猪捷申病毒HB株的分离与全基因序列分析

为分析河北省某规模化猪场猪捷申病毒(PTV)的遗传变异和进化关系,作者成功分离到PTV HB株,对其进行了毒力测定和动物回归试验,设计引物进行了全基因序列测定,并与国内外42株PTV全基因序列进行了同源性比较。结果表明猪捷申病毒HB株病毒滴度为10-6.4 TCID50.mL-1,健康仔猪接毒28d后均出现明显猪捷申病症状,该毒株全基因组序列长度为7 090bp。系统进化树分析表明,猪捷申病毒HB株(JQ664746)属于PTV-8型血清型,和国内分离的PTV-jilin/2003株(GQ293092)同源性最高,从而为进一步研究该毒株的遗传变异提供参考。     

一株猪捷申病毒全基因组序列测定及分析

根据Gen Bank已发表的猪捷申病毒(porcine teschovirus,PTV)13种血清型全基因组序列,分析其保守区域并设计10对特异性引物。从临床腹泻病料中提取核酸,经RT-PCR扩增目的片段,分别对这些片段进行克隆、序列测定、拼接,最终获得一株猪捷申病毒全基因组序列,命名为PT-GD。主要结构蛋白VP1进化分析表明,该毒株与PTV12型CC25、YZ119的VP1核苷酸序列同源性分别为80.1%和79.7%,与其他血清型毒株进化距离相对较远,表明该毒株为猪捷申病毒血清型12型。该病毒全基因序列的测定及血清型鉴定为进一步深入研究猪捷申病毒在我国的遗传变异及其生物学特性提供了依据。     

猪捷申病毒4型的分离鉴定及VP1基因序列分析

为了对2021年7月份四川省某猪场送检的疑似感染猪捷申病毒(Poreine teschovirus, PTV)的猪腹泻粪便样品进行鉴定,试验将送检的病料接种ST细胞进行病毒分离,采用血凝试验、理化特性、RT-PCR进行鉴定,测序序列基于VP1基因构建系统发育树并进行同源性分析。结果表明：从疑似病料中分离出1株RNA病毒,ST细胞感染24 h后出现明显的细胞病变,该病毒不能凝集猪红细胞,耐酸,对氯仿及胰蛋白酶有一定的抵抗能力,对热敏感,二价阳离子(如Mg²⁺)可提高分离毒株对高温环境的抵抗力;结合RT-PCR和VP1基因比对分析可知该毒株为PTV,命名为Sichuan2021;经测定含量为1×10^6.75 TCID₅₀/mL;分离毒株Sichuan2021与PTV-4毒株位于同一分支,且与参考毒株10BJ02(JQ975417)和SH1(KJ881010)的亲缘关系最近,核苷酸相似性分别为92.8%和92.5%。说明分离毒株Sichuan2021为PTV-4。     

猪捷申病毒SD株的分离与鉴定

从山东某疑似感染猪捷申病毒(Porcine teschovirus,PTV)的猪群中分离到1株病毒。经一步法RT-PCR扩增得到PTV部分VP1基因序列。经序列测定,与Gen Bank上的毒株序列进行比对,并做了该病毒的致病性试验。结果显示,该分离株与参照的猪捷申病毒相似性为100%,并对猪具有一定的致病性。本试验成功分离获得1株PTV山东地方流行毒株,命名为SD株。     

一株猪捷申病毒的分离与鉴定

北京地区某猪场猪群疑似感染猪捷申病毒(porcine teschovirus,PTV),为了分离与鉴定该病毒,从采集的脑组织样品中分离出病毒,并从病毒中提取总RNA,根据已报道的引物序列,经RT-PCR扩增得到部分编码主要结构蛋白的VP1基因和高度保守的5'-UTR区基因序列,将这些基因克隆到pEASY-Blunt载体中,经序列测定,与GenBank上的毒株序列进行比对。试验结果表明,分离的毒株与猪捷申病毒同源性为95%~100%。本试验成功分离获得一株猪捷申病毒北京地方流行毒株,命名为 10BJ02株。     

鸭甲肝病毒VP1基因克隆及序列分析

通过PCR技术,从自行分离的鸭甲肝病毒JS株基因组中扩增出病毒衣壳蛋白VP1完整基因片段,并对该片段进行序列测定及分析。结果显示JS-VP1与DHAV-A的VP1基因序列酸核苷酸同源性在62.0%~64.4%之间,与DHAV-B的VP1基因序列酸核苷酸同源性在63.6%~63.8%之间,与DHAV-C的VP1基因序列酸核苷酸同源性在92.3%~98.5%之间,分析表明JS株为鸭甲肝病毒基因C型,血清型分型为韩国新型。进化树表明JS株与SD02株的亲缘关系较进,进一步说明VP1基因的核苷酸序列是DHAV基因组中的高度可变区,可作为DHAV基因型研究的标记,分离毒株为DHAV的防治及疫苗的设计奠定了基础。     

鸭肝炎病毒分子流行病学分析

为了解我国鸭病毒性肝炎(DH)的流行情况,本研究用标准DH病毒(DHV)Ⅰ型(DHV-1)抗血清和新型DHV(N-DHV)抗血清对国内分离的7株DHV进行了血清中和试验。结果表明,PLK株和YB3株为DHV-1;YB1、YB2、YB5、HY2和HY3株为N-DHV。同时,对国内分离的9株病毒的抗原相关VP1基因进行RT-PCR扩增和测序,对VP1基因的核苷酸与推导的氨基酸序列分析的结果表明,3株DHV-1的氨基酸序列同源性为95%左右,6株N-DHV的氨基酸同源性为98%左右;DHV-1分离株与N-DHV分离株间氨基酸同源性为72%～77%。参照同属微RNA病毒的人肠病毒的血清型分型标准,通过对DHV VP1基因序列同源性比较,判定9株病毒的血清型。依据VP1基因序列同源性进行的血清型分型结果与根据抗原性鉴定进行的血清型分型结果一致。同血清型病毒株间的VP1基因变异很小,表明DHV的抗原性稳定。同型不同毒株间VP1基因的差异可以导致病毒在致病力、细胞感染能力等方面的差异。研究结果表明,目前我国存在DHV-1和N-DHV两种独立的血清型,但尚未见血清亚型的流行。     

猪轮状病毒地方株JL94株VP4基因的克隆与序列分析

根据GenBank已发表的猪轮状病毒VP4基因保守序列,利用Oligo4.1软件设计一对引物扩增猪轮状病毒地方株JL94株VP4全基因序列;并将扩增产物与pMD-18T载体连接,经鉴定后将重组质粒进行测序并与国外分离株CRW-8株、BEN-307株进行核苷酸和氨基酸序列同源性比较分析.结果表明:JL94株和CRW-8株、BEN-307株VP4全基因片段核苷酸同源性和氨基酸同源性分别为96.98%和98.05%,说明JL94株与CRW-8株、BEN-307株属于同一VP4血清型.本研究为进一步研制诊断性抗原和病毒重组活载体疫苗奠定了基础.     

鸭肝炎病毒Js株VP1基因克隆及序列分析

摘要：通过PCR技术，从自行分离的鸭肝炎病毒Js株基因组中扩增出病毒衣壳蛋白VP1完整基因片段，并对该片段进行序列测定及分析。结果显示Js—VP1与DHV—A的VP1基因序列酸核苷酸同源性在92．7％～99．7％之间，与DHV—B的VP1基因序列酸核苷酸同源性在58．5％～58．7％之间，与DHV—C的VP1基因序列酸核苷酸同源性在61．6％-63．9％之间，分析表明Js株为鸭肝炎病毒基因A型，血清型分型为血清1型。进化树表明Js株与E53、X、R、AV2111株的亲缘关系较进。     

猪嵴病毒VP0基因的克隆与序列分析

本研究根据猪嵴病毒(porcine kobuvirus,PKV)VP0基因序列特征设计特异性扩增引物,采用RT-PCR方法扩增猪嵴病毒VP0基因全长编码区。将特异性扩增目的片段克隆后进行序列测定,将结果进行拼接后获得猪嵴病毒VP0基因全长并进行相关生物信息学分析。所扩增的目的片段编码有完整的VP0基因开放阅读框,全长为1 098 bp,编码有366个氨基酸,理论等电点为6.71,理论分子质量为38.489 ku,不稳定系数为34.65,最大疏水指数为2.622,最小疏水指数为-2.122。将获得的VP0基因和GenBank中的猪嵴病毒代表株VP0基因序列进行核苷酸同源性比对和遗传进化分析,其与HNXX-4核苷酸同源性最高,为89.1%,与S-1-HUN核苷酸同源性最低,为81.1%。从遗传进化上看,猪嵴病毒VP0基因在遗传进化上呈两个独立的基因亚群,猪嵴病毒中国分离株在两个遗传基因亚群上均有分布。     

果子狸源呼肠孤病毒MPC/04株全基因组序列测定与分析

为获得果子狸源呼肠孤病毒(MRV)Masked Palm Civet/China/Liu/2004(MPC/04)株的全基因序列,本研究根据GenBank中登录的哺乳动物MRV基因序列设计了22对引物,运用RT-PCR技术对该毒株的各个基因片段进行了扩增和同源性分析,并绘制系统发育进化树。结果显示该毒株L1、L2、M1和S3基因核苷酸序列与SARS病人体内分离到的SARS病毒T2/BYD1/human/Song/2006(T2S)株同源性较高,该病毒株L3、M2、M3、S1、S2和S4基因核苷酸序列与病猪体内分离到的MRV株SC-A/pig/Zeng/2006(SC-A)同源性较高,系统发育进化树同样表明各个病毒株的不同基因节段均具有不同的进化过程,推测MRV不同病毒株之间存在重配现象。通过MPC/04株S1基因同源性分析和核苷酸系统发育进化树分析,表明该病毒株S1基因与MRV血清3型的S1基因同源性较高,而与其它血清型的同源性较低,因此初步判断该病毒株血清型为血清3型。     

检测猪捷申病毒抗体的间接免疫荧光方法的建立与初步应用

为建立检测猪捷申病毒(PTV)抗体的方法,本研究利用PTV-8 Jilin/2003株为杭原,建立了检All PTV杭体的的间接免疫荧光技术(IFA)方法.该方法工作浓度分别是:一抗最适稀释度为1:10:FITC标记二抗最适稀释度为1:100;二杭中伊文氏兰最适稀释度为1:30 000.敏感性试验、特异性试验表明该杭原板可以检出包含PTV-8型和1型在内的的所有PTV阳性血清,方法敏感、特异.与SN符合率94.0.用该方法对黑龙江、山东、天津和河南等地的1 500份临床血清样品进行检测,阳性检出率为55.8,表明我国猪群中PTV的感染已经非常普遍.该方法做为PTV的血清学诊断新技术,为开展PTV分子流行病学调查莫定了基础.     

番鸭细小病毒XX株VP2基因的克隆和序列分析

根据国内外已发表的番鸭细小病毒(MDPV)FM株和GD株基因序列,应用DNAstar分子生物学软件设计1对引物,应用PCR技术扩增MDPV XX株的结构蛋白基因VP2全基因片段。将扩增得到的VP2全基因克隆到PGEM-T easy载体上,经菌液PCR鉴定后的重组子进行序列测定。结果表明,MDPV XX株基因大小为1764bp,编码587个氨基酸,其基因序列与国内外发表的FM株、GD株核苷酸序列同源性分别为98.4%和99.8%,而与同属的小鹅瘟病毒B株核苷酸同源性仅为78.2%。可见编码番鸭细小病毒结构蛋白的VP2基因较保守,且和同属的小鹅瘟病毒明显不同,这也是该病毒目前只有一个血清型的分子基础。     

云南猪群中猪捷申病毒感染分子生物学诊断

猪捷申病是由猪捷申病毒(Porcine teschovirus,PTV)感染引起的猪的一种病毒性传染病。文章根据Gen Bank收录的PTV基因序列设计套式引物,建立检测PTV的套式RT-PCR诊断方法;从云南省某猪场疑似猪捷申病的病料中检测出PTV核酸阳性,产物经克隆测序,与Gen Bank收录的PTV毒株序列比对,结果表明该扩增序列与PTV同源性为99%~95%,首次在云南确诊了PTV感染存在。     

鸭肝炎病毒的分离与鉴定

1999-2008年从山东、河南、浙江、江苏、广西、山西、江西、广东、福建和辽宁等地有典型鸭病毒性肝炎症状的病死雏鸭中共分离得到22株病毒。用鸭肝炎病毒（DHV）Ⅰ型（DHV-1）抗血清和新型DHV （N-DHV）抗血清对分离的22株病毒进行血清中和试验;对22株病毒的抗原相关VP1基因进行RT-PCR扩增和测序,然后对VP1基因的核苷酸与推导的氨基酸序列进行分析。结果表明,目前我国存在DHV-1和N-DHV两种血清型。其中分离到的12株为DHV-1,10株为N-DHV。依据VP1基因序列同源性进行的血清型分型结果与根据抗原性鉴定进行的血清型分型结果一致。12株DHV-1的氨基酸序列同源性为95%左右,10株N-DHV的氨基酸同源性为98%左右;DHV-1分离株与N-DHV分离株间氨基酸同源性为72%-77%。同血清型病毒株间的VP1基因变异很小,表明DHV的抗原性稳定。     

番鸭细小病毒NS和VP基因的克隆及序列分析

为进一步了解番鸭细小病毒(MDPV)基因的遗传变异特征，本试验采用分段PCR扩增法获得了2个MDPV安徽分离株(AH1901和AH1902)基因组NS和VP全长基因，并与GenBank数据库中的20个水禽细小病毒基因组序列进行了比对。序列分析显示，克隆的MDPV基因均包括完整的NS和VP基因，分别为1 884 bp和2 199 bp,VP基因核苷酸序列变异程度相对较高，而NS基因则较为保守；进化分析显示，安徽分离株AH1901和AH1902位于同一分支，二者与国内分离的MDPV毒株ZJ-JH-2013基因遗传距离最近，可能来源于同一毒株，与MDPV疫苗株P1及国外分离毒株FM基因遗传距离则较远；安徽分离株AH1901和AH1902的NS基因序列同源性为99.8%,VP基因序列一致。两者的NS、VP基因序列与分离株ZJ-JH-2013的同源性最高，与重组型毒株SAAS-SHNH及安徽分离株AH1401同源性也在99.5%以上；与疫苗株P1、国外分离株FM同源性则较低，其中VP基因仅为88.9%、89.3%。本试验结果表明近年国内的MDPV分离株同源性均较高，但仍存在一定程度的基因变异，增...     

番鸭细小病毒安徽分离株结构蛋白基因的克隆及序列分析

为研究番鸭细小病毒(MDPV)安徽分离株的遗传变异特征,通过PCR扩增获得了MDPV结构蛋白(VP)基因全长序列AH-MDPV-VP,并将该序列与GenBank中登录的12条MDPV和鹅细小病毒(GPV)VP基因序列进行比对。结果显示,AH-MDPV-VP基因全长2 199bp,包括完整的VP1、VP2和VP3蛋白编码区。MDPV与GPV的VP基因部分序列一致,但具有明显的差异。进化分析显示,MDPV安徽分离株与基因重组型MDPV上海分离株SAAS-SHNH为同一分支,亲缘关系较近。同源性分析显示二者核苷酸序列同源性最高,为99.9%,且AH-MDPV-VP与GPV毒株SHFX1201的序列同源性也有89.5%。此外安徽分离株与其他MDPV的VP1、VP2和VP3基因同源性有逐步下降的趋势,而与GPV则相反呈上升趋势。进一步显示MDPV安徽分离株与基因重组型MDPV上海分离株SAAS-SHNH相似,可能为MDPV和GPV基因重组型水禽细小病毒。     

猪捷申病毒Swine/CH/IMH/03株免疫原性的研究

为确定猪捷申病毒(Porcine Teschovirus,PTV)Swine/CH/IMH/03株免疫原性,本研究将该PTV分离株灭活后分别与氢氧化铝佐剂和Montanide ISA 50V2佐剂混合,制成油佐剂疫苗,并采用不同免疫程序接种实验猪后对病毒抗体进行检测。抗体检测结果表明:PTV Swine/CH/IMH/03分离株能够诱导实验动物产生较高抗体水平,并显著高于对照组;与氢氧化铝佐剂混合制成的佐剂疫苗免疫效果优于Montanide ISA 50V2佐剂;而且一次免疫组与二次免疫组没有明显差异。通过PTV Swine/CH/IMH/03株免疫原性的研究,为后续猪捷申病的预防工作提供技术支持。     

猪传染性胃肠炎病毒LJ-12株的分离与鉴定

对黑龙江省某猪场腹泻仔猪的粪便进行病毒分离,获得1株疑似猪传染性胃肠炎病毒(TGEV),命名为LJ-12株。在原代猪肾细胞上盲传8代后细胞出现病变,用TGEV S基因的1段特异性引物进行RT-PCR方法检测,扩增出与预期结果相一致的约480 bp的目的基因片段;核酸序列测定结果表明该段基因与TGEV TH-98株的核苷酸同源性为98.5%,氨基酸同源性为98.8%;并通过间接免疫荧光试验,超薄切片电镜观察等方法确定该分离毒株为猪传染性胃肠炎病毒。     

鸭传染性腔上囊病毒VP2基因的克隆与序列分析

应用RT-PCR法对分离于当地典型发病鸭群的鸭传染性腔上囊病毒(IBDV)YL997株进行了VP2基因的克隆与序列分析，并和相关毒株进行了比较。结果表明，YL997株与STC株的核苷酸和氨基酸同源性只有92．5％和91．8％，与超强毒株UK661的核苷酸和氨基酸同源性均为97．6％，而与当地鸡群中分离的超强毒株HN942的核苷酸和氨基酸同源性则高达98．1％和98．4%，该毒株的VP2基因序列完全具备了超强毒株的主要特征。