价灭活疫苗均符合产品的质量标准要求;用"生物工艺"制备的疫苗免疫效果优于按规程制备疫苗,说明该"生物工艺"可生产质量稳定、高效均一的(H5+H7)二价灭活疫苗;加入某公司增强剂后,免疫效果更好,说明该增强剂可提高疫苗免后的抗体水平。     

重组禽流感病毒（H5+H7）二价灭活疫苗在肉鹅中的应用效果评价

为评价重组禽流感病毒二价灭活疫苗(H5N1 Re-8株+H7N9 Re-1株)在商品肉鹅中的安全性和有效性,各取200只肉鹅进行单剂量和大剂量安全试验,另取500只进行免疫效力试验。结果显示:接种大剂量疫苗试验组的鹅,采食、饮水及精神状况正常,未见有不良临床反应,注射部位肌肉均未观察到炎症、疫苗残留现象,疫苗吸收良好,增重差异不明显。效力试验中,加强免疫后2周,抗体合格率达70%以上,病毒分离均为阴性。结果表明,该重组禽流感病毒二价灭活疫苗具有较好的安全性和有效性。建议对2周龄雏鹅进行首免,每只注射0.5 mL,5周龄时加强免疫1次,每只1.5 mL,这样可取得较好的免疫保护效果。     

家禽H5亚型禽流感(Re-6株)疫苗免疫抗体消长规律研究

为了解H5亚型重组禽流感Re-6株灭活疫苗在鸡、鸭免疫后的抗体消长规律,本实验分别选择一个鸡场和鸭场开展了临床免疫实验。实验鸡群于14日龄首免单价疫苗(Re-6株)和H5亚型二价疫苗(Re-6株+Re-4株)后,在30日龄~200日龄不同时间点采血检测Re-6抗体,结果表明,二价疫苗比单价疫苗免疫后的Re-6免疫抗体产生早、效价高、抗体整齐度好;40日龄二免后20 d,二价疫苗和单价疫苗的Re-6免疫抗体消长规律趋于一致。实验鸭群于17日龄分别采用禽流感(H5+H9)双价灭活疫苗和单价灭活疫苗(H5N1亚型,Re-6株)进行免疫,免后45日龄~205日龄不同时间点检测Re-6抗体,结果表明,双价疫苗与单价疫苗均可以诱导免疫鸭产生高水平抗体,而且两种疫苗的消长规律相似。此外,45日龄二免Re-6株疫苗的免疫程序要优于70日龄二免的免疫程序。本研究评估Re-6疫苗的防控效果,为家禽H5亚型禽流感免疫防制提供了实验依据。     

蛋鸭重组禽流感病毒(H5N1亚型)灭活疫苗免疫试验

采用重组禽流感病毒灭活疫苗(H5N1亚型,Re-6株)和重组禽流感病毒H5亚型二价灭活疫苗(Re-6株+Re-4株)进行蛋鸭免疫试验,监测免疫鸭的抗体消长动态,旨在为鸭禽流感免疫程序的制定提供理论依据。基于试验结果,提出鸭禽流感免疫程序:2周龄首免,4~5周龄二免,开产前2~3周三免,此后每隔4~5个月加强免疫一次。     

几种畜禽疫病的加强免疫

正畜禽的加强免疫应遵循规模养殖场的免疫程序,免疫剂量、部位和使用方法参照说明书。1高致病性禽流感(首选H5+H7)1.1鸡小鸡首免日龄一般在15日龄左右,用H7N9+H5N1(Re-8)亚型禽流感灭活疫苗初免,间隔21~28 d进行一次加强免疫。新购进、初免不详的鸡采用购进即免,间隔21~28d加免。春秋两     

重组禽流感病毒(H5+H7)二价灭活疫苗H7免疫效果实验

正为了更好地了解禽流感灭活疫苗关于H7免疫后的抗体水平,评估重组禽流感病毒(H5+H7)二价灭活疫苗H7的免疫效果,在县城分别选择2个饲养水平良好的鸡场,对实验鸡接种重组禽流感病毒(H5+H7)二价灭活疫苗,对接种疫苗的试验鸡进行免疫应激观察。结果显示:试验鸡未出现不良免疫副反应,说明临床使用     

禽流感灭活疫苗免疫效果评价试验

随机抽取6个厂家的重组禽流感病毒H5亚型二价灭活疫苗(Re-6株+Re-8株)和6个厂家的禽流感二价灭活疫苗(H5N1 Re-6株+H9N2 Re-2株)进行免疫效果评价试验。结果表明,二免后28 d,H5亚型二价灭活疫苗组的免疫抗体合格率在95.24%以上;二价灭活疫苗组H5和H9亚型抗体合格率在94.74%以上,免疫效果较好。     

重组禽流感病毒灭活疫苗（H5N1亚型）对鸭和鹅的免疫效果观察

由H5N1亚型禽流感病毒（Avian influenza virus,AIV）引起的高致病性禽流感（highly pathogenic avian influenza, HPAI）是禽类的一种烈性传染病,疫苗免疫是禽流感防控中的重要环节。本试验采用重组禽流感病毒灭活疫苗（H5N1,Re-5株）和重组禽流感病毒H5亚型二价灭活疫苗（H5N1、Re-5株+Re-4株）进行了鸭和鹅的免疫试验,对免疫鸭和鹅的抗体水平进行了动态监测。试验结果表明,两种疫苗对鸭和鹅均具有良好的免疫效果。基于试验结果提出了鸭和鹅禽流感免疫程序：2 w左右首免,4~5 w时二免,开产前三免,此后每隔4~5个月加强免疫一次。     

奶牛口蹄疫免疫程序试验

本试验采取2组不同的免疫方案对40头奶牛进行免疫,免疫21d后采血运用液相阻断ELISA方法评估免疫效果。结果表明,加强免疫的效果比一次免疫好,口蹄疫O型-亚洲Ⅰ型二价灭活疫苗与口蹄疫A型灭活疫苗间隔7d免疫的效果比同时免疫好。奶牛口蹄疫合理免疫程序为第一次免疫口蹄疫O型-亚洲Ⅰ型二价灭活疫苗,间隔7d免疫口蹄疫A型灭活疫苗;间隔1个月后第二次免疫口蹄疫O型-亚洲Ⅰ型二价灭活疫苗,间隔7d免疫口蹄疫A型灭活疫苗。     

不同厂家牛口蹄疫O型-亚Ⅰ型双价灭活疫苗免疫效果对比试验

为了解不同疫苗生产厂家生产的牛口蹄疫O型-亚Ⅰ型双价灭活疫苗的免疫效果,更好地开展牛口蹄疫的免疫工作,选用兰州、内蒙古、云南三个厂家生产的牛口蹄疫O型-亚Ⅰ型双价灭活疫苗,每个厂家疫苗免疫4个组,其中3个组首免后间隔20日、30日、40日进行二免,另1组不进行二免作为对照,跟踪检测各组免疫口蹄疫O型、Ⅰ型疫苗后抗体的消长规律。结果表明：曾经免疫过的成年奶牛,免疫后分别间隔20日、30日、40日加强免疫1次。和不加强免疫的对照组相比较,其免疫抗体水平差异不显著;不同厂家疫苗免疫抗体水平差异也不显著：未免疫过的犊牛,首免后不进行加强免疫,免疫抗体水平上升相对较慢,30日时免疫抗体达到高峰期,持续60日,可维持免疫抗体水平（平均在6log2以上）90日以上,最长的内蒙古厂生产的疫苗可维持150日。首免后间隔20日进行加强免疫,首免后180日,免疫抗体平均值仍可达6log2以上。口蹄疫免疫抗体水平Ⅰ型比O型上升速度慢（大约慢10天）,维持有效保护的时间要短（一般要短1个月）。不同厂家疫苗免疫抗体水平有一定差距。     

不同厂家牛口蹄疫O型-亚I型双价灭活疫苗免疫效果对比试验

为了解不同疫苗生产厂家生产的牛口蹄疫O型-亚I型双价灭活疫苗的免疫效果,更好地开展牛口蹄疫的免疫工作,选用兰州、内蒙古、云南三个厂家生产的牛口蹄疫O型-亚Ⅰ型双价灭活疫苗,每个厂家疫苗免疫4个组,其中3个组首免后间隔20日、30日、40日进行二免,另1组不进行二免作为对照,跟踪检测各组免疫口蹄疫O型、Ⅰ型疫苗后抗体的消长规律.结果表明:曾经免疫过的成年奶牛,免疫后分别间隔20日、30日、40日加强免疫1次,和不加强免疫的对照组相比较,其免疫抗体水平差异不显著;不同厂家疫苗免疫抗体水平差异也不显著:未免疫过的犊牛,首免后不进行加强免疫,免疫抗体水平上升相对较慢,30日时免疫抗体达到高峰期,持续60日,可维持免疫抗体水平(平均在6log2霞以上)90日以上,最长的内蒙古厂生产的疫苗可维持150日.首免后间隔20日进行加强免疫,首免后180日,免疫抗体平均值仍可迭6log2以上.口蹄疫免疫抗体水平I型比O型上升速度慢(大约慢10天),维持有效保护的时间要短(一般要短1个月).不同厂家疫苗免疫抗体水平有一定差距.     

致水貂出血性肺炎铜绿假单胞菌胞外产物生物活性及免疫保护力分析

胞外产物在细菌致病过程中发挥重要作用,为探索胞外产物在铜绿假单胞菌致病过程中的作用,首先从铜绿假单胞菌培养液提取其出其胞外产物,利用小鼠模型分析其致病性,并通过细胞证实了该产物对巨噬细胞功能的抑制作用,进一步测定其胞外产物的酶活性并利用LC-MSMS方法对铜绿假单胞菌胞外产物蛋白成分和功能进行分析。结果表明,铜绿假单胞菌胞外产物对小鼠有致病性,能够显著抑制巨噬细胞吞噬细菌活性,其具有淀粉酶、脂肪酶、蛋白酶、卵磷脂酶活性和溶血活性可能在这一过程中发挥关键作用。LC-MSMS分析鉴定所提纯的胞外产物中有153种蛋白成分,涉及多种酶类、细胞结构蛋白和功能性蛋白。用低剂量胞外产物免疫动物对于铜绿假单胞菌感染具有较明显的保护率,可达90%。本试验为揭示铜绿假单胞菌致病机理,研制新型疫苗奠定基础。     

2017年安徽省合肥市禽流感抗体检测

为评价安徽省合肥市禽流感疫苗免疫效果,2017年11月,在合肥市随机选取50个场群,采集1 670份血清进行H5和H7亚型禽流感HI抗体检测。结果显示,H5亚型抗体合格率为86.3%,H7亚型抗体合格率为59.5%;50个场群中的32个使用了重组禽流感病毒（H5+H7）二价灭活疫苗,H5、H7亚型免疫抗体合格率均达到70%以上;不使用（H5+H7）二价灭活疫苗导致场群H5和H7亚型免疫抗体不合格的风险是使用此疫苗的3.8倍（95%CI：1.1~13.0）。结果表明,（H5+H7）二价灭活疫苗免疫效果较好,建议对群体抗体不合格的养殖场户进行（H5+H7）二价灭活疫苗补免。     

首免日龄、免疫间隔与疫苗组合对幼鸽新城疫血凝抑制抗体效价的影响

为了研究免疫方法对幼鸽新城疫血凝抑制(NDHI)抗体效价的影响,试验应用鸡新城疫活疫苗和鸡新城疫灭活疫苗对幼鸽首免日龄、免疫间隔和疫苗组合进行了研究。选择14,21,28日龄白羽王鸽健康幼鸽各32只随机分为试验Ⅰ～Ⅲ组,分别检测母源抗体效价后用鸡新城疫灭活疫苗进行首次免疫,间隔14 d后再次用鸡新城疫灭活疫苗进行第2次免疫,在首免后14天和二免后14天分别检测NDHI效价。选择21日龄白羽王鸽健康幼鸽192只分为试验1,2组,试验1组再均分为A_1组、B_1组、C_1组,试验2组再均分为A_2组、B_2组、C_2组,检测母源抗体效价后进行首次免疫。A_1组、B_1组、C_1组分别接种鸡新城疫活疫苗、鸡新城疫活疫苗+鸡新城疫灭活疫苗、鸡新城疫灭活疫苗,间隔7 d后用鸡新城疫灭活疫苗进行第2次免疫;A_2组、B_2组、C_2组分别接种鸡新城疫活疫苗、鸡新城疫活疫苗+鸡新城疫灭活疫苗、鸡新城疫灭活疫苗,间隔14 d后用鸡新城疫灭活疫苗进行第2次免疫。试验1,2组的各小组幼鸽在35日龄和49日龄时分别检测NDHI效价。结果表明:在首免日龄试验中,试验Ⅱ组、Ⅲ组幼鸽二免后14天NDHI抗体效价极显著高于试验Ⅰ组(P0.01)。在免疫间隔和疫苗组合试验中,试验1组、2组幼鸽49日龄NDHI抗体效价平均值为3.57 lb和7.25 lb,其中A_1组、B_1组、C_1组幼鸽49日龄抗体效价分别为4.88,2.92,2.92 lb,A_2组、B_2组、C_2组幼鸽49日龄抗体效价为4.50,8.53,8.72 lb。说明21日龄幼鸽首免鸡新城疫灭活疫苗、间隔14 d二免再次接种鸡新城疫灭活疫苗,可使49日龄幼鸽NDHI抗体效价达到8.72 lb。     

铜绿假单胞菌flgE基因PCR检测方法的初步建立

为建立一种基于铜绿假单胞菌flgE基因的PCR检测方法,本试验根据GenBank中已发表的铜绿假单胞菌flgE基因序列,设计合成了1对特异性引物,由铜绿假单胞菌基因组DNA中扩增获得了目的基因。从退火温度、循环次数、Mg2+浓度、dNTPs浓度和引物浓度5个方面优化了反应条件,并检测了该方法的特异性和敏感性。结果成功扩增出了铜绿假单胞菌1 400 bp的flgE特异性基因片段,最佳退火温度、循环次数、Mg2+浓度、dNTPs浓度和引物浓度分别为56℃、30个循环、1.6 mmol/L、0.2 mmol/L和0.3μmol/L。特异性试验表明,仅铜绿假单胞菌中可扩增出目的片段,而多杀性巴氏杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、志贺氏菌、致病性大肠杆菌和金黄色葡萄球菌中均未扩增出相应片段。敏感性试验结果表明,本方法可检测到最低10 pg/μL的铜绿假单胞菌基因组DNA以及100 CFU/mL的病原菌。