大豆对大豆疫霉菌株Pm14抗性的遗传分析及基因定位

 【目的】研究大豆对大豆疫霉菌株Pm14的遗传模式,并对其抗性基因进行定位。【方法】采用下胚轴创伤接种方法进行抗性鉴定,利用苏88-M21与新沂小黑豆构建的重组自交系群体进行遗传分析,并通过SSR技术结合BSA方法对苏88-M21的抗性基因进行定位。【结果】苏88-M21对大豆疫霉菌株Pm14的抗性由1对主效基因控制,抗病对感病表现为显性。通过分子作图,将抗性基因RpsSu定位于大豆分子遗传图谱O连锁群微卫星标记Satt358和Sat_242之间,与这2个标记的遗传距离分别为3.5 cM和7.4 cM。【结论】苏88-M21对大豆疫霉菌株Pm14的抗性是由1对单显性基因控制的,并将在苏88-M21发现的抗性基因RpsSu定位于O连锁群。     

中国大豆疫霉菌分布及毒力多样性研究

 通过大豆疫霉根腐病发生的田间调查、从病株和土壤中分离大豆疫霉菌 ,对大豆疫霉菌在我国的分布进行了研究 ,结果表明 ,除东北地区外 ,我国黄淮流域和长江流域也存在大豆疫霉菌。应用 13个鉴别寄主 ,对来自不同地区的 83个大豆疫霉菌分离物进行毒力鉴定 ,证明我国大豆疫霉菌存在丰富的毒力多样性。与植株分离物相比 ,土壤分离物的毒力多样性程度更高。对不同地区来源分离物的毒力组成比较表明 ,长江流域分离物的毒力多样性最丰富 ,其次是黄淮流域 ,而东北地区分离物的毒力组成相对简单。     

大豆品种（系）抗疫霉根腐病基因推导

 【目的】推导大豆品种（系）的抗疫霉根腐病基因,为病害防治筛选有效抗病品种（系）。【方法】用下胚轴创伤接种法鉴定124个品种（系）对12个大豆疫霉菌菌株的反应型,通过基因推导方法分析品种（系）的抗病基因。【结果】124个品种（系）对12个菌株共产生51个反应型,13个品种（系）产生的反应型分别与几个含有已知抗病基因品种（系）的反应型相同,33个品种（系）产生的反应型符合一些两个已知抗病基因组合的反应型,这些品种（系）可能含有已知抗病基因或基因组合;52个品种（系）共产生37个既不同于任何含有单个已知抗病基因品种（系）的反应型也不同于两个已知抗病基因组合的反应型,它们可能含有新的抗病基因或基因组合。【结论】鉴定的大豆品种（系）普遍存在对疫霉根腐病的抗性,但抗病品种（系）数量和抗性水平存在地区间差异,同一地区多数抗病品种的遗传背景和抗性水平相似。     

中国大豆疫霉菌群体遗传结构的RFLP分析

 【目的】分析中国大豆疫霉菌的群体遗传结构,探索不同地区大豆疫霉菌群体间的亲缘关系。【方法】采用RFLP（restriction fragment length polymorphism）技术,对大豆疫霉菌进行群体遗传结构的分析;利用Popgene V1.32软件计算大豆疫霉菌群体间的遗传相似度;利用NTSYSpc V2.10软件估算菌株间的遗传距离,并依据遗传距离构建UPGMA（unweighted pair-group method with arithmetic averages）系统树状图谱。【结果】采用探针PS127558对来自黑龙江、新疆和内蒙古等5个大豆疫霉菌地理群体的133个菌株的遗传多样性进行了分析,共得到25条杂交带,其中多态性条带为24个,占96%。黑龙江分别和新疆、内蒙古群体间遗传相似度较高。相对于黑龙江群体遗传结构的高度复杂性,新疆和内蒙古菌株的群体遗传结构则比较简单,分别有88.2%和100%的菌株分属于同一聚类组,且均有超过58%的菌株和部分黑龙江菌株指纹图谱完全相同。Shannon’s多样性指数也表明黑龙江群体的遗传多样性最为丰富。福建和其它群体之间的遗传相似度较低,且分别有45.5%和54.5%的福建群体都属于聚类组E和F,遗传背景较为单一。福建群体的Shannon’s多样性指数低于黑龙江和美国。美国和黑龙江群体之间的遗传相似度较高,且部分美国菌株和黑龙江菌株指纹图谱相同。【结论】新疆、内蒙古的大豆疫霉菌起源于黑龙江,福建的大豆疫霉菌可能为一个独立的进化分支或起源于其它地区。此外,中国和美国的大豆疫霉菌群体间存在菌源交流。     

大豆疫霉中Myb类转录因子的预测与分析

[目的]为阐明大豆疫霉中Myb类转录因子的作用机理提供科学依据。[方法]以从大豆疫霉基因组数据库中筛选的大豆疫霉Myb类转录因子为研究对象,分析其在大豆疫霉中的分布特点和4个重要值较大的Myb因子在大豆疫霉与寄主互作过程中的转录模式,并对Myb因子进行聚类。[结果]大豆疫霉基因组中含50个Myb,其在基因组中的分布不均 50个Myb因子可聚为6类（A、B、C、D、E、F）,其中聚类组E中Myb因子最多,占总数的40%,聚类组B中Myb因子最少,只有4个 Myb因子在疫霉菌丝数据库中出现的频率最高（0.44%）,在侵染数据库中出现的频率最低（0.26%） 4个Myb因子在疫霉侵染寄主过程中均有转录。[结论]该研究为明确大豆疫霉Myb的生理功能及其在疫霉致病过程中的作用提供了参考。     

华南大豆种质对大豆疫霉根腐病的抗性分析

【目的】大豆疫霉根腐病是由大豆疫霉菌引起的严重影响大豆生产的世界性病害之一,选用抗病品种是控制该病最经济有效的措施。筛选抗大豆疫霉菌PGD1的优异抗源和多抗疫霉根腐病种质资源,推导大豆种质抗疫霉根腐病基因,为热带、亚热带地区大豆抗病育种提供有效抗源。【方法】采用下胚轴创伤接种法,利用在广东发现并分离的大豆疫霉菌PGD1菌株,接种鉴定主要来自广东、广西、福建、海南、湖南、江西和四川等华南省份631份大豆种质资源的抗病性,筛选抗大豆疫霉菌PGD1种质资源;再用其他6个不同毒力的大豆疫霉菌株接种鉴定抗大豆疫霉菌PGD1的种质,筛选多抗资源,通过基因推导方法分析抗病种质的抗病基因类型。【结果】631份大豆种质中有101份种质抗大豆疫霉菌PGD1,占鉴定种质的16.0%;73份为中间反应类型,占11.6%;457份表现感病,占72.4%。其中83份抗大豆疫霉菌PGD1的种质对其他6个不同毒力菌株Pm14、Pm28、PNJ1、PNJ3、PNJ4、P6497的侵染率分别为28.9%、34.9%、9.6%、66.3%、57.8%和10.8%。4份种质同时抗7个不同毒力的大豆疫霉菌株,分别为ZDD21538、ZDD21604、ZDD14286和明夏豆1号,占鉴定种质的4.8%。毒力频率为0的种质有15份,占鉴定种质的18.1%。83份大豆种质对7个不同毒力的大豆疫霉菌株共产生20种反应型,1种反应型与单个抗病基因的鉴别寄主Williams79反应型一致,可能含有抗病基因Rps1c;45份种质产生的9种反应型符合一些2个或2个以上已知抗病基因组合的反应型,这些种质可能含有已知抗病基因组合;38份种质共产生11种反应型既不同于任何含有单个已知抗病基因品种的反应型也不同于2个或2个以上已知抗病基因组合的反应型,它们可能含有新的抗病基因或基因组合。【结论】华南地区大豆种质中蕴藏着丰富的抗大豆疫霉菌PGD1和多抗大豆疫霉菌抗源,这些抗病种质可作为热带、亚热带地区大豆抗病育种的重要亲本和抗病基因定位的重要研究材料。     

新疆大豆疫霉菌的毒力组成研究

为明确大豆疫霉菌在新疆的分布和新疆大豆疫霉菌的毒力组成,采用大豆叶碟诱捕法从新疆大豆田土壤中分离大豆疫霉菌,并采用幼苗下胚轴伤口接种法鉴定大豆疫霉菌的毒力。结果共分离到26个大豆疫霉菌株,毒力测定鉴定出20个不同的毒力型,说明新疆的大豆疫霉菌表现出丰富的毒力多样性。新疆大豆疫霉菌对抗病基因Rps1a,Rps1c和Rps1k的毒力频率均为0,因此,可应用这3个抗病基因对新疆大豆疫霉根腐病进行有效控制。     

新疆大豆疫霉菌毒力及大豆品种抗病性

对34株大豆疫霉菌(Phytophthora sojae)新疆分离物进行了毒力鉴定,发现新疆疫区大豆疫霉菌毒力结构复杂,不同地块之间、同一地块不同大豆疫霉菌分离物间都存在毒力差异.用7个不同毒力的分离物接种鉴定了19个新疆地区栽培大豆品种(系)的抗病性,其中10个品种(系)表现较好的抗性.     

大豆疫霉根腐病研究进展

综合评述了大豆疫霉根腐病的发展历史、生理小种分化情况、寄主抗病机制以及抗源的筛选 ,重点评述了抗病机制和抗源的筛选研究进展情况。     

大豆疫霉根腐病抗性相关基因SDR1的克隆及功能分析

【目的】获得大豆疫霉根腐病抗性相关基因,为培育大豆抗病品种提供理论依据。【方法】在以大豆抗病品种绥农10构建的受疫霉菌诱导后差异表达的cDNA消减文库的基础上,选取文库中一条与其它植物的DR1基因具有较高同源性且上调表达的EST序列。通过RT-PCR方法从绥农10中克隆该基因,并构建到植物表达载体pCAMBIA3301上,以感病品种东农50的子叶节为外植体通过根癌农杆菌介导的方法进行大豆遗传转化。【结果】该基因全长805 bp,开放读码框为471 bp,编码156个氨基酸,在此命名为SDR1。遗传转化获得转基因PCR鉴定阳性植株5株,Real-time PCR检测T1转基因植株较非转基因植株SDR1表达量提高20倍以上的有3株,经Southern杂交分析表明,出现杂交信号的有3株。经离体叶片接种大豆疫霉菌,转基因大豆的抗性较非转基因大豆明显提高。【结论】成功克隆了大豆疫霉根腐病抗性相关基因SDR1,并通过对过量表达的大豆转基因植株的抗病性鉴定初步确定了SDR1的抗病功能。     

番茄ShARPC5抗白粉病功能分析

【目的】白粉病(powdery mildew)是番茄生产上的重要病害,严重影响番茄的产量。番茄基因组测序工作的完成为抗病基因挖掘提供了重要的信息资源。ARP2/3(actin-related protein 2 and 3)复合体是肌动蛋白微丝骨架动力学的主要调控因子,能够参与包括响应外界胁迫等多种细胞学过程。本研究通过对番茄ARPC5(actin-related protein C5)进行克隆和抗病功能验证,为番茄基因组信息完善、抗病机制解析和分子育种等方面打下基础。【方法】从番茄LA1777(Solanum habrochaites)cDNA中PCR扩增ShARPC5,使用DNAMAN 6.0进行多序列比对;MEGA 6.0构建系统发育树;应用在线工具ProtComp v. 9.0进行亚细胞定位预测。利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)比较接种白粉菌(Oidium neolycopersici,On-Lz)后高感品种Moneymaker(MM)和高抗品种LA1777中番茄ARPC5的表达特征,分析白粉菌侵染与ARPC5表达的相关性。应用病毒诱导的基因沉默(virus-induc...     

小麦转录因子TabHLH041基因的克隆与表达分析

利用RT-PCR方法从小麦品种辽春10号中克隆得到1个b HLH转录因子基因Tab HLH041,并对其表达特性进行分析,以期为研究b HLH转录因子在小麦发育中的功能奠定基础。结果表明,Tab HLH041c DNA开放阅读框(ORF)长1 179 bp,编码392个氨基酸,Tab HLH041蛋白在C端含有1个b HLH结构域;该基因包括4个外显子和3个内含子。系统发育分析发现,Tab HLH041蛋白与大麦b HLH蛋白亲缘关系最近。实时荧光定量PCR分析表明,总体上该基因的表达具有昼夜节律性,在光照条件下表达量呈下降趋势,在黑暗条件下表达量呈上升趋势。在低温条件下,Tab HLH041基因的表达呈现前期被诱导、后期被抑制的特征,处理24 h时低温的抑制作用最明显;在高盐、外源ABA和干旱处理条件下,Tab HLH041基因的表达持续受到抑制。综上,Tab HLH041基因可能参与光周期及逆境胁迫的信号转导途径。     

鸭CD8α基因启动子的分析及其转录活性

【目的】对鸭CD8α基因启动子活性区域进行分析,为鸭CD8α基因功能和表达调控机理研究提供依据。【方法】利用前期基因组步移技术获得的鸭CD8α基因的启动子区序列,制备一系列启动子缺失突变体（-625/-1 bp,-1 110/-1 bp,-1 413/-1 bp,-2 151/-1 bp）,定向亚克隆至荧光素酶表达载体pGL3-Basic 中,构建荧光素酶报告基因重组载体,采用 Lipofectamine 2000 将重组质粒瞬时转染DT40细胞,分析CD8α基因启动子系列缺失突变体在细胞内的转录活性。【结果】鸭CD8α基因 5′侧翼区长片段具有较强的启动子活性,-1110--625启动子活性最强,且-625--1和-625--1 110 bp区域均存在正调控元件。【结论】成功构建了荧光素酶报告基因真核表达载体,确定了鸭CD8α基因调控区,为进一步研究其转录调控机制奠定了基础。     

BS2基因在烟草中的功能解析

BS2蛋白来源于枯草芽孢杆菌B111,具有较强的黄萎病抗性,能抑制黄萎病菌孢子萌发并破坏其菌丝生长。BS2基因全长1 566 bp,共522个密码子,由于物种间偏爱密码子的差异,若不对其进行密码子优化而直接导入植物,会造成基因表达量低甚至不表达。按植物密码子对BS2基因进行优化合成,共优化了332个密码子;生物信息学分析得出:1～28位氨基酸为N端信号肽,成熟的BS2蛋白由224～521位氨基酸构成,是一种中性锌金属肽酶;亚细胞定位将BS2蛋白定位于细胞膜;牛津杯法检测得出转基因烟草株系的蛋白粗提液有很强的抑菌活性;未侵染黄萎病菌的对照组,T1代转基因植株与野生型长势基本一致、表型无明显差异;黄萎病菌V991侵染组,转基因烟草的表型性状明显优于野生型,且两组中转基因烟草的SOD、CAT活性和SA、ABA含量均显著高于野生型,说明BS2基因可以显著提高转基因烟草的黄萎病抗性。     

家蚕hsp24.3基因的克隆及功能研究

 【目的】对家蚕 hsp24.3基因（Bmhsp24.3）的功能进行研究,为选育抗逆境家蚕品种提供基础材料和理论依据。【方法】在对家蚕基因组进行生物信息学分析的基础上,对家蚕低分子量热激蛋白基因 Bmhsp24.3进行克隆,然后利用家蚕的芯片数据对 Bmhsp24.3基因在5龄第3天幼虫不同组织中的表达模式进行分析,并利用半定量 RT-PCR技术,分别对 Bmhsp24.3基因在正常情况下和热刺激条件下家蚕5龄幼虫不同发育时期（1～6 d）后部丝腺中的表达状况以及10个不同家蚕品种5龄第3天幼虫丝腺中的表达情况进行了检测;最后将 Bmhsp24.3基因进行原核表达,获得重组蛋白 rBmHSP24.3,并进一步对该重组蛋白的功能进行了体外验证。【结果】Bmhsp24.3基因的编码区（CDS）长度为633 bp,编码210个氨基酸,为单外显子基因;RT-PCR检测发现该基因在家蚕的体壁、脂肪体以及丝腺组织中有较高水平表达,在其它组织中的表达不明显;同对照相比,不同家蚕品种以及不同发育时期的5龄幼虫在热刺激后,其后部丝腺中的Bmhsp24.3基因的表达显著升高。经 Native-PAGE和 SDS-PAGE分析表明,在高温条件下,表达获得的重组蛋白rBmHSP24.3能与硫氰酸酶形成稳定的复合物,使底物蛋白免受热刺激胁迫而变性,从而起着分子伴侣的作用。【结论】重组蛋白 rBmHSP24.3在体外具有分子伴侣的功能,推测该蛋白在家蚕体内同样具有分子伴侣的功能,在家蚕的抗逆境适应过程中起重要作用。     

水稻顺式还原酮加双氧酶基因的表达分析及功能研究

【目的】农作物对逆境胁迫的耐受能力与产量息息相关,是作物育种要考虑的重要因素。文中对水稻顺式还原酮加双氧酶基因OsARD1进行研究,分析其表达模式,明确其在水稻应对非生物胁迫中的功能,为水稻耐旱品种的分子设计及育种提供参考依据。【方法】提取不同组织器官的总RNA,利用RT-PCR方法分析OsARD1表达的组织特异性。利用不同的非生物胁迫处理14 d大小的野生型（中花11）植株,在不同时间点提取总RNA,利用RT-PCR方法分析OsARD1表达的受诱导情况。通过农杆菌遗传转化法转化水稻愈伤组织,经过一系列分子检测后获得稳定遗传的T1代OsARD1的过量表达转基因植株,以转入空载体的野生型植株作为对照。将在营养液中正常培养的12 d大小的野生型和过表达幼苗移出营养液进行缺水处理并进行恢复试验。将催芽后的野生型和过表达转基因植株种子种在含有5% PEG6000的agar培养基中进行渗透胁迫处理,以不含PEG6000的agar培养基作为对照,观察二者的表型。【结果】组织特异性表达分析表明OsARD1主要在根及成熟的组织中表达,尤其在衰老的组织中有较高表达。非生物胁迫处理表明OsARD1的表达明显受机械损伤、高盐和渗透胁迫的诱导。获得6个独立株系的可稳定遗传的OsARD1过量表达转基因植株。对过量表达转基因植株及空载体野生型对照进行干旱胁迫处理,缺水处理5 h后,野生型植株叶片卷曲皱缩成针状表现出严重的缺水症状,但此时过表达转基因植株叶片仍处于舒展状态;缺水处理8 h后开始复水培养3 d,野生型植株的存活率仅为10%,而过表达植株存活率为80%,远远高于野生型,说明过量表达OsARD1提高了水稻对缺水的耐受能力。用PEG渗透胁迫模拟干旱胁迫处理6 d后发现,不含PEG6000对照组中野生型和过表达植株的幼苗生长情况没有明显的差别;在PEG处理组中,野生型幼苗根的生长受到严重抑制,而过表达植株幼苗根的生长受到抑制较小,根长明显长于野生型对照植株,说明过量表达OsARD1增强了水稻耐受干旱胁迫的能力。【结论】OsARD1主要在水稻根及成熟的组织中表达,并且受机械损伤、高盐和渗透胁迫的诱导。过量表达OsARD1提高了水稻抗旱性能。     

玉米大斑病菌腺苷酸环化酶基因的克隆与功能分析

【目的】获得玉米大斑病菌（Setosphaeria turcica）cAMP信号转导途径中腺苷酸环化酶基因（StAC）,利用基因敲除技术明确其在病菌致病过程中的功能。【方法】应用简并引物PCR和Genome Walking技术克隆玉米大斑病菌腺苷酸环化酶基因（StAC）DNA全长序列,并对该基因进行生物信息学分析;利用Southern blotting验证基因拷贝数;通过基因敲除技术创制StAC的缺失突变体,研究玉米大斑病菌cAMP信号转导途径中StAC的功能。【结果】StAC的DNA全长为6 816 bp,由5个外显子和4个内含子组成;ORF为6 018 bp,编码2 005个氨基酸,同源序列比对发现StAC与小麦黄斑叶枯病菌（Pyrenophora tritici-repentis）的AC基因有96%的同源性;Southern blotting证明StAC在玉米大斑病菌基因组中以单拷贝形式存在;基因功能分析表明,StAC缺失突变菌株Δstac气生菌丝灰白色,不产生分生孢子,毒素活性明显减弱,致病力下降,且在渗透胁迫条件下,菌株的抗逆能力增强,色素合成发生了改变。【结论】StAC主要调控玉米大斑病菌的产孢、致病性、高渗胁迫反应、毒素活性及色素的合成代谢。     

杨树木质部特异启动子的分离与功能分析

从三倍体毛白杨-93(Populus tomentosaCarr.)中分离得到了MDCesAP这一木质部纤维素合酶基因启动子。通过对其进行序列分析,发现A/T含量达63%,有TATA box、polyA等启动子调控元件。与PTCesAP比较,同源性较低。用MDCesAP分别替换PCAMB IA1302及PB I121中的CaMV 35S启动子,转入植物后检测目的片段的启动子功能,结果表明MDCesAP为木质部特异性启动子。