青杆分子伴侣PwTCP-1基因的克隆及表达分析

分子伴侣TCP-1在调节植物生长发育过程中具有重要作用,但在林木生长发育及对非生物逆境胁迫响应机制方面的研究较少.从青杆cDNA文库中筛选出1个分子伴侣PwTCP-1(T-complex polypeptide 1)片段,通过RACE-PCR技术获得Pw TCP-1的末端序列,经过与EST序列拼接,获得PwTCP-1 cDNA全长序列.使用clustalx、Mega5.0、DNAMAN和Expasy等工具对Pw TCP-1的理化性质、二级结构和三级结构进行生物信息学分析.结果显示,PwTCP-1 cDNA全长为2 024 bp,开放阅读框1 605 bp,编码534个氨基酸残基的蛋白质,其理论分子质量为59.2kDa,理论等电点为6.12,富含α-螺旋.通过RT-qPCR技术检测了PwTCP-1组织特异性表达、激素响应模式及在种子萌发过程中表达量变化.结果表明:Pw TCP-1在青杆各个组织中均有表达,在花粉中表达量最高,在茎中表达量最低;Pw TCP-1表达量随着种子萌发先上升,在第4天达到最高,之后缓慢下降.PwTCP-1能响应多种激素处理.油菜素内酯(brassinolide,BR)和赤霉素(gibberellin,GA)分别处理后,Pw TCP-1的表达量均显著降低,而茉莉酸甲酯(methyl jasmonate,MeJA)处理后该基因表达量极显著升高.这些结果显示,PwTCP-1可能参与植物种子萌发过程并响应了多种激素反应过程.     

青杄分子伴侣PwTCP-1基因的克隆及表达分析

分子伴侣TCP-1在调节植物生长发育过程中具有重要作用,但在林木生长发育及对非生物逆境胁迫响应机制方面的研究较少。从青杄c DNA文库中筛选出1个分子伴侣PwTCP-1(T-complex polypeptide 1)片段,通过RACE-PCR技术获得PwTCP-1的末端序列,经过与EST序列拼接,获得PwTCP-1c DNA全长序列。使用clustalx、Mega5.0、DNAMAN和Expasy等工具对PwTCP-1的理化性质、二级结构和三级结构进行生物信息学分析。结果显示,PwTCP-1c DNA全长为2024 bp,开放阅读框1 605 bp,编码534个氨基酸残基的蛋白质,其理论分子质量为59.2k Da,理论等电点为6.12,富含α-螺旋。通过RT-q PCR技术检测了PwTCP-1组织特异性表达、激素响应模式及在种子萌发过程中表达量变化。结果表明:PwTCP-1在青杄各个组织中均有表达,在花粉中表达量最高,在茎中表达量最低;PwTCP-1表达量随着种子萌发先上升,在第4天达到最高,之后缓慢下降。PwTCP-1能响应多种激素处理。油菜素内酯(brassinolide,BR)和赤霉素(gibberellin,GA)分别处理后,PwTCP-1的表达量均显著降低,而茉莉酸甲酯(methyl jasmonate,Me JA)处理后该基因表达量极显著升高。这些结果显示,PwTCP-1可能参与植物种子萌发过程并响应了多种激素反应过程。     

青杄PwVQ1基因的克隆与表达

以青杄cDNA为模板克隆得到青杄VQ基因,命名为PwVQ1。序列分析表明,PwVQ1基因的开放阅读框为819 bp,编码272个氨基酸。生物信息学分析发现,PwVQ1编码的蛋白理论分子量为69.05 k Da,PI值为5.03,为非跨膜的亲水性蛋白。PwVQ1具有VQ家族典型的Fxxx VQx LTG结构域。实时荧光定量PCR分析结果表明,PwVQ1在青杄的根、茎、叶、花粉、果实、种子中都有表达,在根和叶中表达量十分显著;PwVQ1在不同逆境处理下均有响应。4℃冷胁迫下,PwVQ1的表达量在3 h时先下调,在6 h时明显上调,达到8倍左右,在12 h时表达量再次下调。42℃高温胁迫下,PwVQ1的表达量下调。在盐胁迫下,干旱胁迫和ABA处理下,PwVQ1的表达量均上调。推测PwVQ1参与干旱、ABA、高温、低温、盐胁迫等非生物胁迫的响应。     

青杄类伸展蛋白基因PwELP1的克隆及表达分析

【目的】克隆青杄类伸展蛋白(extensin-like proteins,ELPs)基因PwELP1并分析该基因的表达特性,为研究ELP基因家族的功能奠定基础。【方法】以青杄cDNA文库为模板,用RACE-PCR方法克隆青杄类伸展蛋白编码基因PwELP1的cDNA全长,利用DNAMAN确定PwELP1的编码框及蛋白氨基酸的翻译,运用clustalx软件与Espript工具进行多序列比对,利用MEGA 5软件的邻位相连法构建系统树,并对编码蛋白进行生物信息学分析;利用RT-qPCR检测PwELP1基因在青杄不同组织中表达的特异性、花粉和种子不同萌发时期及幼苗受到不同逆境处理时的表达差异,分析该基因的组织发育及逆境响应表达特点。【结果】PwELP1基因全长832bp,其编码一个由159个氨基酸组成的蛋白,该蛋白的N端与C端均有比较保守的结构域;此蛋白二级结构由1个α-螺旋、5个β-折叠与3个β-转角结构构成,对其三级结构的预测印证了这一结果,同时发现该蛋白中还存在部分无规则卷曲。其分子质量为17.03ku,理论等电点为5.81。PwELP1在青杄花粉中的表达量较高,且在花粉萌发后期(30~36h)以及种子萌发初期(第2天)表达量高;PwELP1的表达不同程度地受低温、高温、茉莉酸甲酯(MeJA)、H_2O_2、脱水以及脱落酸(ABA)等非生物逆境胁迫处理的诱导,尤其是H_2O_2、高温和ABA,处理初期表达量就显著升高。【结论】PwELP1在青杄花粉和种子萌发过程中可能发挥重要功能,并可参与青杄对非生物逆境胁迫的响应过程。     

青杄PwPEBP基因及其启动子序列的克隆与表达分析

目的通过研究青杄中的PwPEBP基因及其启动子的表达特性及生物学功能,探究PEBP基因在植物生长发育过程中响应逆境胁迫的功能及作用机制。方法本研究从青杄转录组测序中获得PwPEBP的cDNA序列,利用TMHMM、GOR4等在线软件对PwPEBP蛋白进行生物信息学分析,以此为基础通过PCR技术克隆得到PwPEBP开放阅读框（ORF）序列;同时对其在不同组织与不同逆境及激素处理中的表达水平进行了RT-qPCR技术分析;采用染色体步移法克隆PwPEBP的启动子序列,并利用在线软件BDGP和PlantCARE对PwPEBP启动子序列进行基础启动子区域、转录起始位点和顺式作用元件的预测;最后通过农杆菌瞬时转化烟草法验证PwPEBP启动子的功能。结果PwPEBP cDNA长度为1 408 bp,开放阅读框共585 bp,编码194个氨基酸。PwPEBP蛋白分子式为C₉₆₆H_{1 484}N₂₅₀O₂₉₉S₆,无信号肽和跨膜结构域,为亲水蛋白,含有25个磷酸化位点;进化树分析显示,PwPEBP蛋白与北美云杉的PEBP单独聚成一簇,属于新的PEBP蛋白。组织特异性分析显示,PwPEBP在成熟叶中表达量最高,嫩叶中表达量最低;PwPEBP在各激素及逆境诱导下均有表达,但对盐处理无响应。克隆的PwPEBP启动子序列长度为903 bp,其具有响应GA、ABA、SA、MeJA的顺式作用元件。GUS染色及Luc定量实验显示,PwPEBP启动子均能响应GA、ABA、MeJA和SA外源激素及干旱、高温、低温等逆境胁迫。结论青杄中PwPEBP基因广泛响应干旱、低温、高温等非生物胁迫,其中对干旱胁迫最为敏感,同时还参与了ABA、GA、MeJA和SA激素的信号通路。      

青杄PwUSP1基因特征及对干旱和盐胁迫的响应

  目的  USPs蛋白（universal stress proteins）是一类胁迫相关类蛋白,被广泛报道参与了植物应对非生物胁迫的过程。本研究通过对青杄中PwUSP1基因进行功能分析及验证,探索PwUSP1在植物应对盐和干旱胁迫时的作用,从而为未来通过转基因工程提高青杄对非生物胁迫的耐受性提供候选基因。  方法  通过瞬时转化烟草叶片实验揭示PwUSP1在细胞中的定位;利用酵母双杂实验鉴定PwUSP1自身能否形成同源二聚体;通过农杆菌侵染法转化野生型拟南芥（WT）,获得纯合的PwUSP1过表达株系。通过测定干旱和盐胁迫下过表达株系（L1、L7）及野生型（WT）和空载体（VC）株系的存活率、失水率,来分析比较不同株系对于干旱和盐胁迫的耐受能力;通过二氨基联苯胺（DAB）和氯化硝基四氮锉蓝（NBT）染色,测定超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）以及丙二醛（MDA）的含量,研究PwUSP1发挥作用的生理机制。  结果  烟草亚细胞定位实验表明,PwUSP1定位于细胞核、细胞质和细胞膜中。酵母双杂结果显示PwUSP1蛋白自身能够形成同源二聚体。利用qRT-PCR检测转基因拟南芥,成功获得两个稳定纯合的株系（L1、L7）进行进一步分析。在盐和干旱胁迫下,相对于WT和VC,过表达PwUSP1能够显著提高植物对盐和干旱的耐受能力,表现出更高的存活率和更低的失水率,且显著降低了植株中过氧化氢、超氧阴离子的累积,提高了SOD、POD和CAT活性,抑制了MDA的积累。  结论  青杄PwUSP1定位于细胞核、细胞质和细胞膜中且自身能够形成同源二聚体,在干旱和盐胁迫条件下,PwUSP1通过增强植物的ROS清除能力及抑制膜脂氧化损伤来提高植物对非生物胁迫的耐受性。      

甘肃兴隆山保护区青杄群落结构分析

以甘肃兴隆山青杄群落为对象,分析了其群落特征和种群空间分布格局。在植物区系地理成分上,该群落属的分布类型以温带性质居多。生活型以高位芽植物最多。群落层次分为乔木层、灌木层、草本层和苔藓层,亦有层间植物伴生。除了样地4为聚集分布外,其他3个样地的青杄种群均为均匀分布。造成均匀分布的原因是青杄的生物学特性和林下华西箭竹生长状况共同引起的。不同海拔、不同林型的4个样地的聚集强度大小依次为:样地4>样地2>样地3>样地1。聚集强度的变化表明,种群年龄和苔藓层厚度同样影响空间分布格局。     

油菜BnICE1的克隆及表达分析

【目的】从超强抗寒油菜品种陇油6号中克隆抗寒转录因子BnICE1,并对其进行序列特征分析,研究BnICE1在低温胁迫下表达水平的变化,探讨BnICE1对油菜耐低温胁迫能力的影响。【方法】利用RACE技术获得油菜BnICE1全长的cDNA序列。对该序列进行生物信息学分析,采用实时荧光定量PCR研究BnICE1低温及不同组织表达量。【结果】cDNA片段全长1 737 bp,包含1 500 bp完整的开放阅读框,该基因编码499个氨基酸残基,分子量53.2 kD,等电点5.0。序列比对表明,该蛋白C端含有一个典型的bHLH结构域,与其它植物的ICE1蛋白具有较高的同源性,因此命名为BnICE1（GenBank登录号为JF268687）。进化树分析表明,BnlCE1同羊草和白菜亲缘关系较近。实时荧光定量PCR结果表明,该基因在油菜茎、叶和下胚轴均有表达,下胚轴中表达量最高,同时该基因的表达受低温胁迫诱导。【结论】从油菜中克隆了抗寒基因BnICE1,实时荧光定量PCR分析表明其在油菜适应低温胁迫的过程中发挥作用。     

脑特异性分子标志物vsnl1基因的克隆及原核表达

从健康BALB/c小鼠脑组织提取总RNA,逆转录获得cDNA.根据GenBank公布的视锥蛋白样基因1(vsnl1)基因序列设计引物,以鼠脑cDNA为PCR模板扩增vsnl1.将目的片段克隆至pMD18-T载体,经酶切和测序鉴定重组质粒pMDT-v.将vsnl1基因亚克隆至6×His原核表达载体pROEX-HTb,转化大肠杆菌DH5α,用IPTG诱导表达和Ni-NTA柱纯化,并采样进行SDS-PAGE分析.结果表明:RT-PCR扩增产生了与vsnl1大小吻合的目的片段,测序及BLAST比对提示与已公布序列的同源性为99%,将序列提交GenBank.SDS-PAGE显示,经IPTG诱导,重组质粒pROEX-v转化菌表达了约22ku的蛋白,与预期分子量大小一致.     

芥蓝BoaBKI1基因的克隆及表达分析

[目的]克隆芥蓝中的BoaBKI1基因,进行生物信息学与表达分析.[方法]采用改良CTAB法提取芥蓝总RNA,并反转录为cDNA;设计引物,克隆BoaBKI1基因;使用生物信息学方法分析BoaBKI1基因序列;用半定量PCR进行BoaBKI1基因的时空表达分析.[结果]成功克隆到BoaBKI1基因,序列分析显示其开放阅...     

青海省大通河流域青杆播种育苗技术

介绍了青杆的生物学特性和生长习性,从播种育苗过程中的圃地选择、种子采集处理、播种时间、播种方法、田间管理、病虫害防治、苗木出圃、造林等方面总结了青海省大通河流域青杆播种育苗技术,以最大限度的提高育苗成活率,指导青杄的栽培和种植.     

不同干扰强度林分云杉幼苗更新空间格局研究

依据地统计理论和方法,采取小支撑多样点的空间取样设计,在干扰强度不同的两个华北落叶松林分中设置样地,对云杉更新幼苗的空间格局进行了定量比较研究。结果表明,在干扰强度较小的样地1,云杉更新幼苗密度较大（每公顷634.8株）,异质性程度较高（Cn＋C=0.88219）,格局变异呈现随机性变异特征。在干扰较大的样地2,云杉幼苗密度较小（每公顷214.8株）,异质性程度较低（C0＋C=0.3036）、且主要体现在相对较小的尺度范围内（0.5～22.6m）,空间自相关变异占95.6％,随机因素对空间格局的影响较小。两样地之间云杉幼苗表现的尺度范围、强度及空间结构等有显著差异,林分空间异质性是导致这种差异的主要原因。     

光能的二维分异对马(口缷)山青杄林结构和群落类型的影响

以R=K+W作为计测二维分异的经验公式。结果表明:W值影响群落的乔木层种类,(K+W)值影响林下的种类组成和配置状况。据W值大小和群落的特征,将青杄林分为五个群类型;(K+W)值对选择造林树种和抚育间伐具有一定的指导意义。     

秦岭南坡青杄林、青杄—华山松—红桦混交林林地土壤特性研究

本文探讨了秦岭南坡青林及青—华山松7红桦混交林林地土壤的养分、化学性质及酶活性特点。结果表明：针阔混交林林地土壤酸性淋溶过程及物质迁移过程比青林地土壤弱；混交林明显地增加了土壤有机质及N素含量而降低了土壤有效P及有效K的含量；阳离子交换量及水解性总酸度青林地土壤比针阔混交林地高而盐基饱和度比针阔混交林地低，说明了在青林地土壤阳离子交换量中置换性酸所占比例较大而盐基离子所占比例较小；脲酶活性是针阔混交林地比青林地高而磷酸酶活性比青林地低，这与两种林地土壤中水解N及有效P含量高低是一致的。     

培养基组分对青杄离体花粉萌发和花粉管生长的影响

该文研究了青杄花粉在离体培养条件下,蔗糖、硼(H3BO3)和钙(CaCl2)对其萌发和花粉管生长的影响,同时还优化了培养基的组分配比.培养基中蔗糖浓度对青杄花粉的萌发影响显著,并有明显的域值效应;应用识别酯化果胶的单克隆抗体JIM7和酸性果胶的JIM5,分别对青杄花粉管进行免疫荧光标记,发现无硼培养可导致酸性果胶在其顶端细胞壁大量富集,而酯化果胶减少;荧光探针Fluo--3/AM标记实验揭示,无硼培养使其顶端胞质的Ca2 浓度梯度消失.研究结果表明,硼可能作为一种相关因子影响关键酶活性,改变细胞壁的延展性以至影响花粉管细胞壁的构建,同时破坏了花粉管顶端极性生长依赖的Ca2 梯度,从而影响其花粉管的生长.     

培养基组分对青离体花粉萌发和花粉管生长的影响

该文研究了青花粉在离体培养条件下,蔗糖、硼(H3BO3)和钙(CaCl2)对其萌发和花粉管生长的影响,同时还优化了培养基的组分配比.培养基中蔗糖浓度对青花粉的萌发影响显著,并有明显的域值效应;应用识别酯化果胶的单克隆抗体JIM7和酸性果胶的JIM5,分别对青花粉管进行免疫荧光标记,发现无硼培养可导致酸性果胶在其顶端细胞壁大量富集,而酯化果胶减少;荧光探针Fluo--3/AM标记实验揭示,无硼培养使其顶端胞质的Ca2+浓度梯度消失.研究结果表明,硼可能作为一种相关因子影响关键酶活性,改变细胞壁的延展性以至影响花粉管细胞壁的构建,同时破坏了花粉管顶端极性生长依赖的Ca2+梯度,从而影响其花粉管的生长.     

燕山红栗NCED1基因的克隆及表达分析

根据9-顺式-环氧类胡萝卜素加双氧酶(NCED)基因序列信息设计引物,通过RT-PCR在燕山红栗(Castanea mollissimacv.‘Yanshanhongli’)中克隆得到了基因NCED1。利用MEGA5.0软件将其氨基酸序列与其他植物的NCED1氨基酸序列进行聚类分析,同时采用实时荧光定量PCR的方法,对燕山红栗坚果不同发育时期的进行基因表达量分析。结果表明:NCED1在燕山红栗坚果发育过程中均有表达,且在坚果发育后期相对表达量达到峰值,推测ABA对燕山红栗坚果的成熟具有调节作用。