油菜黑胫病菌T-DNA插入诱变因素优化及突变体筛选

油菜黑胫病是由Leptosphaeria biglobosa引起的一种真菌病害。这种病害在我国油菜产区广泛发生,并造成一定的经济损失。为通过获取突变体来研究L. biglobosa的生态适应性机制及致病机制,本文优化了影响农杆菌介导转化（ATMT）油菜黑胫病菌L. biglobosa菌株Lb731的因素,评估转化子质量,并筛选相关突变体。结果明确了农杆菌介导转化菌株Lb731的最佳因素：潮霉素B浓度为50 μg/mL,转化受体（分生孢子）培养时间为15 d (20℃),浓度为2 × 10^7~8孢子/mL,农杆菌-受体共培养温度为25℃,共培养时间为72 h。在最适条件下的转化效率达到80个转化子/百万分生孢子。T-DNA插入基因组的频率为100%,单拷贝插入频率为72.7%,转化子抗潮霉素性状能稳定遗传。从2136个转化子中获得了11个菌丝生长减缓突变体,7个色素产生缺陷突变体和14个分生孢子产生缺陷突变体,并从这些突变体中鉴定出7个致病力丧失突变体。采用hiTAIL-PCR技术,从3个突变体中获得了T-DNA插入位点侧翼序列。上述结果为深入研究L. biglobosa的生态适应性机制及致病机制提供了材料和线索。     

ISSR标记分析油菜黑胫病原菌遗传多样性

利用ISSR分子标记技术分析了油菜黑胫病菌（Leptosphaeria biglobosa）的遗传多样性。分离获得国内菌株84株,并以15株国外(英国、加拿大、波兰)油菜黑胫病菌菌株作为参照,利用筛选出的24条引物对这99株病原菌进行ISSR-PCR扩增。共扩增出245条带,遗传相似性系数为0.65~1.00,国内和国外油菜黑胫病菌菌株很明显被分为两个菌群,中国84株菌基本按地理来源分为5个类群,只有江苏省菌株分布于各个类群。各省的Nei’s基因多样性指数范围是0.108 1~0.252 7,而香农(Shannon’s)信息指数的范围是0.157 5~0.372 6,顺序为江苏>湖北>安徽>内蒙古>上海>四川。其与英国和加拿大菌株的遗传一致度分别为0.834 3和0.783 9。     

黑胫病菌(Leptosphaeria biglobosa)在油菜叶片和茎中的侵染过程观察

为明确黑胫病菌(Leptosphaeria biglobosa)在甘蓝型油菜叶片和茎中的侵染及扩展过程,利用绿色荧光蛋白(GFP)标记的黑胫病菌株接菌油菜叶片,利用激光共聚焦显微镜观察菌株在油菜叶片和茎中的侵染过程.结果表明,接种油菜叶片7 h后,分生孢子萌发并长出芽管;17 h后,芽管侵入气孔;24 h后,分生孢子全...     

油菜黑胫病研究进展

油菜黑胫病是一种世界性分布的真菌病害,由子囊菌Leptosphaeria biglobosa引起。近年来随着田间调查的深入,及其姊妹病害油菜茎基溃疡病（Leptosphaeria maculans引起）传入风险的增加,我国对油菜黑胫病的重视程度逐年增加。本文对油菜黑胫病病原菌种群、病害循环及危害症状、分布与寄主范围、分子检测技术以及综合防治等方面的研究进展进行了综述,分析了油菜茎基溃疡病菌对我国的侵入风险,同时对我国油菜黑胫病研究和防控提出了建议,并就此进行了展望。     

根癌农杆菌介导遗传转化稻曲病菌

利用根癌农杆菌介导转化系统,通过潮霉素抗性筛选转化子,对稻曲病菌分生孢子进行了转化。农杆菌经乙酰丁香酮预先诱导,转化效率大约为390~450个转化子/ 106个孢子。PCR检测绿色荧光蛋白基因和潮霉素基因表达盒,结果显示被测转化子基因组中均成功整合了目的基因片段。同时,在488 nm下这些转化子都具有荧光。表明利用根癌农杆菌可以成功转化稻曲病菌。     

马铃薯黑胫病菌的分离、纯化及PCR检测

由Pectobacterium atroseptica引起的马铃薯黑胫病是影响马铃薯生产的重要种薯传播细菌病害,从种薯发芽到生长后期均可发病,严重影响马铃薯的产量和品质。为构建马铃薯黑胫病菌的分离、鉴定技术体系,从广东省惠州市惠东县大水坑马铃薯基地采集了疑似感染马铃薯黑胫病植株,对其进行病原菌分离和纯化,得到7株病菌,利用引物Eca 1 g/Eca 2 g对其进行PCR扩增、将PCR产物测序并将所测定序列递交Gen Bank数据库,使用Blast软件进行比对确定目标菌株。结果表明,其中一株菌株能扩增出长度大约688 bp的特异性条带,其DNA序列符合Eca 3762序列,鉴定为马铃薯黑胫病菌。此方法可以成功地从发病植株中分离出黑胫病菌,成本较低廉,为广东省建立马铃薯种薯质量检测和控制体系提供技术支撑。     

农杆菌介导的大豆遗传转化研究进展

植物基因工程是大豆遗传改良的重要途径。农杆菌介导法是大豆遗传转化的重要方法之一,许多实验室应用该方法得到了转基因大豆,但目前使用该方法进行转化的效率还比较低,尚需深入研究。综述了农杆菌介导的大豆遗传转化的分子机理,常用转化体系及其优缺点并分析了影响转化效率的因素,同时对今后研究的重点进行了讨论。     

温度对油菜黑胫病菌(Leptosphaeria biglobosa)假囊壳和子囊孢子发育的影响

油菜黑胫病是双球小球腔菌(Leptosphaeria biglobosa)引起的一种真菌病害,在油菜产区广泛发生.为了解我国特定气候和栽培条件下的流行规律,通过室内试验和田间试验探讨了温度对罹病油菜茎秆上L.biglobosa假囊壳和子囊孢子发育的影响.室内试验结果表明:在保证环境水分(湿度)充足的条件下,温度影响L....     

油菜黑胫病菌（Leptosphaeria biglobosa）生物学特性研究

为了解我国油菜黑胫病病原菌（Leptosphaeria biglobosa）的生物学特性,在实验室里研究了温度、pH值、光照、碳源及氮源等条件对该病菌营养生长及分生孢子产生的影响。结果表明：病原菌在5℃～35℃均可进行营养生长并产孢,最适生长和产孢温度为25℃;在pH4～10的范围内该菌均能生长并产孢,在pH7的条件下生长最快,产孢最多。光暗交替有利于菌丝生长和产孢,而持续光照不利于菌丝生长,尤其不利于产孢。最适的碳源、氮源分别是可溶性淀粉、牛肉膏。分生孢子的致死温度为52℃。     

农杆菌介导的花生遗传转化研究

对影响花生遗传转化效率的PPT筛选压、根癌农杆菌的侵染浓度、侵染及共培养时间等因素进行研究，采用农杆菌转化花生叶片，成功地将抗虫基因豇豆蛋白酶抑制基因(CpTI)和耐除草剂基因(Bar)导入花生。实验结果表明，外植体在MS 3mg／LBA 0．8mg／LNAA 2mg／LAgNO3 6mg／L Gln培养基上预培养3d，于OD600为0．3的农杆菌菌液中浸泡5～7min后培养2d，再转移至含有3mg／LBA 0．8mg／LNAA 2mg／LAgNO3 6mg／L Gln 500mg／LCb 300mg／LCef 0．25mg／LPPT的MS培养基诱导筛选培养，3个月后得到24个再生株系。经PCR初步检测，有7个株系显示了310bp的CpTI基因核酸片段，Southern杂交证实了5个株系有外源基因的整合。     

根癌农杆菌介导花生高效遗传转化体系的优化

本文研究表面活性剂(MES,methyl ester sulfonate)、真空渗入法和二次侵染对提高花生转化效率的影响,建立了一种农杆菌介导的花生快速高效遗传转化体系。该体系以带子叶的胚轴为外植体,在OD600为0.7的菌液中,加入150mg/L的MES,40kPa真空处理10min,共培养3d后进行二次侵染。采用该体系可显著提高遗传转化率,GUS基因阳性表达率最高,达73.3%。     

根癌农杆菌介导茶树转化研究

通过检测GUS瞬间表达 ,对影响根癌农杆菌侵染茶树叶片效果的若干因素进行研究。Kan对茶树叶片愈伤组织形成的抑制浓度在 3 0mg/L左右 ,因而对以Kan为筛选标记的载体来说 ,5 0mg/LKan是较为适宜的选择浓度。茶树较为适宜的农杆菌转化系统是用OD6 0 0 为 0 5 - 0 8的LBA4 4 0 4侵染 10分钟左右 ,暗中2 8℃共培养 2 - 3天。硝酸银对农杆菌生长有抑制作用 ,不宜在共培养阶段添加     

Gene targeting using the Agrobacterium tumefaciens-mediated CRISPR-Cas system in rice

Background

The type II clustered, regularly interspaced, short palindromic repeat (CRISPR)/ CRISPR-associated protein 9 (Cas9) system is a novel molecular tool for site-specific genome modification. The CRISPR-Cas9 system was recently introduced into plants by transient or stable transformation.

Findings

Here, we report gene targeting in rice via the Agrobacterium tumefaciens-mediated CRISPR-Cas9 system. Three 20-nt CRISPR RNAs were designed to pair with diverse sites followed by the protospacer adjacent motif (PAM) of the rice herbicide resistance gene BEL. After integrating the single-guide RNA (sgRNA) and Cas9 cassette in a single binary vector, transgenic rice plants harboring sgRNA:Cas9 were generated by A. tumefaciens-mediated stable transformation. By analyzing the targeting site on the genome of corresponding transgenic plants, the mutations were determined. The mutagenesis efficiency was varied from ~2% to ~16%. Furthermore, phenotypic analysis revealed that the biallelic mutated transgenic plant was sensitive to bentazon.

Conclusions

Our results indicate that the agricultural trait could be purposely modified by sgRNA:Cas9-induced gene targeting. CRISPR-Cas9 system could be exploited as a powerful tool for trait improvements in crop breeding.