日本血吸虫SjIR3基因的克隆、表达和免疫保护力

为鉴定日本血吸虫重组蛋白SjIR(3rSjIR3)诱导小鼠抗攻击感染的免疫保护力,根据已报道的SjIR(3AY251481)的cDNA序列设计1对特异性引物,以日本血吸虫(Schistosoma japonicum)cDNA文库为模板扩增SjIR3基因,克隆到pMD-18-simple-T载体上,测序后进行生物信息学分析。然后将SjIR3基因克隆到pET-32a( )原核表达载体中构建重组质粒pET-32a( )SjIR3,转化Escherichia coli BL21,IPTG诱导表达,经SDS-PAGE及Western blot分析鉴定。结果表明SjIR3具有PS50204和SSF69572两个结构域(domain),属泛素样蛋白激酶家族,重组蛋白rSjIR3具有良好的免疫原性。动物保护试验采用昆明小鼠,结果表明rSjIR3及rSjIR3 FCA可诱导小鼠产生高水平的抗体应答及26.63%和36.38%的减虫率,以及34.79%和44.09%的减卵率。表明日本血吸虫rSjIR3可诱导小鼠产生一定的免疫保护作用。     

SjFer与GM-CSF共表达真核表达载体诱导小鼠免疫保护效果

根据GenBank中SjFer序列设计1对特异引物,以日本血吸虫(Schistosoma japonicum)cDNA文库为模板扩增SjFer基因,常规方法构建质粒pcDNA3.0/SjFer、pcDNA3.0/GM-CSF及pcDNA3.0/SjFer-GM-CSF。85只昆明小鼠分A、B、C、D和E组,分别于0、2和4周通过左后肢股四头肌注射生理盐水50μL/只,质粒50μg/只。感染前和每次免疫前采血收集血清,ELISA检测特异性IgG水平。末次免疫后2周每组随机宰杀小鼠5只无菌取脾,MTT法检测淋巴细胞增殖情况,取免疫部位的肌肉组织通过免疫组化检查重组质粒在小鼠肌细胞内表达情况。末次免疫后2周每只小鼠贴壁感染40±1条尾蚴,45d后宰杀观察减虫率和减卵率。结果表明,重组质粒能在小鼠肌细胞内表达;A、B和C组IgG水平变化不明显,D组和E组可诱导小鼠IgG水平升高,且E组高于D组。淋巴细胞转化试验结果A、B和C组OD570变化不明显,彼此无显著差异,D组和E组脾淋巴细胞转化率明显增加,与对照组差异显著,且E组OD570明显高于D组。D组和E组可诱导小鼠产生36.27%和39.22%的减虫率、36.10%和49.04%的减卵率。GM-CSF可增强体液和细胞免疫应答并显著增强pcDNA3.0/SjFer的免疫保护力。     

口蹄疫病毒3AB基因的克隆与原核表达

根据口蹄疫流行毒株设计一对包含3AB部分基因编码区的特异性引物,扩增出3AB基因550 bp的特异带,并将纯化的扩增产物克隆到pM D 18-T载体上。再用设计的酶切位点将3AB基因分别连接到两种原核表达载体上,构建了重组质粒pETCK S-3AB及pET 28a-3AB,转入BL 21菌中进行原核表达。SDS-PAGE电泳表明,3AB基因在两种表达系统中均高效表达。对表达的蛋白通过包涵体及切胶纯化的方法进行纯化,获得了高纯度的3AB蛋白。     

番茄乙烯信号转导相关基因EIN3（Le-EIL）的克隆和表达

摘要：根据拟南芥?穴Arabidopsis thaliana ?雪、烟草?穴Nicotiana tabacum ?雪EIN3基因保守区序列设计简并引物，采用RT-PCR扩增从番茄(Lycopersicon esculentum )果实中得到一个486 bp的同源片段。以此片段作为探针，从番茄果实cDNA文库中分离到一个拟南芥EIN3的同源基因的cDNA克隆,命名为Le-EIL。该克隆含有一个1 845 bp的开放阅读框，编码615个氨基酸。经同源分析，它与烟草TEIL基因的同源性为79%，与拟南芥EIN3、EIL1、EIL2和EIL3的同源性分别为59%、56%、52%、46%。Le-EIL基因表达与番茄果实的成熟及乙烯生成情况具有较强的相关性。在普通番茄果实的不同成熟时期Le-EIL基因都有表达，并且随着成熟度的增加基因表达有明显的增强，在转色期和粉红期Le-EIL基因的表达最强, 在全红期后减弱。在转反义ACS基因的转基因番茄果实中，只有开花后60 d的果实中Le-EIL基因有微弱的表达，在其它成熟时期均没有表达。     

毛白杨PtSEP3-1基因启动子的克隆分析及其表达载体构建

SEP（SEPALLATA）类基因属于花器官发育ABCDE模型中的E类基因,拟南芥中的研究表明该类基因可能具有控制花器官形态发育以及激活其它类型基因的功能,是一类花发育过程中的关键基因。因此,研究杨树SEP类基因启动子表达特性对于杨树的开花调控研究具有重要意义。本文根据毛白杨SEP3基因和毛果杨基因组序列设计引物,通过PCR获得了PtSEP3-1,基因上游2000bp的序列。序列分析结果表明该序列具有启动子的基本元件TATA—box和CAAT-box,还包含大量光响应元件ACE、BoxI和Box4等,此外还有脱落酸响应元件ABRE,赤霉素响应元件GARE—motif以及胁迫响应元件HSE、TC—richrepeats等。进一步构建了一个以PtSEP3-1启动子驱动GUS基因的植物表达载体pPtSEP3-1,protest,为该启动子的功能鉴定奠定了基础。     

桃MPK3基因的克隆、表达及生物信息学分析

为探究MPK3响应GA信号调控休眠解除的分子机理,以中油四号油桃为试验材料,通过实时荧光定量PCR发现GA诱导下MAPKs家族基因在桃芽中有不同程度的表达,其中PpMPK3响应GA正调控表现最强烈。利用MEGA6.0、MEME、GSDS、DNAMAN 6.0等软件对桃PpMPK3基因进行生物信息学分析,结果表明,PpMPK3的cDNA全长1 113 bp,编码370个氨基酸,蛋白分子量约为42.6 kD,理论等电点为5.62,属于亲水性不稳定蛋白。预测PpMPK3蛋白发生磷酸化修饰的位点有45个,不存在糖基化位点。PpMPK3蛋白的二级结构中α-螺旋占41.35%,延伸链占10.54%,无规则卷曲为48.11%。进化树分析表明,PpMPK3氨基酸序列与甜樱桃亲缘关系最近,同源性为99.73%。通过亚细胞定位发现,PpMPK3定位于细胞核。RT-PCR结果表明,PpMPK3的表达模式与休眠解除过程相一致,推测PpMPK3能够响应GA信号,促进休眠解除。本研究结果为桃设施栽培的休眠调控提供了一定的理论依据。     

鲈鱼CD3基因cDNA克隆及诱导表达

T淋巴细胞分化抗原3(cluster of differentiation 3,CD3)分子表达于T细胞表面,并通过非共价键与T细胞受体(T cell receptor,TCR)连接,参与T细胞活化.本研究采用反转录PCR(RT-PCR)和cDNA末端快速扩增(rapid amplification of cDNA ends,RACE)技术从鲈鱼(Lateolabrax japonicus)肝脏中克隆了CD3γ/δ、CD3ε和CD3ζ基因全长.结果表明,CD3γ/δ全长cDNA为1 231 bp,包括99 bp的5'非翻译区(untranslated regions,UTR),583 bp的3'-UTR和549 bp的开放阅读框(open reading frame,ORF),共编码182个氨基酸;CD3ε全长cDNA为2 145 bp,包括186 bp的5'-UTR,1 434 bp的3'-UTR和525 bp的ORF,共编码174个氨基酸;CD3ζ全长1 281 bp,包括56 bp的5'-UTR,772 bp的3'-UTR和453 bp的ORF,共编码150个氨基酸.氨基酸序列分析发现,CD3γ/δ和CD3ε分子结构相似,均含有1个免疫球蛋白样结构的胞外区、1个跨膜区和含1个免疫受体酪氨酸激活基序(Immunoreceptor tyrosine-based activation motif,ITAM)的胞浆区,而CD3ζ含有1个仅由5个氨基酸组成的胞外区、1个跨膜区和含3个ITAM序列的胞浆区.分析DNA和cDNA序列发现,CD3γ/δ的ORF区由6个外显子和5个内含子组成,CD3ε的ORF区由5个外显子和4个内含子组成.qRT-PCR结果表明,CD3γ/δ、CD3ε和CD3ζ在鳃、脾、头肾、肠中表达较高,在脂肪、肝、眼、脑等组织中表达较少.当腹腔注射哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)3 h后,脾组织的3种CD3分子均显著上调(P＜0.05),在肠和头肾也有显著上调(P＜0.05),表明细菌感染会增加CD3的表达.研究结果为进一步研究鱼类CD3在病原菌感染免疫中的分子机制提供基础资料.     

水稻草矮病毒基因组vRNA3 NS3基因的克隆、序列分析及原核表达

摘要: 根据RGSV(rice grassy stunt virus )-IR分离物的RNA3序列设计引物，采用RT-PCR技术扩增出RGSV-SX分离物的NS3基因，并进行序列测定及原核表达。结果表明，NS3基因由588个核苷酸组成，编码22.9 kD蛋白。构建了可在E. coli DH5α中表达的质粒pGTNS3，经IPTG诱导，SDS-PAGE分离纯化得到分子量为49.0 kD的GST-NS3融合蛋白，并制备抗血清。应用Western blot 分析寄主水稻(Oryza sativa)和介体昆虫体内NS3基因表达产物，仅在感病水稻植株中检测到NS3蛋白，而在提纯病毒、介体昆虫体内则未检测到。     

嗜水气单胞菌外膜蛋白（OMP）的原核表达及其对BALB/c小鼠的免疫保护研究

为确定嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila,Ah)AS1.927株外膜蛋白(OMP)的原核表达产物是否具有抗原性及其对小鼠的免疫保护力.本研究根据GenBank上嗜水气单胞菌外膜蛋白ompA基因序列(GenBank登录号:AF146597)设计1对引物,克隆出ompA全长基因1020 bp(GenBank登录号:EU309491),经Sal Ⅰ和Xhol Ⅰ双酶切后连接pET-30a(+),转化大肠杆菌(Escherichia cDli)BL21,IPTG诱导表达,并进行SDS-PAGE及Westernblot分析鉴定.结果显示重组基因工程菌E.coli[pET-30a-ompA]表达的融合蛋白分子量约为40.7kD,可以被鼠抗嗜水气单胞菌外膜蛋白抗血清识别.将重组基因工程菌Ecoli[pET-30a-om-pA]口服免疫BALB/c小鼠(Mus mussulus);末次免疫1周后用放射免疫分析小鼠肠粘膜分泌型免疫球蛋白A(sIgA)水平,检测结果揭示,该重组基因工程菌能提高sIgA的分泌(P<0.05);同时在小鼠血清中测出特异性抗体IgG(P<0.05).末次免疫2周后用100 LD50的Ah AS1.927(3.3×105> cfu/mL)腹腔注射攻击小鼠,口服重组菌对小鼠的相对免疫保护力(relative percent survival,RPS)为75%,表明重组基因工程菌可诱导小鼠对AhAS1.927产生一定的免疫保护作用.     

鹅生长激素基因的克隆和组织表达

根据鸡的生长激素基因(GH)序列设计引物对鹅总RNA进行RT-PCR反应，将扩增片段进行克隆和测序。结果获得了包括从ATG开头到TGA结尾的651bp的鹅GH基因编码区序列。鹅与鸡的GH基因的编码区高度保守，同源性达92％，演译成氨基酸后同源性达96％；与人和鼠GH基因编码区序列同源性分别为63．81％和74．31％，演绎成氨基酸后同源性分别为52．51％和72．81％。同时用RT-PCR和Northern-blot对鹅12种组织表达差异分析表明鹅GH基因只在垂体和下丘脑中表达。在心脏、肺、肝脏、小肠、胃、腿肌、脾、肾脏、脂肪和睾丸中都不表达。     

含CSFV T细胞表位的猪细小病毒样颗粒的表达及小鼠免疫试验

将纯化的重组子pM-VP2-E290阳性质粒利用杆状病毒表达系统进行表达,表达产物应用SDS-PAGE、Western blot和Dot ELISA进行分析,确定所表达的蛋白分子量大小约为67kD,且具有天然蛋白的抗原特异性。应用免疫电镜对表达产物进行观察,可见到细小病毒样颗粒。病毒样颗粒在无免疫佐剂参与的情况下,免疫6～8周龄的BALB/c小鼠,同时设猪细小病毒(Porcine parvovirus,PPV)的灭活疫苗免疫组及磷酸盐缓冲液(PBS)接种组作为参比对照,检测小鼠的细胞免疫和体液免疫学指标。结果表明,表达蛋白所形成的细小病毒样颗粒,不仅能诱导小鼠机体产生抗猪瘟病毒的特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)反应,还能刺激小鼠产生高效价的抗猪细小病毒的特异性抗体,而且机体所产生的抗体效价显著高于灭活疫苗对照组。     

鸡caveolin-3 cDNA克隆与表达分析

用RT-PCR法克隆了鸡(Gallus gallus)caveolin-3cDNA。测序结果显示，克隆的鸡caveolin-3 cDNA与GenBank已发表的序列一致。序列相似性比较表明，鸡与大鼠、小鼠和人的caveolin-3cDNA有78％左右的相似性，而氨基酸序列相似性约为80％。对鸡caveolin-3的组织特异性和体内不同发育阶段的Northern blot分析结果表明，鸡的caveolin-3为横纹肌特异性表达．同时在1～10周的不同发育阶段中没有表现出明显的变化。     

长白猪Plin3、Plin5基因克隆及表达规律研究

脂滴包被蛋白3(Plin3)和脂滴包被蛋白5(Plin5)是细胞内脂滴包被蛋白(PAT)家族的成员,在脂滴合成方面具有重要作用。为探究Plin3和Plin5在长白猪中的序列和表达特征,利用PCR技术扩增该基因,采用生物信息学分析两者的序列特征,并利用实时荧光定量PCR技术检测其在长白猪11个不同组织中的表达特征。结果表明,长白猪Plin3序列全长1 403 bp,Plin5全长1 397 bp,两种蛋白二级结构均以α-螺旋为主,无规则卷曲次之,不存在跨膜结构,无信号肽结构,有多个磷酸化位点。检测两种基因在不同组织中的表达水平发现,Plin3在长白猪的11个组织中均有表达,其中在脾脏中的相对表达量显著高于其他组织(P<0.05),肝脏次之;Plin5在脂肪组织中的相对表达量显著高于其他组织(P<0.05),而在大肠和小肠中不表达。本研究为进一步探究长白猪Plin3和Plin5在脂质代谢中的作用机制提供了理论依据。     

番茄乙烯信号转导相关基因剧EIN3（Le-EIL）的克隆和表达

根据拟南芥（Arabidopsis thaliana)、烟草(Nicotiana tabacum)EIN3基因保守区序列设计简并引物，采用RT—PCR扩增从番茄(Lycopersicon esculentum)果实中得到一个486bp的同源片段。以此片段作为探针，从番茄果实cDNA文库中分离到一个拟南芥EIN3的同源基因的cDNA克隆，命名为Le-EIL。该克隆含有一个1845bp的开放阅读框，编码615个氨基酸。经同源分析，它与烟草TEIL基因的同源性为79％，与拟南芥EIN3,EIL2和EIL3的同源性分别为59％、56％、52％、46％。Le-EIL基因表达与番茄果实的成熟及乙烯生成情况具有较强的相关性。在普通番茄果实的不同成熟时期Le—EIL基因都有表达，并且随着成熟度的增加基因表达有明显的增强，在转色期和粉红期Le-EIL基因的表达最强，在全红期后减弱。在转反义ACS基因的转基因番茄果实中，只有开花后60d的果实中Le-EIL基因有微弱的表达，在其它成熟时期均没有表达。     

生长抑素基因疫苗质粒pcS/2SS的构建、表达及免疫*

为构建高免疫原性的生长抑素（somatostatin，SS）DNA疫苗，将SS基因插入到pcS／SS中乙肝表面抗原（HBsAg）S基因第112-113氨基酸残基密码子之间，构建含2拷贝SS的融合表达质粒pcS／2SS。酶切和测序鉴定表明，重组质粒pcS／2SS构建成功。脂质体包裹法将pcS／2SS转染HeLa细胞，ELISA检测表达产物的SS免疫反应原性。结果表明，融合目的基因在HeLa细胞获得表达，S／2SS融合蛋白具有比S／SS融合蛋白更强的SS抗原抗体反应性。将pcS／2SS免疫6只大鼠后，2／3的大鼠产生了抗SS抗体，结果证明，所构建的质粒pcS／2SS可以表达生长抑素，表达产物具有免疫原性。