大丽轮枝菌微菌核快速形成培养基的筛选

大丽轮枝菌是广泛分布的土壤习居菌,能引起棉花黄萎病害,因其形成的微菌核生命力强,可在土壤中存活多年,是大丽轮枝菌型黄萎病的主要初侵染来源。为开展微菌核的研究,本试验对微菌核形成最佳培养基进行了筛选,采用6种培养基,培养6株大丽轮枝菌(Verticillium dahliae Kleb.),通过生长速率、微菌核数量、微菌核直径和微菌核萌发率4项指标筛选合适的培养基。结果表明：改良燕麦培养基形成微菌核的数量和直径均优于其他培养基;M1和BMM培养基形成微菌核的数量较多,其微菌核直径均小于半组合培养基。因此,改良燕麦、M1和BMM培养基,根据实验需要均可作为快速培养微菌核的理想培养基。     

几种氨基酸铜对大丽轮枝菌产生毒素蛋白的影响

用几种氨基酸铜溶液处理大丽轮枝菌,阴离子交换层析分离培养液中的毒素蛋白,并进行棉苗的致萎实验,比较了各氨基酸铜制剂对大丽轮枝菌毒素蛋白产生的影响。实验表明,丙氨酸铜、甘氨酸铜、谷氨酸铜和复合氨基酸铜都在一定程度上抑制了大丽轮枝菌微菌核的形成和毒素蛋白的分泌,而苏氨酸铜促进了毒素蛋白的分泌。说明复合氨基酸铜的抑菌作用是各成分协同作用的结果。     

大丽轮枝菌混合侵染棉花的研究

利用绒毛型变异体 (B型 )的形态特征 ,采用不同形态类型的菌株混合接种、再分离后分别进行致病力和营养体亲和性测定的方法 ,证明不同致病力的大丽轮枝菌菌株可以共同侵染同一株植物 ,在菌株间不同浓度混合比例的接种中 ,混合侵染率约占总侵染率的 1 /1 5至 1 /3。是一种研究不同致病力的菌株在寄主体内互作动态和分布情况的简便方法。由此提出在黄萎病研究中为防止不同致病力菌株对研究结果的干扰 ,应以使用单孢菌株为宜 ;由于形态变异体容易识别 ,在研究棉花黄萎病的交叉保护现象中可加以利用     

GhWRKY48负调控棉花对大丽轮枝菌的抗性

为了防治棉花黄萎病对棉花生产的危害,利用抗病基因培育抗病品种是最经济有效的方法。从陆地棉中克隆了1个WRKY转录因子基因,命名为GhWRKY48;其编码序列全长为882 bp,编码293个氨基酸残基,预测分子质量和等电点分别为32.68 ku和6.10。qPCR组织特异性表达分析结果表明,GhWRKY48在根、茎和叶中均表达,而在茎中为优势表达;同时GhWRKY48表达受到大丽轮枝菌、茉莉酸和水杨酸的诱导。通过病毒诱导基因沉默技术获得GhWRKY48基因沉默植株。对基因沉默植株接种大丽轮枝菌进行抗病性分析,结果显示,沉默植株的病株率和病指均低于对照植株,表明沉默GhWRKY48基因能够提高棉株抗病性。综上所述,GhWRKY48是一个负调控转录因子,抑制下游抗病基因的表达,从而参与棉花对大丽轮枝菌的抗性;因此,GhWRKY48基因可以作为一个理想的候选基因用于棉花的抗病育种。     

贝莱斯芽孢杆菌SZAD1对大丽轮枝菌的生物防治效果

【目的】黄萎病是棉花的主要真菌病害,缺乏高抗品种和安全有效的化学杀菌剂。生物防治黄萎病对棉花生产具有重要意义。本研究旨在探讨棉花内生细菌对大丽轮枝菌的拮抗活性和生物防治潜力。【方法】通过16S r DNA与gyr B序列分析,对菌株SZAD1进行鉴定。在平板对峙试验中检测SZAD1对黄萎病菌VD080菌丝生长的抑制能力,通过种子浸泡和灌根检测对黄萎病的防效。制备含羧甲基纤维素或几丁质的琼脂平板培养基来检测菌株能否分泌纤维素酶和几丁质酶,并用二硝基水杨酸试剂法测定酶活性。【结果】SZAD1属于贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)。SZAD1菌株能显著抑制VD080菌丝生长,种子浸泡法和灌根法处理中SZAD1菌株对棉花黄萎病的防效分别为60.10%和56.00%。SZAD1菌株能产生纤维素酶和几丁质酶,在培养72 h时达到最大酶活性。该菌发酵72 h的上清液抑菌效果最强。加入25 mg·L^-1和50 mg·L^-1的SZAD1发酵上清液后,液体马铃薯葡萄糖琼脂培养基中的VD080孢子含量分别较对照降低了30.20%和96.53%...     

陆地棉品种对多个大丽轮枝菌菌株的抗性分析

对几个陆地棉黄萎病抗源用多个菌株分别接种鉴定。结果表明，它们对不同菌株的抗性可能是由不同基因决定的。例如Ｒ０１中有多个抗不同大丽轮枝菌菌株的抗病基因；Ｒ１８能抗４个落叶型菌株，且表现一致，这说明Ｒ１８的抗病基因与Ｒ０１的抗病基因在本质上可能不同。Ｒ０１和Ｒ０３中的２个株行能抗或耐所有试验用菌株尤其是落叶型菌系。Ｒ１８的选择过程为选育棉花高抗黄萎病品种提供了可能参考的实例。抗源材料的分析结果表明，一个品种或株行的抗性鉴定必须进行两次以上，在感病株行中分离出来的抗病单株，是新品种、新材料的希望所在，也是不能遗传的假抗病材料（诱导性抗病）的最大怀疑对象。     

大丽轮枝菌侵染陆地棉早期的转录组分析

【目的】旨在深入挖掘大丽轮枝菌致病相关基因。【方法】运用转录组测序技术比较分析了强致病力大丽轮枝菌Vd991在侵染陆地棉品种Coker 312早期阶段的基因表达情况。【结果】对Vd991侵染前后的转录组数据进行差异表达分析,共筛选到979个差异表达基因(Differentially expressed genes,DEGs),其中376个上调,603个下调。通过基因注释和功能分类发现,这些DEGs涉及细胞增殖与生长、产孢、碳水化合物结合、蛋白激酶活性调节、裂解酶活性、水解酶活性等功能。对上调DEGs进行基因本体(Gene ontology,GO)功能富集分析,发现共有277个GO词条达到显著富集水平(P0.05),涉及生长速率正向调控、核苷酸合成、解旋酶活性等功能;京都基因与基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)通路分析表明,上调DEGs参与53个代谢通路,包括嘧啶代谢、嘌呤代谢等。【结论】在早期侵染过程中,大丽轮枝菌细胞增殖相关基因表现活跃。上述分析为进一步揭示大丽轮枝菌的致病机理提供了有价值的参考。     

大丽轮枝菌酵母双杂交cDNA文库的构建

为了分离克隆与植物互作的大丽轮枝菌致病相关蛋白基因,利用SMART技术构建了大丽轮枝菌酵母双杂交c DNA文库。结果表明,构建的文库滴度为5.2×107cfu/m L,库容为3.9×107cfu;文库c DNA插入片段长度主要分布在0.5~2.0 kb,平均为1 kb;文库重组率为96%。表明文库质量较好,为筛选与植物互作的大丽轮枝菌致病蛋白基因奠定了基础。     

大丽轮枝菌拮抗细菌的分离与抗菌物质鉴定

从黄萎病发病棉田未发病棉株根际土样中分离芽孢杆菌,利用对峙培养法对大丽轮枝菌进行平板拮抗实验,筛选出6株对大丽轮枝菌有拮抗作用的芽孢杆菌,其中3株菌发酵代谢产物具有抗菌活性。S4-3菌株发酵液滤液经100℃、30min热处理丧失抗菌活性,发酵液氯仿抽提物不具有抗菌活性,发酵液硫酸铵沉淀物有抑菌活性,但经蛋白酶处理后活性丧失,认为S4-3菌株抑菌活性物质是蛋白质。而菌株S4-5发酵液经100℃热处理后还有较高的抗菌活性,发酵液氯仿抽提物也具有抗菌活性,但硫酸铵沉淀物对病原菌无抑制作用;S5-6菌株发酵液滤液经100℃热处理丧失抗菌活性,硫酸铵沉淀物也不具有抗菌活性,而发酵液氯仿抽提物有抗菌活性,因此认为S4-5和S5-6菌株产生的抑菌物质不是蛋白质类。     

中科院在大丽轮枝菌侵染过程研究中取得新进展

<正>大丽轮枝菌是一种土传病原真菌,通过形成附着枝感染植物根部,在世界范围内引起严重的黄萎病害,对我国棉花生产造成巨大的经济损失。和其他病原微生物一样,大丽轮枝菌的重要致病策略之一是分泌效应蛋白到植物细胞,干扰植物免疫反应,但其分泌结构和分泌转运机制亟待探究。     

紫外分光光度法在复合氨基酸铜配合物测定中的应用

氨基酸铜配合物作为新型杀菌剂已有许多报道。本实验室最早把氨基酸铜配合物用于防治棉花黄萎病。氨基酸配合物是氨基酸和金属离子相结合而形成的较稳定的化学结构,它可以保护金属离子的生物效价。金属离子与氨基酸配合后通过细胞膜的速度比无机金属离子大20~30倍,提高了机体对     

22种中药提取物对棉花黄萎病菌的抑菌活性

采用生长速率法,设置0.005 g·mL-1的质量浓度,对22种中药提取物的抑菌活性进行筛选.结果表明:五倍子、土元、蛇床子、白英、麻黄、巴豆、黄柏和黄连对棉花黄萎病菌的抑菌率超过45%;进一步研究表明:五倍子、土元和蛇床子对黄萎病菌的抑制效果最好,对菌丝生长、毒素分泌、孢子萌发、孢子产量的抑制效果分别达100%、96.5%、94.4%和100%,100%、93.7%、81.3%和100%,100%、95.7%、34.2%和100%;与五倍子和土元相比,蛇床子对孢子萌发的抑制效果较差.     

来源于耐旱荒漠植物蛋白CkND对棉花黄萎病的抑制作用及其抗旱性研究

 利用蛋白组学策略分离了荒漠植物-牛心朴子（Cynanchum komarovii）抗病、抗旱功能相关蛋白CkND。以棉花黄萎病菌为供试菌株,研究了蛋白CkND对棉花黄萎病的抑制作用。结果表明：蛋白CkND对棉花黄萎病菌菌丝生长及孢子萌发具有较好的抑制作用。离体试验中,100 mg·L^-1的蛋白CkND对棉花黄萎病菌菌丝生长抑制效果在24 h、48 h、72 h分别为79.53%、83.01%、87.50％,35 mg·L^-1的蛋白CkND对孢子萌发抑制率为100%;活体试验中,蛋白CkND对棉花黄萎病具有显著的防治效果。另外,本研究将CkND基因构建到pCAMBIA1304表达载体CaMV35S启动子下游,将pCAMBIA1304-CkND通过农杆菌介导转化法转入野生型拟南芥植株中。将33个株系的转pCAMBIA1304 -CkND的 T₂代拟南芥和21株转pCAMBIA1304的T₂代拟南芥,同时进行抗旱性试验。结果显示,转pCAMBIA1304 的T₂代拟南芥14个株系枯死,而转pCAMBIA1304-CkND的 T₂代拟南芥有24个株系的转基因植株存活,且叶片保持绿色,植株生长良好,根系、须根发达,须根数目明显增多。转pCAMBIA1304-CkND拟南芥株高增加了30%,显著提高了植物抗旱性。     

棉花黄萎病菌致病类型研究

以研究手段为主线,从形态学特征、凝胶电泳、血清学反应、营养体亲和性及几项分子生物学技术等方面讨论了目前国内外在划分棉花黄萎病菌种内致病类型上的研究进展状况,并在本文基础上作了总结。     

农杆菌介导转化大丽轮枝茵的体系优化

为了揭示大丽轮枝菌的遗传变异和致病机理,以含潮霉素为抗性筛选标记、绿色荧光蛋白GFP为报告基因载体,优化了农杆菌介导转化大丽轮枝菌的遗传转化体系,获得了大丽轮枝菌菌株V991和BP2含绿色荧光蛋白GFP的转化子,转化率达到100×10-6～550×10-6.优化的转化条件为:农杆菌以IM液体培养基调节浓度至OD600=...     

土壤棉花黄萎病菌致病力分化的初步研究

为进一步研究病原茵的变异规律,采用皿内培养和苗期致病力测定方法,2005年8月对陕西三原棉花黄萎病圃中棉花黄萎病菌进行了研究.对26株代表菌系在PDA培养基上菌落培养性状进行的研究结果表明:其存在黑色菌落(菌核型)、白色菌落(菌丝型)和中间型三种培养型.并且在菌落的生长量、微菌核形成的快慢、数量、形状和大小变化以及黑色素的相对量等方面均存在差异.苗期致病力测定表明:26个供试菌系致病力也有差异,从其对5个棉花鉴别寄主侵染的反应型来看,可以划分为强、中、弱3个不同的致病类型.强致病类型菌系12个,占41.6%,中等致病类型的菌系9个,占34.6%,弱致病力菌系5个,占19.2%.     

不同抗性品种对棉花黄萎病菌致病力的影响

 以1个海岛棉品种和15个陆地棉品种为分离寄主,采取单孢分离,共分离出67个黄萎病菌系。以抗性差异较大的海岛棉品种Pima90-53和陆地棉品种冀棉20、邯208和中棉所8号为鉴别寄主,采用苗期营养钵定量注菌液法对分离菌系进行了致病力鉴定。结果表明,同一地块田间不同品种所分离菌系的致病力类型并非单一类型,而是由致病力连续变化的多种致病力菌系类型组成;由不同品种分离出的菌系致病力存在差异,寄主品种的抗性与分离的黄萎病菌系的致病力无关,但不同基因型品种可能会影响不同致病力菌落的消长。     

北方植棉区棉花黄萎病菌生理分化类型研究

通过对采自北方植棉区落叶和非落叶病株的５１个棉花黄萎病菌系致病力分化测定结果，确定我国北方植棉区存在落叶类强致病力菌系；混合类中度致病力菌系及非落叶类弱致病力菌系的３个致病类型，并分别占测试菌的４１．５１％、３５．８５％和２２．６４％，其中９个强致病菌系致害棉苗出现落叶程度与对照菌的落叶程度相当或略重，表明河北、山东、河南植棉区重病田有落叶型黄萎菌系。病菌培养性状研究，得出３个培养型，即黑色菌落型、灰白色菌落型与白色菌落型。明确了黄萎病菌生长最佳温度为２５℃，这一结果同田间黄萎病大发生要求的温度一致。