PCR检测鸡减蛋综合征病毒

根据已报道的鸡减蛋综合征（ＥＤＳ－７６）病毒ＤＮＡ序列，设计合成了１对引物，建立了ＥＤＳ－７６病毒的双温式聚合酶链反应（ＰＣＲ）诊断方法。该方法对ＥＤＳ－７６病毒长春株、河南株和广东株扩增结果均为阳性；而对致死鸡胚孤儿病毒（ＣＥＬＯＶ）、鸡病毒性关节炎病毒（ＶＡＶ）、鸡传染性支气管炎病毒（ＩＢＶ）、鸡传染性法氏囊病病毒（ＩＢＤＶ）和鸡新城疫病毒（ＮＤＶ）的扩增结果均为阴性。可检测ＥＤＳ－７６病毒ＤＮＡ为０．３×１０－４ｐｇ。结果表明该方法特异且敏感。此外，将常规的三温式ＰＣＲ的操作规程改为双温式，反应体积由常规５０～１００μＬ改为２０μＬ，使其更加快速、简便、经济     

抗EDS—76病毒单克隆抗体的研究：Ⅰ.分泌抗ESD—76病毒单克隆抗体细…

建立了５株分泌抗ＥＤＳ－７６病毒的单克隆抗体细胞株，分别是Ｃ４＾１３，Ｃ１１＾１３，Ｃ１１＾１５，Ｅ７＾１５和Ｆ９＾１３，各株分泌抗体的能力均稳定，且者是抗ＥＤＳ－７６病毒的特异性抗体，不与其它多种禽病毒发生交叉反应。其中Ｃ４＾１３，Ｃ１１＾１５分泌的抗体是ＩｇＧ２ａ，Ｃ１１＾１３分泌的抗体是ＩｇＧ１。这５株细胞株所分泌的抗体都有较强的中和活性。     

上海地区蛋鸡产蛋下降综合征感染情况调查

八十年代中期,广东省已发现有 EDS76 HI 抗体阳性的鸡群,不仅在进口鸡中发现,而且在其他一些杂交品种鸡群里也检查出 HI 阳性鸡.上海地区过去一直未有此病的报道,但近年来有些鸡场的蛋鸡出现开产后达不到产蛋高峰或产蛋率突然下降,临床上很象 EDS 76,因此,我们对上海郊区的一些大、中型鸡场的蛋鸡进行了 EDS76感染情况的调查.一、材料与方法(一)HI 抗原的制备1.毒株:鸭腺病毒 WPD·V205,由华南农业大学兽医系细胞室赠予。2.繁殖:经尿囊腔接种鸭胚,37℃孵化.弃去     

产蛋下降综合征（EDS－76）病毒DNA酶切图谱分析

选用ＥｃｏＲＩ、ＰｓｔⅠ、ＰｖｕⅡ、ＨｉｎｄⅢ、ＢｇｌⅠ和ＢｇｌⅡ６种限制性内切酶，对国内４株ＥＤＳ－７６病毒鸡源分离株和国外标准株ＡＶ－１２７及１株鹅源腺病毒的ＤＮＡ进行酶切图谱的比较，结果发现４种鸡源分离株与ＡＶ－１２７株用上述６种酶切的片段数分别为４、８、１０、１０、６和７条。各酶切图形、片段大小亦十分相似，表明均为ＥＤＳ－７６病毒。ＥｃｏＲＩ－ＨｉｎｄⅢ和ＰｓｔＩ－ＥｃｏＲＩ的双酶切也得到同样结果。鹅源分离株的酶切片段数分别为６、７、９、７、４和１０条，酶切图形和片段大小均与ＡＶ－１２７有很大不同，表明该分离株可能为１株血清型相同而基因组不同的ＥＤＳ－７６鹅腺病毒。     

禽流感病毒单克隆抗体的研制

用低致病性禽流感病毒H9N2亚型(Mildly Pathogenic Avian Influenza Virus,MPAIV)F株全病毒作为抗原,制备能够用于建立ELISA检测AIV的特异性单抗;以间接ELISA和HI试验筛选出阳性克隆,并经有限稀释法三次亚克隆之后,共获得三株稳定分泌特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株,在Dot-ELISA试验中三株单抗中的两株与13个AIV H9N2国内分离株、4个AIV H5N1国内分离株都反应,而与10个NDV国内分离株,IBV、IBDV、EDSV-76、SPF鸡胚尿囊液不反应.一株与13个AIV H9N2国内分离株反应,与4个AIV H5N1分离株、NDV、IBV、IBDV、EDSV-76、SPF鸡胚尿囊液不反应.     

应用单克隆抗体建立夹心ELISA检测EDS—76病毒

利用单克隆抗体建立夹心ＥＬＩＳＡ方法，对人工感染鸡带毒和排毒检测，表明第３天血、脾、输卵管带毒，第８天时各脏器几乎都带毒，第１４天仅输卵管、肾、肝检出病毒。第６天时鸡蛋带毒，泄殖腔排毒；直至１４天时仍带毒和排毒。夹心ＥＬＩＳＡ与ＨＡ、鸭胚接种相比较，在３６份样品中，ＨＡ检出１９份。ＥＬＩＳＡ检出２４份，鸭胚接种检出１２份。病毒在鸭胚和细胞上复制动态表明，２４小时后血凝试验和夹心ＥＬＩＳＡ都能检出病毒，随着时间延长，ＨＡ价和ＥＬＩＳＡ价（ＰＮ）继续上升，８４小时至９６小时到最高峰。在２４小时时，无血凝性，但ＥＬＩＳＡ检测为阳性，因此夹心ＥＬＩＳＡ可用于病毒检测。单抗夹心ＥＬＩＳＡ的建立为生产上提供了一种更简单、快速、灵敏、应用广泛的病毒检测方法。     

抗猪流行性腹泻病毒单克隆抗体的研制及其特性鉴定

以新生乳猪增殖猪流行性腹泻病毒（ＰＥＤＶ）,通过蔗糖密度梯度离心将其纯化,获得较为完整的病毒颗粒。病毒ＥＬＩＳＡ效价为１∶３×１０５,蛋白含量为３．９６ｇ／Ｌ。将提纯的ＰＥＤＶ免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠,取免疫鼠脾细胞与ＳＰ２／０骨髓瘤细胞进行融合,融合率为９５．６％。用间接ＥＬＩＳＡ进行筛选,共检出３８个阳性孔,阳性率为２８．８％。对其中１５个阳性值较高的孔进行３次再克隆,阳性率达１００％,最后获得１５株稳定分泌特异性抗ＰＥＤＶ单抗（ＭｃＡｂ）的杂交瘤细胞。ＥＬＩＳＡ阻断试验与交叉试验证明,其分泌的抗体具有高度特异性。腹水和细胞培养上清的ＥＬＩＳＡ效价分别为１∶１０３～１∶１０６和１∶１２８～１∶５１２。经鉴定,１５株ＭｃＡｂ的分子类型均为ＩｇＧ,均无免疫沉淀特性。杂交瘤细胞的染色体数目为９０～１１０,平均９５。尤为重要的是,这些杂交瘤细胞所分泌的抗体,有的对ＰＥＤＶ具有中和作用,能够阻断病毒对猪只的侵害作用。     

H5亚型禽流感病毒血凝素单克隆抗体的制备及鉴定

以禽流感病毒A/Chicken/Hubei/327/2004(H5N1)免疫Balb/c小鼠,将免疫鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,用血凝抑制试验筛选细胞培养上清,采用有限稀释法对阳性孔进行克隆,3次克隆后获得7株能稳定分泌抗H5亚型禽流感病毒血凝素单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为1C4,1D4,1E12,2E11,4C12,4G2和5E12。细胞培养上清HI效价为24~27,腹水HI效价可达210~218。所有单抗与禽流感H7和H9亚型标准血凝抗原,新城疫病毒和鸡传染性支气管炎病毒无交叉反应。在细胞上的中和试验显示具有较高的中和效价,获得的单克隆抗体可在禽流感流行病学的监测中发挥重要作用。     

赤羽病毒单克隆抗体的研制及鉴定

用纯化的赤羽病毒（akabane virus,AKAV）免疫Balb/c小鼠,取小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞SP2/0融合,经间接ELISA筛选和3次有限稀释法克隆,得到2株能稳定分泌抗赤羽病毒单克隆抗体（McAb）的杂交瘤细胞株,分别命名为AKAV McAb 3A株和2C株。ELISA试验和中和试验结果表明,本研究制备的2株McAb均具有良好的特异性,为AKAV阳性,杂交瘤细胞培养上清液抗体的效价分别为1∶640和1∶320,腹水的效价分别为1∶256000和1∶128000,亲和常数（Ka）分别为1.16×10^-9和6.31×10^-8 mol/L,3A株的相对亲和力大于2 C株,具有病毒中和活性,中和效价分别为1∶64和1∶32,其IgG亚类为IgG1,轻链的亚型均为kappa型,2株细胞冻存3次复苏后仍能稳定分泌抗体,表明AKAV McAb制备成功,为赤羽病快速诊断方法的研究奠定了基础。     

猪塞尼卡谷病毒单克隆抗体的制备及鉴定

【目的】纯化猪塞尼卡谷病毒(Seneca Valley virus, SVV)SVV-CH-HB2016毒株,并制备其结构蛋白VP1、VP2和VP3的单克隆抗体。【方法】以蔗糖密度梯度离心法纯化的SVV-CH-HB2016病毒颗粒作为抗原,免疫BALB/c小鼠,取脾细胞与骨髓瘤细胞(SP2/0)进行细胞融合。通过间接免疫荧光试验(IFA)结合间接ELISA筛选阳性细胞株,制备能特异性分泌针对结构蛋白的杂交瘤细胞株。采用Western blotting和IFA方法分别检测单克隆抗体与重组表达蛋白及天然结构蛋白的反应性,并对单克隆抗体的病毒中和保护效果进行测定。利用空斑试验和实时荧光定量PCR方法探究中和性单克隆抗体对SVV-CH-HB2016毒株吸附过程的影响,最后用抗体相加试验来分析14株单克隆抗体的抗原表位。【结果】在蔗糖密度梯度为5%～45%(W/V)时获得了纯度较好、浓度较高的SVV-CH-HB2016毒株结构蛋白,免疫小鼠血清抗体效价均达到了1∶12 800,成功制备了17株能稳定分泌特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株。经验证14株单克隆抗体能与重组结构蛋白发生Western bl...     

新城疫病毒HN蛋白单克隆抗体的制备

为制备新城疫病毒HN蛋白的单克隆抗体,本研究采用新城疫病毒CK/AH/100/2010作为免疫原,免疫6~8周龄BALB/c小鼠,3次免疫后取脾细胞与SP2/0融合,用血凝抑制(HI)方法检测筛选,具有HI活性的单抗有6株:PX1-PX6。6株单抗与AIV、EDS等其它具有血凝活性的病毒的交叉血凝抑制试验结果表明,6株单抗具有良好的特异性。间接免疫荧光试验结果表明,PX1、PX3可与新城疫病毒CK/GD/263/2010 HN抗原发生特异性反应,而其它单抗不反应。     

犬瘟热病毒单克隆抗体的制备及鉴定

将纯化的犬瘟热病毒(CDV)分别与弗氏完全佐荆(CFA)和弗氏不完全佐剂(IFA)乳化制备的乳化抗原作为免疫原,以有限稀释法和间接ELISA法进行单克隆抗体的筛选,从而获得了3株稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株2F7、3G2、5E3.亚型鉴定结果显示,2F7为IgG2a型,3G2为IgGl,5E3为IgGM.用2F7制...     

抗氨苄青霉素单克隆抗体的制备及初步鉴定

利用碳化二亚胺(EDC)法将氨苄青 霉素(Ampicillin,AMP)与匙孔嘁血蓝蛋白 (mcKLH)偶联制备免疫原免疫Balb/c小鼠, 应用杂交瘤技术将免疫鼠脾细胞与小鼠骨髓 瘤细胞(SP2/0)融合,建立分泌氨苄青霉素单 克隆抗体的杂交瘤细胞株。同上方法将氨苄 青霉素连接到阳离子化的牛血清白蛋白(cB SA)上制备检测抗原,对AMP KLH偶联物 免疫小鼠产生的抗体进行检测。通过对杂交 瘤细胞培养上清的检测、鉴定,筛选出8株高 亲和力的杂交瘤细胞株,用其制备的腹水 ELISA效价达到2×106,纯化后的单克隆抗 体(McAb)可以应用于氨苄青霉素残留的快 速检测。     

三聚氰胺单克隆抗体的制备与鉴定

本实验利用三聚氰胺类似物与血蓝蛋白、卵清蛋白偶联制备免疫抗原和包被抗原,免疫Balb/c小鼠,采用B细胞杂交瘤技术,经免疫、融合、筛选和克隆等,得到了抗三聚氰胺单克隆抗体。该抗体亚类为IgG1,制备的单克隆抗体腹水效果评价达10-7,与其他三聚氰胺结构类似物无交叉反应。三聚氰胺单克隆抗体的获得为进一步研发三聚氰胺药物残留检测试剂盒的研制奠定了基础。     

狂犬病病毒糖蛋白单克隆抗体的制备

用狂犬病病毒BD06株脑毒免疫BALB/c小鼠,制备G蛋白单克隆抗体。将灭活的BD06脑毒免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与骨髓瘤细胞(SP2/0)进行融合,通过间接ELISA法和荧光抗体病毒中和试验法进行4轮筛选,获得6F12、1B12共2株具有中和活性的糖蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞。通过Western blotting分析和直接免疫荧光检测结果显示,获得一株针对狂犬病病毒糖蛋白构象表位的单抗6F12和一株针对糖蛋白线性表位的单抗1B12。小鼠中和试验结果显示,两株杂交瘤细胞分泌的抗体均具有狂犬病病毒中和活性。结果表明,获得了两株针对狂犬病病毒G蛋白不同抗原表位的中和活性单克隆抗体,为狂犬病病毒特性研究和检测奠定了基础。