葛根素对热应激致牛睾丸支持细胞氧化损伤的保护作用

葛根素(Pue)是从中药野葛或甘葛藤根中提取的黄酮类化合物,有明显的抗氧化功能。Pue是否有对热应激时牛睾丸支持细胞(SCs)保护作用尚不清楚。本研究采用42℃热应激1 h,然后34℃恢复6 h。用CCK-8检测细胞存活率;用Hoechst33258检测细胞凋亡;用分光光度法检测细胞丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)和过氧化氢酶(CAT)的变化,以及Western-Blot检测HSP70蛋白表达。结果显示,热应激后细胞存活率下降,细胞发生凋亡,产生氧化损伤。葛根素和维生素E可以极显著降低热应激时细胞MDA含量,显著增加SOD、CAT和GSH-Px活力。Pue与维生素E组相比无显著性差异。此外,葛根素可显著增加受热应激SCs中HSP70蛋白的表达。上述结果表明,葛根素能减少热应激下SCs的氧化损伤,其机制可能与提高抗氧化酶活性及增加热休克蛋白HSP70的表达有关。     

热休克蛋白70上调表达对热应激猪小肠上皮细胞凋亡的影响

本试验以谷氨酰胺作为热休克蛋白70(HSP70)诱导剂,从细胞凋亡线粒体信号转导途径探讨HSP70对热应激猪小肠上皮细胞(IPEC-J2)凋亡相关因子的影响。试验以体外培养的猪小肠上皮细胞为模型,分别加入不同浓度(1、2、4、6、8、10 mmol/L)谷氨酰胺的培养基中培养24 h,提取总RNA和总蛋白,用实时荧光定量PCR和Western blot检测HSP70 mRNA和蛋白的相对表达量,筛选出谷氨酰胺诱导HSP70表达的最佳浓度。取对数生长期的细胞分为3组,分别为对照组(Con组,37℃培养12 h)、热应激组(Hs组,42℃培养12 h)、谷氨酰胺组(Gln组,6 mmol/L谷氨酰胺、42℃培养12 h)。采用Annexin V/PI双染法检测细胞凋亡水平,实时荧光定量PCR和Western blot分别检测HSP70、凋亡酶激活因子-1(Apaf-1)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶-9(Caspase-9)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶-3(Caspase-3)、B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)的mRNA和蛋白的相对表达量。结果表明:谷氨酰胺对HSP70上调表达呈先上升后下降的趋势,6 mmol/L的谷氨酰胺诱导时HSP70 mRNA和蛋白相对表达量最高,显著高于其他浓度(P<0.05),作为后续试验中Gln组的诱导条件。与Con组相比,Hs组细胞凋亡率极显著增加(P<0.01),HSP70、Apaf-1、Caspase-3、Caspase-9 mRNA和蛋白的相对表达量极显著升高(P<0.01),而Bcl-2 mRNA和蛋白的相对表达量极显著降低(P<0.01)。与Hs组相比,Gln组细胞凋亡率极显著降低(P<0.01),但仍极显著高于Con组(P<0.01);Gln组HSP70 mRNA和蛋白的相对表达量极显著升高(P<0.01);Gln组Apaf-1、Caspase-3、Caspase-9 mRNA和蛋白的相对表达量极显著降低(P<0.01),但极显著高于Con组(P<0.01);Gln组Bcl-2 mRNA和蛋白的相对表达量极显著升高(P<0.01),但极显著低于Con组(P<0.01)。由此可见,上调HSP70的表达可有效缓解热应激导致的猪小肠上皮细胞凋亡。     

HSP72在热应激小鼠囊胚中的表达及其作用

将体外培养的小鼠囊胚分别施以38℃温和热应激和40℃强烈热应激处理1、2和3 h,然后在37℃正常培养条件下分别恢复3、2和1 h,用体视显微镜观察囊胚孵出率以及经38℃和40℃诱导热应激后囊胚的孵出率,用Western-blot技术检测小鼠囊胚HSP72的表达。结果,38℃热应激处理2 h时,HSP72表达量达到最高水平,与对照组差异显著;40℃热应激处理3 h时,HSP72表达量达到最高水平,与对照组差异不显著;38℃热诱导2 h囊胚孵出率最高,与40℃强烈热应激处理2 h组差异显著。结果表明,热诱导组囊胚孵出率与38℃热应激组囊胚HSP72的表达量呈正相关。     

热应激对小鼠胚胎细胞HSP70表达和超微结构的影响

本研究旨在确定体外培养的小鼠胚胎细胞合成HSP70的时期,研究热应激对该阶段胚胎细胞超微结构的影响.将合子和体外发育至2-细胞、4-细胞、8～16-细胞及囊胚阶段的胚胎分别进行37、39和41℃的热应激处理,用免疫荧光细胞化学法检测胚胎细胞中HSP70的诱导表达;将体外培养至早期囊胚的小鼠胚胎分别施以39℃2h和41℃2h处理,分别在热应激后0和2h时收集胚胎,制作超薄切片,用电子显微镜观察胚胎细胞的超微结构变化.在各细胞期胚胎中,37℃组胚胎HSP70表达阴性(一);39℃组胚胎,从8～16-细胞开始呈现弱表达(+),囊胚呈阳性表达(++);41℃组的胚胎从4-细胞开始呈现弱阳性表达(+),8～16-细胞胚胎和囊胚呈阳性表达(++).39和41℃热应激处理的小鼠早期囊胚超微结构和对照组均发生明显的变化,但经37℃恢复培养2h后,39℃组胚胎的各细胞器超微结构恢复正常,而41℃组胚胎未能恢复.结果表明,小鼠胚胎从4-细胞期有HSP70的诱导合成,在囊胚期诱导合成最多;热应激使胚胎亚细胞结构出现退行性变化,轻度退行性变化是可逆的.     

热应激对小鼠附植前早期胚胎HSP70的诱导表达

选择超数排卵后怀孕昆明小鼠75只,以注射人绒毛膜促性腺激素(hCG)后的胚胎发育阶段为标准,分别在合子、2细胞、4细胞、8~16细胞和囊胚期对孕鼠进行了37℃、39℃、41℃和43℃热应激4 h。热应激后取胚,用免疫荧光细胞化学法检验胚胎热休克蛋白70(HSP70)的诱导表达。结果表明,HSP70在4细胞以上胚胎内呈阳性表达,相对高温时其表达量增加,囊胚时最显著。可见,附植前早期胚胎HSP70的热诱导表达与细胞期和温度密切相关。     

预热诱导HSP70表达对高温引致胚胎损伤的保护作用

用37℃2 h条件下体外培养的小鼠囊胚作为对照,将体外培养至囊胚期的小鼠胚胎分别施以38℃2 h、39℃2 h、40℃2 h的预热应激处理,以观察热休克蛋白70(HSP70)表达对高温所致胚胎损伤的影响。用W estern-b lot技术检测小鼠胚胎内HSP70的表达,然后分别将预热胚胎和对照组胚胎置于42℃高温下处理3 h,用台盼兰拒染法检测胚胎存活率,判断HSP70表达对胚胎抵抗高温损伤有无保护作用。结果显示:39℃热应激处理2 h后,HSP70表达量达到最高水平,与对照组差异极显著(P<0.01);38℃热应激处理2 h和40℃热应激处理2 h组HSP70表达与对照组相比均有显著(P<0.05)增加;预热诱导组胚胎存活率明显(P<0.05)高于对照组,其中以39℃2 h组最高。提示HSP70的高表达可以抵抗胚胎对外界不良因素的刺激。     

褪黑素对LPS诱导的犊牛睾丸支持细胞氧化应激和凋亡的影响

为了探究犊牛睾丸支持细胞(SCs)在血睾屏障形成过程中受到细菌感染的影响以及褪黑素的缓解作用。本试验使用CCK-8试剂盒测定SCs活力,活性氧(ROS)试剂盒、谷胱甘肽(GSH)试剂盒和超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒分别测量ROS、GSH的表达和SOD活性,Western blot和RT-PCR分析Nfr2、HO-1、p53、Caspase3和Connexin43表达量。结果表明,5 mg/L LPS可以激活Nfr2/HO-1信号通路和p53信号转导,从而显著上调ROS和Caspase3的表达量,显著下调SOD和GSH的活性和表达,造成SCs氧化应激和细胞凋亡,进而下调Connexin43蛋白的表达,降低细胞活力。加入50μmol/L褪黑素后,可以显著抑制激活Nfr2/HO-1信号通路和p53信号转导,从而显著下调ROS和Caspase3的表达量,显著上调SOD和GSH的活性和表达,缓解LPS造成SCs氧化应激和细胞凋亡,进而恢复Connexin43蛋白的表达和细胞活力。结果说明,褪黑素可以缓解LPS诱导SCs的氧化应激和细胞凋亡,对Connexin43蛋白表达有保护作用。     

DNA甲基化参与LPS诱导的牛子宫内膜细胞IL-6和IL-8表达调控

利用DNA甲基化抑制剂等试验分析了DNA甲基化在细菌脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导的牛子宫内膜细胞IL-6和IL-8表达上调中的作用。首先用1mg/L LPS处理牛子宫内膜细胞24h,研究其对细胞IL-6、IL-8和TLR4(Toll-like receptor 4,TLR4)、DNA甲基化酶(DNMT1、DNMT3A、DNMT3B)和DNA甲基化结合蛋白2(methyl CpG-binding protein 2,MeCP2)表达的作用,随后用1,2,5,10μmol/L 5Aza-dc分别预处理牛子宫内膜细胞0,24,48,72h,荧光定量PCR技术测定IL-6和IL-8表达。结果显示:1mg/L LPS处理可显著上调牛子宫内膜细胞IL-6、IL-8、TLR4、DNMT1、DNMT3A、DNMT3B和MeCP2的表达,5Aza-dc预处理可显著提高LPS诱导的牛子宫内膜细胞IL-6和IL-8表达上调,且其作用效果存在浓度和时间依赖效应。结果表明:LPS通过抑制DNA甲基化诱导牛子宫内膜细胞IL-6和IL-8mRNA表达上调。     

热休克蛋白70在热应激鸡原代心肌细胞中的表达与定位

为研究热应激后鸡原代心肌细胞中热休克蛋白70(HSP70)的表达量及其定位的变化,试验将体外培养的鸡原代心肌细胞分为6组,其中1组作为对照(未进行热应激处理),其余5组于42℃热应激处理0.5,1,2,4,8 h,Western-blot检测HSP70在6组鸡原代心肌细胞中的相对表达量,间接免疫荧光法测定热应激处理1 h后HSP70在鸡原代心肌细胞中的定位。结果表明:热应激后HSP70在鸡原代心肌细胞中的表达量呈先上升后下降趋势;与对照相比,热应激8 h后鸡原代心肌细胞的HSP70表达量显著降低(P0.05);HSP70在对照与热应激1小时时的心肌细胞中均有表达,且在细胞浆与细胞核中均有分布,但主要分布于细胞浆中。说明热应激对HSP70在鸡原代细胞中的表达产生影响,但对其在细胞中的分布无明显影响。     

热应激对小鼠囊胚中HSP72表达及对孵出率影响的研究

将体外培养的小鼠囊胚分别施以40℃和38℃热休克处理1h、2h和3h,然后在37℃条件下分别恢复3h、2h和1h后,利用Westernblot技术检测小鼠囊胚HSP72的表达,同时观察囊胚的热敏性,以明确热应激对小鼠囊胚中HSP72表达及对孵出率影响。结果显示,38℃及40℃热应激组均有HSP72的表达,38℃组2h达到最高水平,与对照组相比差异显著(P<0.05),然后表达量随热应激时间延长而降低;40℃组3h达到最高水平,与对照组相比差异不显著(P>0.05)。38℃及40℃热应激组囊胚孵出率均随着热应激时间的延长而降低。结果表明,轻度、短时间热应激既可使小鼠囊胚HSP72表达;热应激能够降低小鼠囊胚的孵出率。