河南省部分地区猪流行性腹泻病毒ORF3和N基因的克隆及其遗传进化分析

为探究河南省猪流行性腹泻病毒部分毒株的遗传进化情况,采用RT-PCR对2017年2月至2018年1月在河南省部分地区猪场收集到的25份PEDV阳性病料进行ORF3和N基因的扩增,并对其进行克隆、序列比对及遗传进化分析。结果显示,PEDV毒株的ORF3基因序列是由675个核苷酸组成的,与经典毒株CV777之间核苷酸及氨基酸同源性分别为95.2%~97.5%和95.1%~96.9%。N基因之间的核苷酸与氨基酸同源性分别为96.2%~100%和93.8%~99.8%;与经典毒株CV777核苷酸与氨基酸的同源性分别为94.7%~95.8%和93.2%~96.8%。河南部分地区PEDV流行毒株与经典毒株CV777不在同一分支,说明猪场暴发猪流行性腹泻与免疫接种疫苗后依旧难以控制的原因,可能与大多数PEDV河南流行株发生变异有关。     

江苏地区猪流行性腹泻流行病学调查及病原S基因序列分析

为探究江苏省内猪场猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)的流行和遗传变异情况,采集江苏省13个地级市规模猪场和屠宰场健康猪群的鼻拭子和肛拭子样品,通过RT-PCR方法检测PEDV,并对部分阳性样品进行S基因序列扩增、测序及遗传进化分析。结果显示：259份猪鼻拭子样品中,PEDV阳性检出率为10.42%(27/259);178份猪肛拭子样品中,PEDV阳性检出率为9.55%(17/178)。选取的8株PEDV代表株的核苷酸序列同源性在99.2%～100%之间,氨基酸序列同源性在95.2%～97.1%之间,与国内流行毒株SD-M、JS2008的同源性最高,核苷酸序列同源性达到97%以上;遗传进化分析显示,8株PEDV代表株属于同一群,与经典毒株CV777、DR13亲缘关系较近。本研究初步明确了江苏地区健康猪群中猪流行性腹泻流行状况和PEDV遗传演化特点,为有效防控猪流行性腹泻提供参考。     

猪流行性腹泻病毒山西分离株M基因序列分析

为了研究山西地区猪流行性腹泻病毒M基因的遗传变异情况,从2014年10月~2015年4月山西地区11个地市收集的猪流行性腹泻病毒(PEDV)病料中扩增到4株PEDV的M基因,并进行序列比对及遗传分析。结果表明,4株PEDV的M基因与CV777毒株比较,部分核苷酸及氨基酸发生改变。4株PEDV的M基因核苷酸和氨基酸的同源性分别为99.6%~100%和99.1%~99.6%,与参考毒株的核苷酸和氨基酸的同源性分别为96.3%~99.9%和96.0%~99.1%。遗传进化分析显示,4株PEDV与2010-2013年中国分离株(BJ2010、HB/BD、HB/FN、HLJ-2012、GDHZ-1202、SHQP/YM/2013)、2008年泰国KU04RB08株亲缘关系较近;与2株泰国株(M_NIAH2013_95和M_NIAH1795_04)、2株欧洲株(CV777和Br1/87)和2006年中国分离株LZC亲缘关系较远。     

2011—2012年四川省猪流行性腹泻病毒的遗传变异分析

为分析猪流行性腹泻病毒(PEDV)的遗传变异情况,本试验从四川省11个市19个不同地区发生仔猪腹泻疾病的猪场采集的病料中分别扩增到8个PEDV(SC-8)ORF3和部分S基因序列,将其进行比对和遗传演化分析。结果显示,SC-8的ORF3基因包含674~676个碱基,编码224个氨基酸,与GenBank中登录的国内外地方流行株的核苷酸序列同源性为95.7%~99.9%,氨基酸序列同源性为98.2%~100%,与标准毒株CV777相比,核苷酸序列和氨基酸序列除存在点突变现象外,部分序列还存在核苷酸的插入和缺失性突变;部分S基因扩增长度为981bp,编码327个氨基酸,与国内外参考毒株的核苷酸序列同源性为93.2%~99.5%,氨基酸序列同源性为93.5%~100%,与标准毒株CV777相比,四川-绵阳(SCMY)分离株在92~93nt之间存在1个核苷酸插入,在2~29aa之间也有18个氨基酸发生了突变;系统进化树分析表明,8株PEDV ORF3基因均与野毒株亲缘关系较近,而与弱毒疫苗株亲缘关系较远;SC-8的部分S基因均与国内地方流行毒株亲缘关系较近,而与国外分离株的亲缘关系较远。     

广东省猪流行性腹泻病毒ORF3和M基因的克隆与序列分析

为了研究广东省猪流行性腹泻病毒(PEDV)毒株ORF3和M基因的变异情况,试验于2012—2013年从广东省不同地区猪场采集56份腹泻病仔猪的小肠,通过PCR扩增得到8株PEDV的ORF3和M基因,并进行序列比对及遗传分析。结果表明:8株PEDV的ORF3基因与参考毒株核苷酸的同源性为94.7%~99.9%,其中GD-DG毒株与LZC毒株比较核苷酸的同源性最低(94.7%),GD-HY毒株与中国TX2011毒株比较核苷酸的同源性最高(99.9%);8株PEDV的M基因与参考毒株核苷酸的同源性为95.7%~99.9%,其中GD-MM毒株与泰国M_NIAH380_98毒株比较核苷酸的同源性最低(95.7%),GD-HZ毒株与韩国CPF299、PFF188、PFF285毒株及泰国KU01CB08毒株比较核苷酸的同源性最高(99.9%)。说明近年来广东省流行的PEDV毒株以变异株为主,与经典株CV777的亲缘关系较远。     

2015-2018年广东省猪流行性腹泻病毒M基因的遗传进化分析

本试验通过对22株采集于2015-2018年广东省内猪流行性腹泻病毒(PEDV)流行株的M基因进行克隆和测序,并将测序结果与NCBI中PEDV参考株M基因进行同源性分析和构建系统进化树,从而了解广东省PEDV流行株的近年来遗传变异情况。结果显示,22株PEDV流行株间核苷酸序列同源性为97.5%～100.0%,与华南地区参考株M基因核苷酸序列同源性为97.7%～99.9%,与国内较早分离株CH/S和经典毒株CV777同源性较低,分别为97.5%～98.1%、97.7%～98.2%。PEDV M基因遗传进化分析显示,22株广东PEDV流行株的同源性较高,亲缘关系紧密,此外,22株广东PEDV流行株与大部分代表性毒株、疫苗株亲缘关系较远,如国内早期分离株CH/S、经典毒株CV777、韩国株KRPEDV-9-Vaccine、泰国株M_NIAH100541_08、日本株JMe2、英国株Brl/87等。试验结果表明,广东省当前的PEDV流行毒株存在基因变异并形成独特进化分支。     

广东部分地区猪流行性腹泻病毒流行病学调查

本试验对临床上猪腹泻相关的病原进行了检测并对广东部分地区的猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)展开了分子流行病学的调查。对采集自广东地区的14个规模化猪场的19份腹泻病料进行了RT-PCR检测,并对检出的12株PEDV的COE、ORF3、M以及N基因进行测序和遗传进化分析。结果显示,临床的腹泻案列多为混合感染所致,检出的主要病原有猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、PEDV、猪嵴病毒(PKV)、猪A群轮状病毒(PoRV)以及牛流行性腹泻病毒(BVDV)。与参考毒株CV777相比12株PEDV的COE、ORF3、M、N基因均存在不同程度、不同位点的氨基酸突变。COE、ORF3、M以及N基因的遗传进化分析显示:广东地区的12株PEDV毒株属于同一个分支彼此间的亲缘关系较近但与CV777疫苗毒株以及2012年之前广东地区分离的毒株CHGD-01、CH-GDGZ-2012、GD-1以及GD-A等毒株分属于2个不同的分支,亲缘关系相对较远。结果表明,广东地区现阶段流行的PEDV优势毒株与2012年之前相比可能已经发生了改变,CV777疫苗毒株的免疫效果如何还有待于通过更多的临床实验来验证。     

我国部分省份猪流行性腹泻病毒M基因的克隆测序及遗传进化分析

为了解我国部分省份猪流行性腹泻病毒(PEDV)的遗传进化情况,试验采用RT-PCR方法对2014—2017年采集的源自河南、河北、山西、山东、甘肃、湖北、江西等地区不同猪场的98份腹泻样品进行了PEDV检测,并对25份PEDV阳性样品进行M基因的克隆与测序和遗传进化分析。结果表明:25株M基因序列长度均为618 bp;25株M基因序列间核苷酸同源性为98.2%~100%,其编码的氨基酸序列同源性为97.8%~99.6%,与经典毒株CV777及国内外流行毒株核苷酸同源性为97.7%~98.6%,氨基酸序列的同源性分别为97.8%~98.7%;25株M基因序列与国内外早期分离株(如CV777、CH/S等代表毒株)不在一个进化分支上,与近年来分离株处在一个进化分支上。说明PEDV M基因一直处于变异进化过程中。     

流行性腹泻病毒5株猪安徽流行株S基因的克隆与序列分析

为了解安徽省猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)的遗传变异,试验对5株PEDV安徽流行毒株S基因进行RT-PCR扩增、序列测定和分析。结果显示,5株PEDV安徽流行毒株S基因的全长均为4 161 bp,编码1 386个氨基酸,核苷酸同源性为98.7%~99.8%,它们与国内外PEDV参考毒株核苷酸同源性在93.6%~99.8%之间;进化树分析显示,5株流行毒株与CV777、attenuated DR13、LZC和CHS亲缘关系较远,与2011年后国内外PEDV分离株亲缘关系较近。研究结果可为PEDV的防控和疫苗研制提供参考和依据。     

广东省猪流行性腹泻病毒S1基因的克隆与序列分析

为研究广东省猪流行性腹泻病毒S1基因的变异情况,于2012-2013年间从广东省不同地区猪场采集56份腹泻病仔猪样本。通过PCR方法扩增到12个样本的PEDV的S1基因序列,并进行序列比对及遗传分析。结果 12个样本PEDV的S1基因序列之间的核苷酸同源性为91.1%~99.6%,氨基酸的同源性为88.5%~99.1%。12个样本PEDV的S1基因序列与国内参考毒株核苷酸的同源性为91.0%~99.9%,氨基酸的同源性为88.5%~99.7%。与国外参考毒株核苷酸的同源性为89.0%~99.7%,氨基酸的同源性为86.5%~99.4%。与经典毒株CV777的核苷酸同源性为91.0%~100.0%,氨基酸的同源性为88.3%~99.9%。其中,仅GD-HY的S1基因与CV777的同源性达100.0%,其他同源性较低。表明近年广东省的PEDV流行毒株以变异株为主,与疫苗株(CV777)的亲缘关系较远。     

陕西省部分地区猪流行性腹泻病毒S、M和N基因的遗传变异分析

为了解陕西省部分地区猪流行性腹泻病毒(PEDV)的遗传和变异情况,采集陕西省部分地区规模化猪场的5份疑似PEDV感染的猪小肠内容物,进行PEDV S、M和N基因的RT-PCR扩增,并对扩增产物进行序列测定和遗传变异分析。结果表明,5份病料均能扩增出PEDV S、M和N基因,5株病毒分别命名为SXSL、SX-BJ、SX-YL、SX-WN和SX-HZ株。序列分析表明,5株毒株之间的S、M和N基因核苷酸序列的同源性分别为96.7%~99.8%、98.4%~100%和97.2%~99.9%;氨基酸序列的同源性分别为97.4%~99.9%、98.2%~100%和98.2%~100%。该5株病毒与中国疫苗株CV777的S、M和N基因核苷酸序列的同源性分别为93.9%~99.8%、98.1%~100%和95.3%~99.9%,氨基酸序列的同源性为93.6%~99.9%、96.2%~100%和98.2%~100%。遗传进化分析结果显示,5个陕西分离株的S基因与中国疫苗株CV777亲缘关系较远,与近年来中国株、日本株以及韩国株亲缘关系较近。SX-SL株、SX-BJ株和SX-YL株的M和N基因与中国疫苗株CV777亲缘关系较近,且与中国株CHGD-01亲缘关系密切。SX-WN株和SX-HZ株的M和N基因与中国疫苗株CV777亲缘关系较远。该5株病毒的S基因以及SX-WN株和SX-HZ株的M基因和N基因变异程度较大,而SX-SL株、SX-BJ株和SX-YL株三个流行株均与中国株CHGD-01亲缘关系密切,并且与近年在陕西省流行的PEDV也不完全相同。     

猪流行性腹泻病毒山西分离株S基因遗传变异分析

为分析山西地区猪流行性腹泻病毒（PEDV）的遗传变异情况,试验利用RT-PCR方法对2014-2015年山西省疑似猪流行性腹泻的阳性病料进行克隆和测序,获得4个S基因片段,并对其基因序列和推导的氨基酸序列与国内外毒株进行比对分析。序列分析结果显示,4株PEDV山西分离株的S基因与CV777 vaccine相比,在170~171 bp之间插入12个核苷酸,在401~402、454~455 bp之间均插入3个核苷酸,在461~468 bp之间缺失6个核苷酸。4株PEDV山西分离株S基因之间核苷酸和氨基酸同源性分别为99.2%~99.8%和98.6%~99.7%,与2011-2015年中国流行毒株、CV777 vaccine、attenuated DR13、CV777的核苷酸同源性分别95.0%~98.5%、93.2%~93.6%、93.2%~93.7%、93.7%~94.4%,氨基酸同源性分别为96.2%~98.9%、91.9%~92.6%、92.1%~92.9%、92.9%~94.0%。遗传进化树分析结果表明,PEDV S基因分为3个群,4株PEDV山西分离株属于第一群,与2010年以后国内流行毒株（除AH-M、SQ2014）的亲缘关系较近,与2010年以前中国流行毒株、2个日本株、7个韩国株、2个疫苗株的亲缘关系较远。研究结果提示山西省流行的PEDV发生较明显的变异,需研发新的疫苗来控制PEDV的暴发。     

猪流行性腹泻病毒河南株ORF3基因分子流行病学分析

为了解猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)河南株的起源和遗传变异,本试验对2014年8月—2015年5月,来自河南省16个规模猪场仔猪表现为严重腹泻、食欲下降和脱水等临床特征的22份病料样品,利用RT-PCR方法,扩增PEDVORF3基因,回收PCR产物克隆至pMD18-T载体,并进行测序分析。结果显示,22份病料样品均能扩增出PEDVORF3基因,其序列长度均为849bp,包含一个完整阅读框(675bp),编码224个氨基酸残基。22个河南株之间核苷酸同源性为95.9%~100%,与欧洲经典毒株CV777同源性介于97.1%~97.9%,存在8个位点发生相同的氨基酸置换,与Truncated CV777株同源性介于94.8%~95.4%。基因遗传进化树分析表明,PEDV毒株可分为2大群,河南株属于第Ⅱ群,整体独立成支,与河南往年流行株、国内分离株、日本、美国及韩国毒株亲缘关系较近,而与CV777株、Truncated CV777株亲缘关系较远。结果表明PEDV河南株ORF3基因存在变异,为PEDVORF3基因的蛋白功能研究和河南省PED的防控提供技术支持。     

我国华东地区猪流行性腹泻病毒ORF3基因的遗传变异分析

为了确定猪流行性腹泻病毒的流行特点及变异规律,本研究对我国华东地区分离到的14株PEDV的ORF3基因进行了克隆和序列测定,并与国内外代表毒株的ORF3基因进行了比较分析。结果表明:我国华东地区检测的PEDV流行毒株的ORF3基因之间的同源性为92.4%~100%,与经典毒株CV777同源性为92.0%~96.4%,与PEDV变异株的同源性为95.1%~100%。根据ORF3基因的遗传进化分析,分离的14个PEDV毒株与CV777的遗传进化距离较远,与PEDV变异株的遗传进化距离较近,表明我国PEDV流行毒株以变异株为主,较以往的疫苗株CV777发生了较大的变异,因此需要开发新的疫苗,制定更具针对性的防控措施。     

猪流行性腹泻病毒变异株的鉴定和分子特征分析

为查明山东省某猪场流行性腹泻的病因,本研究对该猪场病死仔猪进行病理学检查,并对采集的7份仔猪腹泻样品进行猪流行性腹泻病毒(PEDV)的套式RT-PCR检测。病理学检查发现病猪的肠道肿胀、变薄、出血,肠绒毛皱缩、变短、边缘粗糙。套式RT-PCR结果显示,7份样品均为PEDV阳性;对其中两份PEDV阳性病料进行S基因扩增,分析其遗传变异,结果显示这两株PEDV野毒株的S基因与参考疫苗株CV777的同源性为92.3%~92.4%,与其他野毒株的同源性为96.6%~98.6%。PEDV的遗传进化树结果显示,PEDV分为两个进化分支G1和G2,G1包括CV777等疫苗株及中国和韩国早期的部分毒株,G2则是PEDV变异株为主的分支,包括本试验分离的野毒株及近年来美国、中国等国的野毒株,这些毒株都存在两个插入突变和1个缺失突变。结果表明,变异株已成为PEDV的流行优势毒株,且这些变异位点有可能成为鉴定PEDV变异株的分子特征。     

2011年河南省猪流行性腹泻病毒流行株的遗传进化分析

2011年前后,猪流行性腹泻(PED)在河南省爆发流行.为探明该病再次流行的原因,本研究对2011年收集的7份来自河南省不同地区PED病毒(PEDV)流行病毒株M基因进行RT-PCR扩增、克隆、测序及分析.序列分析显示,7株PEDV河南流行株M基因部分核苷酸及氨基酸发生变异,不同于以往参考病毒株.基于M基因的遗传进化分析显示,PEDV河南流行株和参考株可以分为3个群(G1、G2、G3),7株PEDV河南流行株均属于第3群,与2010年中国BJ2010株、2007年韩国PFF188株及2008年泰国08RB03株亲缘关系密切,而与欧洲病毒株(CV777、Br1/87)、1995年和2004年泰国株(M_NIAH1795_04、M_NIAH2013_95)及2006年中国LZC株亲缘关系较远.结果表明,2011年在中国河南省及其它地区流行的PEDV是一个新的基因型,可能起源于韩国和泰国.     

6株猪流行性腹泻病毒贵州株S基因序列分析

为了解贵州省猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）S基因的特点,掌握其遗传变异情况,本试验设计3对特异性引物对6株PEDV贵州株S基因进行全基因RT-PCR扩增、克隆及序列测定;应用生物信息学软件将6株PEDV贵州流行株与参考毒株进行同源性与系统进化分析。结果显示,6株PEDV贵州流行株S基因的全基因长为4 161 bp,编码1 387个氨基酸,与国内外PEDV参考毒株核苷酸同源性在93.3%~98.8%之间,氨基酸同源性在91.6%~98.9%之间;进化树分析结果显示,6株流行毒株与美国毒株、越南毒株和山东毒株亲缘关系较近;与CV777株、LZC、Brl、83P-5亲缘关系较远。结果表明,PEDV贵州地方流行毒株S基因编码的氨基酸存在一定程度变化,近年来呈现变异趋势。本研究可为贵州省PEDV的防控提供一定的理论依据。     

我国部分省份猪流行性腹泻病毒S基因分子特征及遗传演化分析

猪流行性腹泻在我国的发病率和死亡率居高不下,给养猪业造成了重大损失。为进一步了解我国猪流行性腹泻流行毒株的遗传变异规律,试验对河南、江西、福建、辽宁、浙江、湖北6个省份的19个PEDV地方流行株的S基因进行了RT-PCR扩增,并对其进行了序列比对和遗传演化分析,旨在为疫病的防治和疫苗株的选择提供参考和依据。试验设计了3对引物,对采集自6个省份13个疑似PEDV发病猪场的19份仔猪小肠及其内容物样品进行了RT-PCR扩增,通过产物回收、转化和测序,经生物软件拼接,成功获得其S基因全序列。它们的S基因全长由4 158~4 161 nt组成,其中仅JX1、JX2毒株的长度为4 158 nt,其余毒株的长度均为4 161 nt。通过与GenBank中已发表的国内外毒株CV777、DR13等61株PEDV S基因序列进行比对发现,19个毒株与经典株CV777的同源性为93.8%~94.1%,其彼此之间的同源性为97.7%~100%。基因推导的氨基酸序列分析表明,试验所获得的19株流行毒株中,仅JX1和JX2两个毒株由1 386 aa构成,而其他毒株均由1 387 aa组成,19个毒株S蛋白氨基酸与经典株CV777的同源性为92.8%~93.4%,其彼此之间的同源性为97.7%~99.9%,且均存在点突变、氨基酸插入和缺失现象。S基因进化树分析表明,PEDV毒株被分成了2个大群,试验获得的19个毒株均处于G1群中,但与我国其他分离株处于G1大群中的不同分支中,且与处在G2群中的经典株CV777、韩国弱毒株DR13和日本弱毒株83P-5等毒株的亲缘关系较远。说明PEDV S基因一直处于变异进化过程中。     

我国部分省份猪流行性腹泻的流行病学监测

[目的]为摸清我国猪群流行性腹泻的感染状况,[方法]从2011年底到2014年3月,对云南、广西等29个省份开展了猪群腹泻疫情流行病学调查,采集、收集了发生腹泻症状的发病猪群样品（新鲜粪便、肠道组织等）,进行了猪流行性腹泻病毒（PEDV）、猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）等多种病原检测。[结果]在7021个调查猪场中,出现腹泻的阳性猪场4060个（57.83%）。在收集的1383份腹泻样品中,利用RT-PCR方法检测到PEDV阳性样本686份（49.58%）,其中腹泻发病猪样品中PEDV的检出率为67.82%,675份组织样品共检测出PEDV阳性样本86份（12.75%）。[结论]这表明我国猪场PEDV的感染十分普遍。对S基因进行分子流行病学分析发现,我国PEDV流行毒株与已有PEDV毒株可以分为2个完全不同的进化分支G1和G2,G1以CV777和DR13等疫苗株和早期毒株为主,G2则以2011-2013年流行毒株为主,流行毒株之间的同源性为97.8%-100%,与疫苗株CV777之间的同源性为94.3%-94.5%。     

7株猪流行性腹泻病毒M基因的克隆与分析

采用RT-PCR方法对2012-2014年收集的7份四川规模化猪场送检猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)的阳性临床样品中病毒M基因进行扩增,纯化回收目的片段后连接到pMD19-T载体,经序列测定与GenBank收录的30条PEDV参考毒株的序列进行核苷酸和氨基酸同源性分析、构建系统进化树。结果显示,7株PEDV四川株间核苷酸以及氨基酸同源性分别高达98.4%~99.9%和97.4%~99.1%,与参考株之间的核苷酸以及氨基酸同源性分别是95.7%~99.9%和95.2%~99.6%,PEDV四川株与国内外近3年的PEDV毒株均在系统进化树上的同一分支,亲缘关系较近,而经典毒株CV777与国内早期PEDV株处于另外一个分支。表明目前流行的PEDV M基因与往年相比出现一定的变异,但是仍相对稳定。