正辛酸与硫酸铵两步沉淀法纯化腹水单克隆抗体IgG

应用正辛酸与硫酸铵两步沉淀法纯化了1个BALB/C小鼠腹水单克隆抗体IgG。经聚丙烯酰胺凝胶电泳及ELISA等方法证实,从小鼠腹水中分离的IgG纯度较高,并且纯化前后单克隆抗体活性没有明显降低。本方法具有传统方法所不及的简便、省时及费用低等优点,尤其适用于大量样品中IgG的提纯。     

针对银狐主要传染病血清学检测的免疫球蛋白单克隆抗体的制备

以饱和硫酸铵沉淀法和Agarose-Protein G亲和层析技术相结合从银狐血清中提纯免疫球蛋白(IgG),再经SDS-PAGE电泳鉴定,将纯化的免疫球蛋白(IgG)作为抗原,采用常规方法免疫BALB/c小鼠,3次免疫后取脾细胞和SP2/0骨髓瘤细胞相融合制备杂交瘤细胞,利用间接ELISA、Western blot等方法进行鉴定及阳性克隆的筛选,对杂交瘤细胞产生的单克隆抗体进行鉴定和活性测定。结果得到与银狐免疫球蛋白(IgG)发生特异性反应的3株单克隆抗体,分别命名为E2、1E3和2G10。Western blot结果表明,E2、1E3和2G10单克隆抗体能与银狐IgG蛋白特异性结合。经抗体亚型鉴定E2、1E3和2G10均为IgG1、Kappa链。生产提纯的腹水单克隆抗体经Western blot分析效价可达到1∶6 000。该研究利用抗银狐IgG单克隆抗体制备检测感染主要传染病的银狐血清抗体试纸条具有良好的特异性与灵敏性,可以作为检测银狐主要传染病的一种新方法。     

抗猪IgG单克隆抗体的制备与应用

采用辛酸一硫酸铵盐析和SuperdexTM-200 凝胶层析分离纯化猪血清IgG,免疫BALB/c小鼠,利用细胞融合技术获得8株稳定分泌抗猪IgG 单克隆抗体的杂交瘤细胞.Ig 亚类分析表明,所制备单克隆抗体的轻链亚类均为K,重链除6H3为IgG2b外,其余7株均属于IgG1.Western blot分析显示,5株单克隆抗体识别猪IgG轻链,3株单克隆抗体识别猪IgG重链.以蛋白G亲和层析纯化单克隆抗体7H1腹水,用改良过碘酸钠法进行辣根过氧化物酶(HRP)标记,结果显示,HRP 标记抗猪IgG单克隆抗体对纯化猪IgG的工作浓度达1:12 800.将HRP标记鼠抗猪IgG单克隆抗体与HRP标记羊抗猪IgG多克隆抗体应用于猪血清圆环病毒抗体检测,二者符合率为95.12%,其ELISA和Westem blot的工作浓度为1:2 000和1:10000,表明HRP标记抗猪IgG单克隆抗体具有高度的敏感性.本研究制备的酶标抗猪IgG单克隆抗体为猪病的免疫诊断试剂研究和猪细胞生物学研究提供了一种基础工具.     

乳胶凝集试验快速检测副猪嗜血杆菌

利用原核表达并经过纯化的副猪嗜血杆菌TbpB N端蛋白及人工合成的特异性多肽制备单克隆抗体,经碳化二亚胺(EDC)将纯化后的单克隆抗体IgG与羧化乳胶共价偶联,并对偶联乳胶的IgG含量及偶联时间等条件进行合理选择,建立了快速检测副猪嗜血杆菌的乳胶凝集试验方法.利用LAT方法检测148株副猪嗜血杆菌疑似菌株,参考16 S rRNA-PCR方法的结果,符合率为83.1%,且致敏乳胶不与临床常见菌株发生凝集反应.结果表明,此检测方法具有操作简便、快速、特异性高的特点,便于在基层推广使用,为副猪嗜血杆菌的诊断和有效防治提供了参考和依据.     

口蹄疫146S病毒粒子IgG的纯化及其免疫活性的鉴定

用口蹄疫146S病毒粒子(FMDV 146S)免疫家兔产生抗体,待血清效价达到1：64以上分离血清;通过饱和硫酸铵盐析沉淀、Sephadex G-25除盐和DEAE-cellul08e层析等方法纯化血清IgG;用间接ELISA方法检测纯化后的血清IgG免疫活性。证明用离子交换层析法纯化兔抗口蹄疫146S病毒粒子血清IgG效果良好。     

犬轮状病毒单克隆抗体制备及胶体金试纸条检测方法的建立

【目的】研发犬轮状病毒(Canine ratavirus, CRV)免疫学诊断试剂,制备并鉴定CRV特异性单克隆抗体,建立可用于检测CRV的胶体金免疫层析法。【方法】以CRV临床分离株SL006株为免疫原免疫BALB/c雌性小鼠,用杂交瘤细胞法进行细胞融合,通过间接免疫荧光法(IFA)筛选可稳定分泌CRV单克隆抗体的杂交瘤细胞,并制备腹水,亲和层析法进行纯化获得单克隆抗体。对获得的单克隆抗体进行鉴定,经条件优化建立胶体金试纸条检测方法,对试纸条的灵敏度、特异性、重复性和应用情况进行评价。【结果】获得了4株杂交瘤细胞,分别命名为2C12、4A5、1H3、5F3,IFA效价分别为1∶6 400、1∶12 800、1∶1 600和1∶3 200;重链亚类分别为IgG2b、IgG2a、IgG1和IgG2a,轻链亚类均为kappa;制备的胶体金试纸条检测线包被单克隆抗体4A5,对照线包被羊抗鼠IgG,金标垫包被胶体金标记的单克隆抗体2C12,对CRV病毒液的检测灵敏度为10^4.2 TCID₅₀/mL,检测犬源其他病毒犬细小病毒(Canine parvo...     

几种方法纯化小鼠腹水IgG2b类单抗的比较

分别采用硫酸铵-蛋白A亲和层析法、改进后的硫酸铵-蛋白A亲和层析法、辛酸-硫酸铵-蛋白A亲和层析法纯化小鼠腹水IgG2b类抗体。经SDS-PAGE和间接ELISA分析纯化产物的纯度及其活性。结果表明:3种方法纯化后的单抗的免疫活性均未降低;纯化后单抗的亚类为IgG2b;经改进后的硫酸铵-蛋白A亲和层析法纯化制备的IgG2b类抗体纯度可达到87.1%;经辛酸-硫酸铵-蛋白A亲和层析法纯化制备的IgG2b类单克隆抗体纯度可达到100%,是一种制备高纯度小鼠腹水IgG2b类单克隆抗体简便而有效的方法。     

鹿流行性出血病病毒双抗夹心ELISA方法的建立

为建立鹿流行性出血病病毒(EHDV)病原学检测方法,用纯化的抗EHDV特异性单克隆抗体包被ELISA板,用兔抗EHDV IgG作为夹心抗体,IgG作为夹心抗体建立EHDV双抗夹心ELISA方法,并对该方法的特异性和敏感性进行了试验.用ELISA分别检测EHDV、蓝舌病病毒(BTV)、水疱性口炎病毒(VSV)、赤羽病病毒...     

猪繁殖与呼吸综合征病毒A06株单克隆抗体的制备及鉴定

用纯化的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)A06株病毒抗原免疫Balb/c小鼠,取免疫小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行细胞融合.经间接ELISA方法筛选,有限稀释法克隆,获得4株稳定分泌特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为3D12、4E10、6E2和7G6.其细胞培养上清效价分别为1:256、1:512、1:512和1:256,小鼠腹水效价分别为1:1.024×106、1:2.048×106、1:1.024×106和1:2.048×106.亚型鉴定表明,3D12、4E10、6E2和7G6分别为IgG2b、IgG2b、IgG1和IgG2a.ELISA检测结果显示,4种PRRSV单克隆抗体仅与PRRSV反应,不与其他病毒反应,表明均为抗PRRSV的型特异性单克隆抗体.对单克隆抗体腹水液进行IgG提取纯化,SDS-PAGE电泳验证,仅出现两条清晰条带,无杂带出现,证明纯化效果较好.这4种单克隆抗体的获得,为建立PRRSV检测方法提供了强有力的工具.     

猪圆环病毒2型Rep蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

本研究旨在制备猪圆环病毒2型(PCV2)Rep蛋白单克隆抗体。PQE30-PCV2Rep蛋白在IPTG的诱导下表达,用SDS-PAGE对表达产物进行检测。将纯化的重组蛋白免疫小鼠,制备单克隆抗体,ELASA法鉴定抗体亚型及效价。结果显示重组蛋白PQE30-PCV2Rep得到高效表达,筛选获得了3株稳定分泌抗Rep蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞系1G4、2G4和6H12,其分泌的抗体分别为IgG2a、IgG2b、IgG2b亚型。其中,6H12抗体效价为256K,浓度为0.47mg/mL,纯度90%。本研究制备的单克隆抗体有较好的生物学特性,为PCV2的研究及快速诊断提供了新的方法。     

非洲猪瘟病毒pK205R蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

非洲猪瘟(ASF)传播对我国生猪养殖造成重大危害,开发用于ASF诊断产品已刻不容缓。本研究为制备非洲猪瘟病毒(ASFV)pK205R蛋白单克隆抗体,构建了能表达ASFV pK205R蛋白的工程菌BL21/pET-pK205R。经IPTG诱导,可表达可溶性的pK205R蛋白。经SDS-PAGE检测,获得的蛋白大小为25 kDa左右。经Western blot鉴定,纯化后的蛋白可与ASFV阳性血清发生特异性反应。以纯化的ASFV pK205R蛋白作为抗原免疫BALB/c小鼠,制备了12株针对ASFV pK205R蛋白的单克隆抗体。经间接ELISA方法鉴定,单克隆抗体的效价均不低于1∶80 000。单克隆抗体重链亚类分别为IgG1及IgG2b,轻链亚类均为κ。通过间接免疫荧光试验(IFA)测定12株单克隆抗体均不与猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病病毒、猪流行性腹泻病毒存在交叉反应,且均能与ASFV反应。本研究为建立快速检测非洲猪瘟病毒感染的诊断方法奠定了基础。     

IL-17单克隆抗体的制备与鉴定

为制备山羊IL-17单克隆抗体,诱导重组菌rIL-17-pET32a-TransB(DE3)表达山羊IL-17重组蛋白(rIL-17),纯化后免疫BALB/c小鼠,取免疫合格的小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行细胞融合,采用间接ELISA方法筛选阳性克隆细胞株。对获得的杂交瘤细胞进行染色体组型分析,并对其分泌的IL-17单克隆抗体进行抗体特异性、抗体类别等分析。结果显示,成功获得了纯化的山羊IL-17原核表达产物;筛选到1株能特异性分泌山羊IL-17单克隆抗体的杂交瘤细胞株-B6,其分泌的单克隆抗体亚型为IgG1,抗体轻链为κ。     

抗犬瘟热病毒重组核衣壳蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

以纯化的重组犬瘟热病毒(CDV)N蛋白免疫BALB/c小鼠,应用常规杂交瘤技术获得两株能稳定分泌特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞系,分别命名为A_4C_6C_(12)和A_5B_8H_7。间接ELISA检测腹水效价分别为1:10~6、1:10~5;亚类鉴定结果分别为IgG2a、IgG2b,轻链均为κ型;Western blot和ELISA分析结果显示2株单克隆抗体均能与重组N蛋白和CDV发生反应,而与犬细小病毒及犬腺病毒等无交叉反应;ELISA叠加试验的增值结果表明两株单克隆抗体识别的抗原位点不同。特异性抗CDV-rN的单克隆抗体的获得,为进一步用于临床诊断研究奠定了基础。     

鸡SIgA重链单克隆抗体的制备及新城疫病毒和禽流感病毒特异黏膜SIgA检测方法的建立

为建立快速检测禽类黏膜组织中SIgA含量的方法,本研究原核重组表达鸡SIgA重链片段蛋白,纯化后免疫BALB/c鼠.以鸡胆汁中分离纯化的SIgA作为检测抗原,常规单克隆技术筛选出1株能够稳定分泌抗鸡SIgA单克隆抗体(MAb)的IgG2a、κ型MAb.经ELISA和western blot分析,所获得的1株MAb亲和力高、特异性强;采用生物素标记纯化MAb腹水IgG为检测二抗,以禽流感-新城疫重组二联活载体疫苗免疫SPF鸡为模型,初步建立了新城疫病毒和H5亚型禽流感病毒特异的黏膜SIgA间接ELISA检测方法.本研究为开展特异性家禽黏膜免疫机制的研究提供了重要技术手段.     

猪戊型肝炎病毒Ⅳ型衣壳蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

为获得猪戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus,HEV)Ⅳ型衣壳蛋白单克隆抗体,将猪HEV衣壳蛋白的C端267(408—675)个氨基酸基因序列克隆入原核表达载体pET-28a(+),构建重组质粒pET-28a-ORF2-C,转化E.coli Rosetta(BL21)感受态细胞进行诱导表达,SDS-PAGE和Western blot鉴定,纯化后免疫小鼠。取免疫小鼠的脾脏与鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合制备单克隆抗体。通过间接ELISA和竞争ELISA方法筛选并鉴定单抗。结果表明蛋白得到正确、高效表达,获得3株识别不同的抗原表位区的单克隆抗体,分别命名为Mab-1E4(IgG1)、Mab-2C7(IgG1)和Mab-2G9(IgG2b),其中1E4和2G9能阻断临床阳性猪血清,提示该2株单克隆抗体识别的抗原表位是猪HEVⅣ型衣壳蛋白上重要的抗原表位区,而单抗Mab-2C7不能阻断。本研究为猪HEVⅣ型的诊断及研究提供重要工具。     

两种方法纯化免抗绵羊肺炎支原体IgG的比较

目的:比较两种方法纯化兔抗绵羊肺炎支原体IgG的效果。方法:采用饱和硫酸铵和辛酸-硫酸铵两种方法分离纯化兔抗绵羊肺炎支原体抗体,并用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、分光光度计和琼脂扩散(AGP)试验对纯化产物进行相对分子质量、蛋白质含量及免疫活性进行鉴定。结果:纯化后抗体的蛋白含量基本相同;产物纯度和效价以辛酸-硫酸铵法较高。结论:辛酸硫酸铵法是一种简便、快速、高效的抗体纯化方法。     

犬瘟热病毒单克隆抗体的制备和鉴定

将从水貂中分离的犬瘟热病毒(CDV) HB株,以培养纯化的犬瘟热病毒HB株免疫BALB/c小鼠,采用B淋巴细胞杂交瘤技术,通过ELISA筛选,获得3株能稳定分泌抗犬瘟热病毒结构蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株.3株单克隆抗体菌属于IgG1亚类,其腹水效价可达到1∶51 200和1:204 800,细胞培养上清液效价可达到1:256和1:512.ELISA分析表明,单抗仅与CDV发生特异性反应,而与犬细小病毒(CPV)和犬腺毒(CAV)没有交叉反应;荧光免疫染色检测进一步表明单克隆抗体的特异性好.该特异性单抗的制备为建立有效检测犬瘟热病毒感染的方法奠定基础.     

抗新城疫单克隆抗体的制备与特异性分析

以蔗糖反透析浓缩及Sephadex G-200层析纯化F48E8和LaSota新城疫病毒(NDV)，取纯化的病毒液免疫接种BALB／c小鼠，将小鼠脾细胞与NS-1骨髓瘤细胞融合，经次黄嘌呤、氨基喋呤和胸苷(HAT)培养基选择，间接ELISA检测，有限稀释法克隆，筛选出了3株杂交瘤细胞，依次命名为1D4、1D5、16G12。3株杂交瘤细胞的染色体数为80～100，并能稳定传代，其产生的单克隆抗体重链属于IgG1，轻链属于κ链；ELISA检测时仅与NDV发生特异性反应，而与其他常见禽类病毒抗原不出现交叉反应，应用这些单克隆抗体对NDV分离株进行了分群研究。     

抗犬细小病毒单克隆抗体的制备与鉴定

为制备针对犬细小病毒(CPV)的单克隆抗体,以纯化的CPV免疫BALB/c小鼠,3次免疫后,取其脾细胞与SP2/0细胞进行细胞融合。利用超速离心纯化的病毒作为包被抗原,采用间接ELISA方法筛选阳性杂交瘤细胞,获得3株能稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为1D9、3G9和4F6。单克隆抗体细胞培养上清效价为1∶64、1∶64、1∶128,腹水效价为1∶10~4、1∶10~4、1∶10~5。3株杂交瘤细胞的染色体数分别为92、94、98。亚类鉴定结果显示1D9和3G9重链为IgG1,4F6重链为IgG2b,轻链均为kappa链。病毒中和试验表明,单克隆抗体4F6对CPV具有明显的病毒中和活性。交叉试验表明,3株单克隆抗体均可与CPV特异性结合,与其他犬类常见病毒无交叉反应。本研究制备的单克隆抗体为CPV的检测及其感染动物的治疗提供了物质基础。     

羊Ⅱ型肺泡上皮细胞的分离培养及鉴定

为改进羊肺泡Ⅱ型上皮细胞的分离和培养技术,本研究采用IgG黏附法结合磁化树脂微粒法分离纯化了山羊肺泡Ⅱ型上皮细胞,碱性磷酸酶染色检查表明Ⅱ型细胞占90%以上,台盼蓝染色活细胞为95%以上.羊肺泡Ⅱ型上皮细胞分离纯化方法的建立,为今后体外分离培养绵羊肺腺瘤病毒(JSRV)的探索性工作奠定了基础,也为研究肺纤维化及肺癌发病机理等重大课题提供了重要的技术支持.