上游调控对t-PA基因乳腺定位表达的影响

乳清酸蛋白（ Ｗ Ａ Ｐ）和 β酪蛋白（βｃａｓｅｉｎ）是乳中主要的蛋白质。其基因调控区常作为乳腺定位表达的启动子,在表达质粒 Ｐｓｖｌ Ｗ Ａ Ｐ Ｐ Ａ 的基础上,构建了表达质粒 Ｐｓｖｌβ△ Ｗ Ａ Ｐ Ｐ Ａ。采用基因直接注射方法将 Ｐｓｖｌ Ｗ Ａ Ｐ Ｐ Ａ 和 Ｐｓｖｌβ△ Ｗ Ａ Ｐ Ｐ Ａ 分别注入家兔乳腺中。溶圈试验结果显示,两种表达质粒均能在乳腺细胞中得到暂时性表达,增加上游调控元件,有助于提高表达水平。     

小鼠乳清酸蛋白上游调控序列的克隆及其指导下CAT基因在家兔乳腺中的表达

应用PCR技术，从小鼠基因组中克隆了1．6kb乳清酸蛋白(WAP)基因5’上游调控序列，经酶切和测序证实与已知序列基本一致。为了证实此调控序列能否指导外源基因在乳腺中的表达，将此序列与报告基因CAT融合，构建了pWAP—CAT—polyA乳腺定位表达载体，脂质体包裹后，经乳导管将其注入到妊娠中后期家兔乳腺中进行暂时表达。分别于家兔分娩后1—10d采奶，用ELISA检测乳汁中CAT含量。结果表明，所构建的载体在家兔乳腺中能够表达，表达水平在家兔分娩后1—5d较高。     

乳清酸蛋白基因调控序理的鉴定及转基因小鼠乳腺表达G—CSF载？…

乳清酸蛋白基因亚克隆、酶切鉴定,并对该基因５区进行克隆物序更分析,在核实序列正确后,构建了以其为调控序列、指导入Ｇ－ＣＳＦ基因的真核表面质粒,以用于转基因动物乳腺表达研究。     

小鼠乳清酸蛋白上游调控序列的克隆及其指导下CAT基因在家兔乳腺中的表达

应用PCR技术,从小鼠基因组中克隆了1.6kb乳清酸蛋白(WAP)基因5′上游调控序列,经酶切和测序证实与已知序列基本一致.为了证实此调控序列能否指导外源基因在乳腺中的表达,将此序列与报告基因CAT融合,构建了pWAP-CAT-polyA乳腺定位表达载体,脂质体包裹后,经乳导管将其注入到妊娠中后期家兔乳腺中进行暂时表达.分别于家兔分娩后1～10 d采奶,用ELISA检测乳汁中CAT含量.结果表明,所构建的载体在家兔乳腺中能够表达,表达水平在家免分娩后1～5 d较高.     

乳清酸蛋白基因调控序列的鉴定及转基因小鼠乳腺表达G-CSF载体的构建

乳清酸蛋白基因经亚克隆、酶切鉴定,并对该基因５′区进行克隆和序列分析,在核实序列正确后,构建了以其为调控序列、指导人Ｇ－ＣＳＦ基因的真核表达质粒,以用于转基因动物乳腺表达研究。     

牛β—酪蛋白基因上游调控序列PCR扩增及克隆

采用蛋白酶Ｋ法从母牛肝中提取染色体ＤＮＡ,将其纯化后作为ＰＣＲ扩增模板。以引物设计软件从牛β－酪蛋白基因上游６００ｂｐ至第１个外显子设计引物,引物长度１９ｎｔ,跨度６３７ｂｐ。扩增产物电泳结果显示,在分子量Ｍａｒｋｅｒ６５７ｂｐ带附近,出现一明显亮带,这一结果与设计产物大小基本一致。用低温冷冻法纯化ＰＣＲ产物,煮沸裂解法提取载体ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔⅡＫｓ＋质粒,ＥｃｏＲＶ酶切质粒ＤＮＡ,Ｔ４ＤＮＡ连接酶连接ＰＣＲ扩增片段和质粒ＤＮＡ。将重组质粒ＤＮＡ转化到ＪＭ１０１大肠杆菌中,经筛选、酶切、测序鉴定,结果表明所克隆的片段为牛β－酪蛋白基因上游调控序列。     

山羊β-酪蛋白启动子指导的通用表达载体及乳腺暂时表达系统

为了实现外源蛋白在动物乳腺中的特异性高效表达，利用山羊β-酪蛋白5’端1．132kb的侧翼调控序列、牛生长激素基因polyA(BGHPA)序列、基质结合区(matrixattac}linentregion，MAR)和多克隆住点(MCS)，构建了乳腺组织定位通用表达裁体pMRPA，鉴定正确后，将2．1kb的人组织型纤溶酶原激活荆(tissue—type plasminogen activator，tPA)cDNA克隆到pMRPA多克隆位点，获得重组表达载体pMRPA—tPA。在不同的泌乳时间，使用不同的包裹剂，采用不同的剂量，将pMRPA—tPA注入泌乳期山羊乳腺组织进行暂时表达。结果显示，所构建的乳腺组织特异性通用表达载体能够有效地指导目的基因的高效表达。通过乳腺暂时表达试验进一步发现，泌乳稳定期表达效果最好，tPA表达水平在2．020～6．959mg／L；表达量随DNA用量的增加而提高；使用普通包裹剂和裸质粒相比，普通包裹剂对表达效果无明显影响。本试验对乳腺暂时表达系统进行了系统性研究，为通过乳腺暂时表达系统改良乳汁蛋白组成提供了重要依据。     

牛乳腺β-酪蛋白基因的克隆及其表达载体的构建

利用高保真PCR法,分别扩增了牛乳腺β-酪蛋白基因的1.8和1.1 kb的5′和3′调控序列,将其分别克隆入TA载体。经PCR验证后测序,用NCBI Blast软件分析表明其克隆片断与奶牛β-酪蛋白基因相应区域同源性分别为97.0%和99.0%,表明成功克隆了酪蛋白基因5′和3′的调控区。然后利用DNA重组技术依次亚克隆入改造过的真核表达载体pcDNA3（切除CMV启动子）,构建成牛乳腺特异表达载体。获得的重组载体经限制性内切酶酶切鉴定,测序验证等表明,成功构建了牛乳腺特异表达载体。     

褪黑素膜受体在泌乳期奶山羊乳腺的表达及褪黑素对乳腺β-酪蛋白表达的影响

此试验旨在研究褪黑素膜受体(Melatonin membrane receptors, MT)在奶山羊乳腺中的分布和表达及褪黑素对奶山羊乳腺β-酪蛋白(β-casein)表达的调节作用。以泌乳期奶山羊为研究对象,采用Real-time PCR和免疫组织化学染色方法检测MT1和MT2在泌乳期不同阶段奶山羊乳腺中的表达和分布;褪黑素处理体外培养的泌乳期乳腺组织,Real-time PCR方法检测其β-酪蛋白mRNA的表达情况。结果发现:(1)MT1和MT2 mRNA在泌乳期奶山羊乳腺都有表达,并具有相同的表达趋势,泌乳高峰期(泌乳期60 d)显著高于泌乳上升期(泌乳期30 d)和泌乳下降期(泌乳期120 d)(P0.05);(2)MT1和MT2主要定位于乳腺上皮细胞,泌乳高峰期为强阳性,泌乳上升期和下降期阳性反应较弱;(3)褪黑素处理能显著下调乳腺组织β-酪蛋白mRNA的表达(P0.05)。结果表明,褪黑素能直接作用于乳腺,调节泌乳期奶山羊泌乳活动。     

牛BLG/hEPO和大鼠WAP/hEPO基因在家兔乳腺中的表达

将人红细胞生成素 (h EPO)基因组 DNA(g DNA)与 1.1kb牛 β-乳球蛋白 (BL G)基因的 5′端上游调控序列融合 ,构建了 p CMV- BL G- EPO- b GH poly A(p CBEA)乳腺定位表达载体。该载体与已构建的大鼠乳清酸蛋白 (WAP)基因 5′端上游调控序列和 h EPO融合基因 p WAP- EPO- WAP3′U TR(p WE3′)和 p CMV- WAP- EPO- b GH poly A (p CWEA )经脂质体包裹后 ,通过显微外科方法 ,经乳腺导管注入妊娠中后期家兔乳腺内 ,进行短暂表达。于家兔分娩后 1～ 2 5 d采奶 ,EL ISA检测乳汁中 EPO含量 ,3个载体均获得表达。表达水平从高到低依次为 p CWEA、p CBEA、p WE3′;表达量为 0 .116～ 0 .75 3μg/ L ,且表达一直持续整个泌乳期     

Study on Expression of SYK in Dairy Cow Mammary Gland

To investigate the relationship between the expression of SYK and dairy cow mammary gland development and lactation, the expression of SYK in lactating dairy cow mammary gland with high or low quality milk and dry period Holstein dairy cow mammary gland was detected by Western blotting and laser confocal microscope.The results showed that SYK expression in dry period mammary gland was significant higher than that in lactating mammary gland (P<0.05).There was no SYK differential expression detected between lactating mammary gland with high quality milk and low quality milk (P>0.05).SYK was mainly located in the cytoplasm of ductal epithelial cells in dry period mammary gland.In lactating mammary gland, SYK was existed in acinar epithelial cells.All these results revealed that SYK was a regulator in mammary epithelial cell proliferation and differentiation.It participated in mammary gland reconstitution in dry period.     

脾源性酪氨酸激酶基因在奶牛乳腺中的表达研究

为探讨脾源性酪氨酸激酶(spleen tyrosine kinase,SYK)的表达与奶牛乳腺发育和泌乳功能之间的关系,试验采用Western blotting和激光共聚焦显微技术对泌乳期高乳品质、低乳品质及干乳期的中国荷斯坦奶牛乳腺组织中SYK的表达含量和表达部位的变化进行研究。结果表明,干乳期奶牛乳腺组织中SYK的表达显著高于泌乳期奶牛乳腺组织(P<0.05),泌乳期高乳品质、低乳品质奶牛乳腺组织中SYK的表达差异不显著(P>0.05);在干乳期SYK主要在乳腺导管上皮细胞的胞质中表达,而在泌乳期SYK在腺泡上皮细胞中表达。结果提示SYK是乳腺上皮细胞增殖与分化的调节因子,主要参与干乳期乳腺组织的重建过程。     

小鼠NIS蛋白的生物信息学特征及其在乳腺中的表达分析

为探究小鼠钠碘转运体（Na⁺/I^- symporter,NIS）蛋白的结构、功能及其在乳腺组织的表达特征,本研究扩增小鼠乳腺NIS基因编码区,测序鉴定后采用结构预测软件对NIS蛋白进行生物信息学分析,同时采用Western blotting、免疫组织化学技术和半定量PCR技术对NIS基因在不同乳腺发育时期的转录和表达水平进行分析。结果显示,小鼠NIS基因编码区全长1 857 bp,与人NIS的同源性为80.40%,保守性较强。NIS蛋白含有618个氨基酸残基,分子质量约为65.7 ku,分子式为C₂₉₉₆H₄₇₀₁N₇₄₉O₈₃₃S₃₂,理论等电点为7.44,半衰期为30 h,消光系数为102 510,不稳定系数为29.31,脂溶系数为105.91,富含疏水性氨基酸,为稳定的疏水蛋白。NIS蛋白二级结构含有α-螺旋（41.42%）、延伸链（18.28%）、β-转角（4.05%）和无规则卷曲（36.25%）,三级结构与之相一致。Western blotting结果显示,4个时期均出现特异性杂交带,大小为65.7 ku,与预期结果相符。免疫组织化学结果表明,NIS蛋白在小鼠的青春期、妊娠期到泌乳期的乳腺组织中表达量逐渐增加,在泌乳期达到高峰,存在显著差异（P<0.05）,在退化期逐渐恢复到类似青春期状态;NIS基因mRNA的变化规律与蛋白表达一致。本研究结果为进一步探究NIS蛋白在乳腺发育和泌乳调控中的作用提供了参考依据。     

hEPO乳腺定位表达载体的构建及其在大鼠和家兔乳腺中的暂时表达

将人红细胞生成素（ｈＥＰＯ）基因组ＤＮＡ（ｇＤＮＡ）与大鼠乳清酸蛋白（ＷＡＰ）基因的上游调控序列融合,分别构建了ＰＷＡＰＥＰＯ－ＷＡＰ３‘ＵＴＲ（ＰＷＥ３’）和ＰＣＭＶ－ＷＡＰ－ＥＰＯ－ＢＨＧｐｏｌｙ（ｐＣＷＥＡ）２个乳腺中位表达载体,表达载体经脂质体包裹后,以显微外科方法,经乳腺导管注入妊娠中后期大鼠和家兔腺内,进行暂时表达。分别大于分娩后４８、７２ｈ,家兔分娩后１－１０ｄ采奶,ＥＬＩＳＡ方法检     

饲粮添加精氨酸对娩后Wistar大鼠乳腺组织发育及酪蛋白合成的影响

本试验旨在研究饲粮添加精氨酸(Arg)对娩后Wistar大鼠乳腺组织发育及其酪蛋白合成的影响。采用同窝对照的方法,选择同窝12只已受孕的Wistar大鼠,随机平均分为2组。Arg组在基础饲粮中添加与其等量的Arg(饲粮Arg含量1.280%),对照组饲粮用谷氨酸替代Arg组中的Arg以平衡饲粮氮水平。预试期4 d(分娩前4天)和正试期17 d(分娩后17天),结束后采集泌乳大鼠的乳腺组织,制作组织切片并测定其酪蛋白含量。结果表明:Arg能促进乳腺组织的发育,且乳腺腺泡切面面积的极显著增大(P0.01)。另外,Arg对乳腺β-酪蛋白的含量有显著的提高作用(P0.05),同时娩后大鼠体重也有增加的趋势(P0.05)。结果提示,饲粮添加Arg对Wistar大鼠乳腺组织发育及β-酪蛋白的合成有显著的促进作用。     

人红细胞生成素转基因小鼠乳腺生物反应器的建立

将 ２．４ ｋｂ 的人红细胞生成素（ｈ Ｅ Ｐ Ｏ）基因组基因（ｇ Ｄ Ｎ Ａ）ｍ ｉｎｉｇｅｎｅ 克隆于 ０．９７７ ｋｂ 大鼠乳清酸蛋白（ Ｗ Ａ Ｐ）５′调控序列下游和 ０．８５ ｋｂ Ｗ Ａ Ｐ３′侧翼序列上游,构建了 ｈ Ｅ Ｐ Ｏ 乳腺定位表达载体 ｐ Ｗ Ａ Ｐ Ｅ Ｐ Ｏ Ｗ Ａ Ｐ３′ Ｕ Ｔ Ｒ（ｐ Ｗ Ｅ３′）。载体经 Ｓａｃ Ｉ Ｉ酶切、回收并纯化后作为目的基因,通过显微注射方法导入小鼠受精卵的雄原核,共注射 ５００ 枚卵,移植 ３００ 枚卵至 ２９ 只假孕母鼠输卵管内,获得仔鼠 ５５ 只。采取鼠尾,提取基因组。经 Ｐ Ｃ Ｒ 检测,阳性鼠 ２２ 只; Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ 检测,阳性鼠 １６ 只,其中 ９ 只母鼠,７ 只公鼠。将 １６ 只首建者小鼠分别与非转基因鼠交配,共获得 Ｆ１ 代仔鼠 １５７ 只。应用 Ｐ Ｃ Ｒ 方法对 Ｆ１ 代小鼠进行检测,结果首建者１ 号母鼠所生的 ６ 只仔鼠中有 ３ 只为阳性。与此同时,于 ９ 只雌性首建者分娩后第 １０ 天采奶,应用 Ｅ Ｌ Ｉ Ｓ Ａ 方法对乳汁中的 Ｅ Ｐ Ｏ 进行检测,结果 ６ 只母鼠获得表达,表达量为 ０．１２～１．５９ μｇ／ Ｌ。     

人c-myc乳腺定位表达转基因小鼠的建立

以含有 1.6 kb的小鼠乳清酸蛋白 (WAP)上游调序列的 p CAT- WAP和含有人 c- myc c DNA的 p WM为原始质粒 ,构建了 WAP启动子调控下的 c- myc乳腺定位表达载体 p WCS。载体用 Bgl Bam H 酶切 ,回收 3.5 kb的基因片段 WAP- c- myc- SV40 Poly A,通过显微注射方法导入 C5 7BL/ 6 J× DBA/ 2 JF1 代小鼠受精卵的雄原核内。共注射10 0 0枚卵 ,将存活的约 6 0 0枚卵分别移植至 2 9只假孕母鼠输卵管内 ,获得仔鼠 45只。PCR检测 ,阳性鼠 9只 ,South-ern blot检测 ,阳性鼠 3只 ,其中 1只母鼠 ,2只公鼠 ,在饲养过程中 ,1只母鼠意外死亡。对 2只转基因公鼠的 F1代PCR检测表明 ,仅 1只公鼠具有遗传性 ,在所生的 2 7只 F1代小鼠中有 13只为 PCR阳性。     

人Bcl-2乳腺定位表达转基因小鼠的建立

以 p CAT、p WB和 p WC为原始质粒 ,构建 WAP启动子调控的 Bcl- 2乳腺组织特异性表达载体 p WBS。载体用Bgl +Sal +Pvu 酶切 ,回收 3.0 kb的基因片段 WAP- Bcl- 2 - SV40 Poly A,通过显微注射方法导入 C5 7BL / 6 J×DBA/ 2 JF1代小鼠受精卵的雄原核内。共注射 10 0 0枚卵 ,将存活的约 6 0 0枚卵分别移植至 2 9只假孕母鼠输卵管内 ,获得仔鼠 5 5只。PCR检测 ,阳性鼠 12只。Southern blot检测 ,阳性鼠 4只 ,其中公、母鼠各 2只 ,在饲养过程中 ,2只公鼠均意外死亡。Western blot证实 ,1只母鼠 Bcl- 2表达阳性 ,其 F1代的 40只小鼠中 ,有 18只呈 PCR阳性 ,其中母鼠8只 ,在 5个月的反复怀孕过程中 ,未观察到乳房有任何肿瘤或肿块的出现 ,证实 Bcl- 2单独在转基因鼠乳腺中表达不会引起转基因鼠乳腺癌的发生。     

人血清白蛋白基因乳腺表达载体在奶山羊乳腺中的瞬间表达

构建了包括人血清白蛋白 ( h ALB)基因的 c DNA全序列、内含子 1以及山羊β-酪蛋白基因启动子和 5′端上游调控序列在内的乳腺表达载体 pc DNA3.1 -GCALBm,采用直接注射法将其导入哺乳期的奶山羊乳腺组织 ,然后通过放射免疫法测定乳汁中 h ALB的含量。结果显示 ,5头受试奶山羊的乳汁中有明显的 h ALB表达 ,注射后第 2天放免测定值从注射前的 4 .0 mg/L左右分别上升至 62 .2、59.2、36.2、4 2 .3、1 7.5mg/L,并持续表达在 2周以上 ,其中 1头受试羊乳汁中 h ALB的表达量维持在 80 mg/L左右 ,并超过了 1 0 0 d。而在乳腺组织中注射 pc DNA3.1空质粒或生理盐水的 4头对照奶山羊的乳汁中 ,放免测定值无变化。