NCOA1基因mRNA表达及多态性与黔北麻羊产羔性状关联性分析

为了研究核受体辅激活蛋白1(NCOA1)对黔北麻羊繁殖性能的影响,试验采用DNA测序技术,利用SeqMan软件分析测序结果初步筛选SNP位点,根据筛选出的SNP位点应用RNA在线二级结构预测软件中的RNA secondary structure prediction、ProtScale、DNAStar软件中的EditSeq分析NCOA1基因突变位点的二级结构、理化性质、亲疏水性、结构域,运用SPSS 20.0软件分析NCOA1基因型与产羔数的关联性;再应用实时荧光定量PCR方法检测NCOA1基因在黔北麻羊子宫、输卵管、垂体、下丘脑、卵巢5个器官中mRNA的表达水平。结果表明:在外显子7处发现2个SNP位点,命名为G144A和G155A,其中G144A属于同义突变,编码的氨基酸未发生改变,G155A属于错义突变,编码的精氨酸突变为赖氨酸,导致外显子7所编码的氨基酸自由能升高,稳定性降低,分子质量变大,等电点升高,疏水性增强,但未发现保守结构域和特殊结构域,即NCOA1基因外显子7编码的蛋白无特异结构和独立功能;对G155A位点进行基因分型,发现GG基因型个体产羔数分别比GA、AA基因型个体多0.249只(P0.05)和0.377只(P0.05);NOCA1基因mRNA在黔北麻羊5个器官中均有表达,在下丘脑中的表达量最高,在输卵管中的表达量最低,且卵巢、下丘脑中的表达量极显著高于输卵管、子宫(P0.01),垂体中的表达量显著高于子宫和输卵管(P0.05)。说明NCOA1基因对黔北麻羊繁殖性能有一定影响,有G155A突变位点的GG基因型也对黔北麻羊高产有一定影响,可作为筛选黔北麻羊高繁殖力品系的一个潜在指标。     

山羊副流感病毒3型感染MDBK细胞的miRNA表达谱变化分析

本研究旨在分析山羊副流感病毒3型(CPIV3)感染MDBK细胞和正常MDBK细胞差异表达的miRNA,以探索miRNA在CPIV3感染过程中的作用及其调控机制。将CPIV3感染MDBK细胞,利用高通量测序技术检测分析MDBK细胞中miRNA表达谱,并筛选差异表达的miRNA。对靶基因进行GO注释和KEGG富集。结果显示,有37个miRNA显著差异表达(P0.001),其中18个miRNA在病毒感染中上调,19个miRNA在病毒感染中下调。经RT-qPCR方法验证5个差异表达的候选miRNA,结果与高通量测序分析有很好的一致性。进一步GO功能注释表明:差异表达的miRNA靶基因生物学功能相对集中在免疫调节、细胞生物调控及细胞新陈代谢等生物过程。这些靶基因参与多种细胞的信号通路,包括细胞黏附分子、B细胞受体信号通路、MAPK信号通路、代谢通路、黏合斑、钙离子信号通路和趋化因子信号通路等。本研究为进一步探讨CPIV3致病机制奠定了基础。     

山羊副流感病毒3型感染MDBK细胞的转录组分析

本研究旨在探究山羊副流感病毒3型(CPIV3)感染MDBK细胞后的转录组基因变化情况,丰富CPIV3转录组信息。取1MOI CPIV3JSHA2014-1病毒液感染MDBK细胞,设非感染正常细胞为对照,于24h后收获细胞,提取总RNA,利用Illumina HiSeqTM2500对感染组与对照组进行高通量测序,并用测序评估、基因注释等生物信息学方法进行分析。结果显示,差异表达基因共261个,其中表达上调140个,表达下调121个,经RT-qPCR方法验证8个差异表达的干扰素信号通路相关基因,结果与高通量测序一致。进一步GO分类结果显示,差异表达基因主要涉及细胞生物学进程、构成细胞的组分以及实现的分子功能三个方面,KEGG分析显示这些基因参与代谢、生物系统、细胞进程、基因信息进程和环境信息进程。本研究为深入探究CPIV3的致病机制奠定了基础。     

牛结节性皮肤病病毒感染MDBK细胞后转录组差异表达分析

旨在探索牛结节性皮肤病病毒(lumpy skin disease virus,LSDV)与宿主细胞的相互作用,采集了具有典型临床症状的牛皮肤病变组织,接种MDBK细胞进行病毒分离,采用透射电镜观察病变组织及病毒感染后的MDBK细胞,同时对感染后24 h的MDBK细胞进行转录组学分析,筛选差异表达基因并将其按功能分类,分...     

五指山猪肌肉组织lncRNA和mRNA的鉴定与分析

为了鉴定和分析五指山猪背最长肌和半腱肌中差异表达的lncRNA和mRNA,试验以6月龄五指山猪阉割公猪为试验动物,在无菌状态下逐头采集背最长肌和半腱肌样品,采用RNA-Seq文库和生物信息学方法对五指山猪肌肉组织中的lncRNA和mRNA进行分析筛选,运用DESeq软件鉴定背最长肌和半腱肌中差异表达的lncRNA和mRNA,并对差异表达的lncRNA进行靶基因预测分析。结果表明:在五指山猪肌肉组织中共鉴定出4 086个lncRNA,其中正义型2 203个、反义型197个、内含子型130个、基因间型1 556个。对比测序获得的lncRNA和mRNA发现,lncRNA和mRNA的长度都主要分布在600～1 200 nt之间和3 000 nt以上。在背最长肌与半腱肌间,存在82个差异表达的mRNA,其中前10位分别为ZIC4、ZIC1、PITX1、SIM1、PVALB、SEC14L5、SERPINB11、PRXL2B、ZNF862、MYBPH;存在32个差异表达的lncRNA,其中2个仅在背最长肌中表达,1个仅在半腱肌中表达,29个在两种肌肉组织中共表达;获得差异表达的lncRNA靶基因共70个,包括顺式作用的靶基因和反式作用的靶基因。说明五指山猪背最长肌和半腱肌具有不同表达水平的lncRNA和mRNA,两种肌肉组织中均存在特异性表达的lncRNA。     

山羊IL-2基因真核表达质粒构建及在MDBK细胞中的表达

本实验成功构建了真核表达质粒pVAX1-IL-2,并对质粒进行PCR,双酶切及测序鉴定,RT-PCR成功验证了目的基因在MDBK细胞中能够转录,同时ELISA验证目的基因在MDBK细胞中能表达.研究结果为pVAX1-IL-2作为核酸疫苗的细胞因子佐剂的应用研究提供生物材料.     

奶牛乳腺炎差异表达lncRNA BCL2对炎症及凋亡相关mRNA表达的影响

本研究旨在探讨长链非编码RNA BCL2(lncRNA BCL2)对奶牛乳腺上皮细胞炎症及凋亡中的调控作用。利用RNAhybrid、Targetscan和miRwalk软件分析lncRNA BCL2海绵吸附的miRNAs及其所靶向的mRNAs,并对这些靶基因进行KEGG通路富集分析;采用qPCR和lncRNA超表达技术研究了lncRNA BCL2在乳腺组织和乳腺上皮细胞炎症中的表达情况及其对乳腺上皮细胞炎症和凋亡相关基因表达的影响。结果发现,与对照组相比,lncRNA BCL2在临床乳腺炎奶牛的乳腺组织和LPS诱导炎症的乳腺上皮细胞中的表达量均显著下调(P<0.05);在lncRNA BCL2超表达的情况下,乳腺上皮细胞内炎症因子IL-1β与IL-8及炎症信号通路关键基因NF-κB(p65/p50)的表达量均显著上调(P<0.05);细胞凋亡相关的CASP3和CASP9基因的表达显著下降(P<0.05),BCL2表达量显著上调(P<0.001),且BCL2与BAX比值大于2。该结果与生物信息学分析结果相符,表明lncRNA BCL2可能通过lncRNA BCL2...     

梅花鹿干扰素-β1在MDBK细胞中表达及抗牛病毒性腹泻病毒活性检测

为真核表达梅花鹿干扰素β1(IFN-β1)并检测其抗牛病毒性腹泻病毒(BVDV)活性,本研究以梅花鹿肝脏基因组为模板,通过PCR扩增出IFN-β1的编码区序列,克隆于真核表达载体pVAX1中,构建重组真核表达质粒pVAX1-IFNβ1,并转染MDBK细胞进行表达。结果显示,将pVAX1-IFNβ1转染MDBK细胞后经western blot和间接免疫荧光法检测和鉴定证实,转染的重组质粒能够在MDBK细胞中正确表达目的蛋白,表达的重组蛋白约为25 ku。此外,采用细胞病变抑制法检测表明转染后重组细胞表达的IFN-β1具有抗BVDV活性。本研究为梅花鹿IFN-β1蛋白抗病毒分子机制的研究及抗病毒药物的开发奠定了基础。     

五指山猪皮下脂肪组织lncRNA和mRNA的鉴定与分析

为了鉴定和分析五指山猪背部和腹部皮下脂肪组织中差异表达的长链非编码RNA(long noncoding RNA, lncRNA)和信使RNA(messenger RNA, mRNA),采用RNA-Seq和生物信息学方法对五指山猪皮下脂肪组织中的lncRNA和mRNA进行分析筛选,运用DESeq鉴定背部和腹部皮下脂肪组织中差异表达的lncRNA和mRNA,并对差异表达的lncRNA进行靶基因预测分析。结果显示:在五指山猪皮下脂肪组织中共鉴定出12 875个lncRNA,其中正义型10 155个、反义型278个、内含子型246个、基因间型2 196个;在背部与腹部皮下脂肪间,存在184个差异表达的mRNA,其中前十位分别是ZIC1、ZIC4、HAND2、CCBE1、RPH3A、ISM1、ANXA8、SLITRK4、DSG2、EVPL,存在45个差异表达的lncRNA,其中6个只在背部皮下脂肪中表达、18个只在腹部皮下脂肪中表达;获得差异表达lncRNA的靶基因共109个,包括顺式作用的靶基因和反式作用的靶基因。本试验为进一步研究lncRNA和mRNA调控猪皮下脂肪发育的分子机制提供科学依据。     

去除细胞膜胆固醇分子对BPIV3感染MDBK细胞的影响

为了探讨细胞膜胆固醇分子在牛副流感病毒3型(Bovine parainfluenza virus type3,BPIV3)感染MDBK细胞中的作用,试验采用胆固醇去除药物甲基-β-环糊精(MβCD)处理MDBK细胞对其进行研究。结果表明:细胞膜胆固醇含量明显降低,同时降低BPIV3效价及其表达;补充外源胆固醇后,病毒感染力可部分恢复。说明细胞膜胆固醇的去除可以抑制BPIV3的感染,BPIV3的感染可能和细胞膜胆固醇分子相关。     

冷热应激对牛PBMC和MDBK细胞活力及HSP70表达的影响

以奶牛原代培养细胞PBMC(peripheral blood mononuclear cells)和商业化细胞系MDBK(madin-darby bovine kidney)为细胞模型,采用MTS、实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR)及Western blot等方法检测不同程度的冷热应激对牛PBMC和MDBK细胞活力及HSP70表达水平的影响,分析不同温度的冷热应激条件下细胞活力和HSP70表达变化的规律,以及不同类型细胞应答冷热应激的差异。结果显示,冷应激和热应激均会使细胞活力降低,应激强度越大,细胞活力越低;冷热应激会调控细胞中HSP70的表达水平,重度冷应激(10℃)下调HSP70的表达,而热应激则上调HSP70的表达,但若超过细胞耐受极限度HSP70表达开始下降;HSP70表达水平应对冷热应激的变化与细胞的类型和冷热应激强度有关。结果表明,冷热应激会降低细胞活力,调控细胞HSP70的表达水平,HSP70的表达变化能够反映细胞冷热应激的强度,可作为评价奶牛冷热应激反应的澘在分子标记在奶牛个体中进行深入研究。     

BHV-1感染牛巨噬细胞对CD300a转录的影响

为探究抑制性受体CD300a在牛Ⅰ型疱疹病毒(bovine herpesvirus 1,BHV-1)免疫调控机制中的作用,分离鉴定了1株BHV-1内蒙古株,并建立CD300a基因的荧光定量PCR方法,检测BHV-1感染牛单核巨噬细胞后0,6,12,24,48,72 h 6个时间点以及空白对照组CD300a基因的转录变化。将β-actin基因作为内参,使用双标准曲线法计算攻毒组与对照组CD300a基因各时间段的相对表达量,分析CD300a在攻毒前、后的表达差异。结果显示,BHV-1分离株在MDBK细胞上出现典型细胞病变效应,测得其病毒滴度为10^7.23 TCID₅₀/mL。本研究建立的CD300a基因荧光定量PCR检测方法,CD300a基因和β-actin基因标准品的Ct值与模板浓度之间均具有良好的线性关系,溶解曲线均为特异单峰,最低检测限均为10拷贝/μL,具有良好的灵敏性,可以准确检测出BHV-1攻毒后巨噬细胞内的CD300a基因表达量。经计算,攻毒组CD300a表达量均高于对照组,其中,6,12,24 h的表达差异倍数显著高于0,72 h...     

禽腺病毒血清4型感染的LMH细胞mRNA表达谱分析

禽腺病毒血清4型(FAdV-4)引起的禽肝炎-心包积液综合征已严重危害我国养禽业的发展,迫切需要深入了解FAdV-4的致病机制并制定有效的防控方案。论文旨在利用高通量测序技术分析禽腺病毒血清4型感染鸡肝癌(Leghorn male hepatocellular, LMH)细胞后差异表达的mRNA,以探究mRNA在FAdV-4感染过程中的作用及其调控机制。结果显示,与对照组相比,FAdV-4感染48 h共筛选到2 604个上调的差异表达基因,2 883个下调的差异表达基因。其中,GNB3、NECTIN4、SFRP4、FABP2、PLPP3、GALR1L和MBL2等基因之前并没有被报道过与FAdV-4感染相关。通过GO和KEGG分析得知,差异表达基因主要富集在从细胞表面位点和信号受体结合至细胞周期调节、MAPK信号通路、细胞黏附分子作用等;其中,显著下调的差异基因还富集到多种代谢途径中,提示病毒感染会影响宿主细胞的代谢水平。本研究为深入解析FAdV-4感染宿主细胞的致病机制提供了相关的理论基础及科学依据。     

梅花鹿α干扰素基因在MDBK细胞中表达及抗BVDV活性检测

采用基因工程技术克隆出梅花鹿α干扰素(IFN-α)成熟肽基因序列,并将其定向插入到真核表达载体pcDNA3.0(+),经酶切、PCR及测序鉴定,成功构建了pcDNA3.0-IFN-α真核重组表达质粒。将鉴定正确的阳性重组质粒经非脂质体法转染至MDBK细胞,间接免疫荧光试验检测其具有较高转染效率;Western blot法检测IFN-α蛋白在MDBK细胞中得到有效表达;病变抑制试验检测转染后的MDBK细胞具有明显抗BVDV活性;抗BVDV活性的定量试验表明转染pcDNA3.0-IFN-α质粒的MDBK细胞与感染未转染的MDBK细胞相比抗BVDV活力提高了66192倍。本试验在MDBK细胞中成功表达了梅花鹿IFN-α,并检测出其具有明显抗BVDV作用,这为梅花鹿IFN-α活性机理研究以及开发更高效的抗梅花鹿病毒性疾病干扰素制剂提供物质和理论基础。     

牛副流感病毒3型感染MDBK细胞后影响天然免疫基因表达的筛选与验证

为筛选与验证牛副流感病毒3型(BPIV3)感染MDBK细胞后天然免疫相关基因的差异表达变化,通过细胞病变观察、Western blot验证病毒HN蛋白表达,以及病毒增殖复制动力学曲线,确定病毒复制情况。利用转录组测序技术,对1MOI基因C型SD2014BPIV3毒株感染MDBK细胞的12h对照组与感染组的差异表达基因进行筛选,最后收集BPIV3感染MDBK不同时间点细胞样本,应用RT-qPCR在转录水平验证了天然免疫相关显著差异基因的表达变化情况。结果表明,BPIV3毒株在MDBK细胞上有较强的复制能力,从病毒感染12h的转录组数据中获得了1 401个显著差异基因,经过筛选获得了9个与天然免疫相关的基因,最后在转录水平验证了MDA5、IRF7、STAT1、ISG65、TRIM25等9个与天然免疫相关基因的表达变化,并验证了其上、下游通路或同一家族基因的表达变化。结果表明,筛选与验证的BPIV3感染MDBK细胞差异表达天然免疫相关基因,为宿主细胞影响病毒复制的分子机制研究奠定了基础。     

猪CAPN1基因mRNA表达特性分析

为了进一步揭示CAPN1的功能,研究以野猪、大白猪及野家杂交猪为研究对象,利用相对定量RT-PCR方法研究其编码基因的表达特性。结果表明:CAPN1基因在组织中普遍表达,但表达量存在差异,并且野猪和大白猪具有不同的表达模式;在大白猪肌肉组织中表达的发育性变化为波浪型;在360日龄大白猪和野家杂交猪肌肉组织中的表达量存在显著差异。     

表皮生长因子对牦牛卵丘细胞低氧诱导因子-1α表达的影响及与凋亡的关联性分析

旨在研究EGF是否通过调控HIF-1α抑制牦牛卵丘细胞凋亡。本研究在牦牛卵丘细胞体外培养时加入不同浓度的EGF,运用qRT-PCR和免疫荧光技术检测HIF-1α、Bcl-2和Bax的表达,用一步法TUNEL检测不同处理组卵丘细胞的凋亡情况。结果表明:(1)牦牛卵丘细胞体外培养液中添加不同浓度的EGF后,卵丘细胞HIF-1α和Bax mRNA的相对表达量降低,Bcl-2 mRNA的相对表达量增加,且具有浓度依赖性;当EGF浓度为50ng·mL~(-1)时,HIF-1α和Bax mRNA的相对表达量最低,Bcl-2mRNA的相对表达量最高。(2)向其体外培养液中添加不同浓度的EGF后,卵丘细胞HIF-1α和Bax蛋白的相对表达量降低,Bcl-2蛋白的相对表达量增加,且具有浓度依赖性;当EGF浓度为50ng·mL~(-1)时,HIF-1α和Bax蛋白的相对表达量最低,Bcl-2蛋白的相对表达量最高。(3)TUNEL凋亡检测表明,对照组中卵丘细胞凋亡率最高,当EGF浓度为25ng·mL~(-1)时,细胞凋亡率显著降低(P0.05);当EGF浓度为50ng·mL~(-1)时,细胞凋亡率最低(P0.05),但随着EGF浓度的增加,卵丘细胞的凋亡率又升高。本研究结果表明,EGF可通过调控HIF-1α抑制卵丘细胞凋亡,其作用可能与线粒体介导的Bax和Bcl-2凋亡途径相关。     

H1N1亚型流感病毒感染A549细胞的环状RNA表达分析

通过对甲型H1N1流感病毒感染A549细胞前后表达的环状RNA进行鉴定,筛选病毒感染引起的差异表达环状RNA,为进一步研究环状RNA在流感病毒感染过程中的调控作用奠定基础。本研究从病毒感染和PBS处理的A549细胞中提取RNA,构建测序文库后进行全转录组测序。通过生信分析,鉴定了病毒感染前后宿主细胞表达的环状RNA。以未感染组为对照,使用EdgeR包,筛选条件：■、P value<0.05,筛选获得感染前后的细胞中差异表达的环状RNA。使用ClusterProfiler包对差异表达环状RNA的来源基因进行GO和KEGG分析。最后通过荧光定量PCR、外切核糖核酸酶处理、Sanger测序等手段验证了病毒感染前后宿主细胞内部分环状RNA的差异表达。结果表明：流感病毒感染细胞后,环状RNA的表达数目增加。感染组和未感染组分别鉴定到1 101和676个环状RNA表达,这些环状RNA广泛分布在所有染色体上,其中大部分(约60%)长度在300～1 000 nt,约20%的环状RNA长度超过2 000 nt。基于基因位置关系的分析发现,75%～82%的环状RNA源自外显子,12%～17%源自正链...     

柔嫩艾美耳球虫入侵对MDBK细胞NF-κB表达的影响

鸡艾美耳属球虫中,柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)感染鸡只发病最为严重。为了研究该虫的入侵机制和致病机理,以MDBK细胞为培养细胞,用含有6%乙醇的DMEM完全培养基对入侵E.tenella的MDBK细胞进行凋亡诱导,应用细胞免疫组化的方法检测NF-κB的表达情况。试验结果显示,E.tenella入侵的MDBK细胞中有NF-κB的表达,而未入侵对照组很少有NF-κB的表达,表明E.tenella的入侵抑制MDBK细胞的凋亡是通过NF-κB细胞信号通路发挥其凋亡调控作用。