山苍子AFLP反应体系的建立及其引物筛选

通过对山苍子幼嫩叶片、顶芽、花蕾3种组织的DNA提取效果分析和对影响酶切及选择性扩增效果的4个主要因素(酶切时间、Mg²⁺浓度、dNTPs浓度、引物浓度)的比较研究,建立了适合于山苍子AFLP分析的技术体系。结果表明,山苍子的顶芽是较好的DNA提取材料;山苍子基因组DNA经5 U EcoR I和5 U Mse I酶切1 h即可完全酶切;最佳的选择性扩增体系为20 μL反应体系中含有1.0 U rTaq聚合酶、2.0 μL 10×PCR缓冲液、1.8 μL 25 mmol·L^-1MgCl₂、1.4 μL 2.5 mmol·L^-1dNTP、100 ng·μL^-1引物各1.0 μL。使用该反应体系获得了清晰、稳定的DNA指纹图谱,并筛选出10对多态性较好的AFLP引物组合,为利用AFLP标记技术进一步开展山苍子种群遗传结构、遗传分化等研究奠定了基础。     

苦楝SSR-PCR反应体系优化及引物筛选

[目的]借鉴以往楝属文献报道的SSR引物,筛选高度多态性、稳定性高、重复性好的苦楝SSR引物,为苦楝遗传图谱构建、QTL定位和分子标记辅助选择育种等研究领域应用奠定基础.[方法]本研究采用单因素法和正交试验设计进行SSR-PCR反应体系优化,并利用该体系以8个不同种源的苦楝基因组DNA为模板,从135对候选SSR引物中进行引物筛选.[结果]苦楝SSR-PCR最优反应体系为:1.0 μL 50 ng·μL^-1模板DNA,1.2 μL 100 μmol·L^-1引物,1.0 μL 10 mmol·L^-1 dNTPs,0.8 μL 25 mmol·L^-1 Mg²⁺,0.15 μL 5 U·μL^-1 Taq酶,1.5 μL 10×Buffer,补ddH₂O至15 μL;最终筛选出15对具有高度多态性、稳定性高、重复性好的SSR引物.[结论]本研究成功优化了苦楝SSR-PCR反应体系,并成功筛选出15对适用于苦楝的SSR引物.     

油茶SRAP-PCR反应体系的优化

Camellia oleifera is one of the important oil tree species in south China, and C. oleifera industry is quickly developed with the support of the national policies in recent years. The disorder of C. oleifera varieties is one of the key issues restricting the development of C. oleifera industry. Because of high polymorphism, good repeatability, less use of DNA and so on, SRAP as a new marker was used in identification of cultivars, analysis of genetic resources and genetic diversity in recent years. In this paper, the orthogonal design was used to optimize SRAP-PCR system for C. oleifera by 5 factors (Mg²⁺, dNTPs, primer, Taq polymerase, DNA template) and 4 levels, respectively. The data were analyzed by software SPSS V13.0. A suitable SRAP-PCR system (20 μL) was established as: 75 ng DNA template, 1.5 mmol·L^-1 Mg²⁺, 0.15 mmol·L^-1 dNTPs, 1U Taq DNA polymerase, 0.4 μmol·L^-1 primer, 1×PCR buffer. The result of optimal SRAP-PCR system will provide a foundation for the identification of C. oleifera cultivars.     

用正交设计法优化枣树ISSR-PCR反应体系

采用正交设计的方法对枣ISSR-PCR反应体系的5因素(Taq酶、Mg2+、模板DNA、dNTPs、引物的浓度)在4水平上进行优化试验,PCR结果用DPS数据处理软件分析。实验结果表明:各因素的不同水平对PCR反应结果都有显著的影响,其中Mg2+影响最大;筛选出了各反应因素的最佳水平,建立枣ISSR-PCR的最佳反应体系(25μL)为:Taq酶1.0 U、Mg2+1.0 mmol/L模板DNA 1.0μL、dNTPs 0.25 mmol/L、引物0.3μmol/L。     

鹅掌楸Genomic-SSR反应体系优化

The optimization of the Genomic-SSR reaction system is a basic protocol when the Genomic-SSR is used for genetic analysis in Liriodendron. The concentrations of Mg²⁺, dNTP, Primer and rTaq were tested by L₉(3⁴) orthogonal experiment and single factor gradient experiment to gain the optimal reaction system. The results indicated that the optimal reaction system should contain 75 ng of genomic DNA, 1 μL of 10×buffer, 0.4 μL of 10 mmol·L^-1 dNTP, 0.75 μL of 2.5 mmol·L^-1 MgCl₂, 0.25μL of 10 μmol·L^-1 Primer, 0.05 μL of 5 U rTaq and final volume of 10μL. Repeated trials and two verification tests showed that this optimal reaction system was stable, reliable, efficient and suitable for the applications of Genomic-SSR in Liriodendron population genetics and quantitative genetics research.     

构树ISSR反应体系的优化与建立

利用正交试验对Taq酶浓度、引物浓度、dNTPs浓度、Mg2+浓度和模板DNA浓度5个因素进行优化,从而建立了一套适宜构树的ISSR-PCR反应体系.在20 μL的反应体系中,各反应物的最适宜含量为:0.07 U·μL-1 TaqDNA聚合酶、0.35 μmol·L-1ISSR引物、0.3 mmol·L-dNTPs,2.0 mmol·L-Mg2+、1.2 ng· μL-1模板DNA.PCR扩增程序为:94℃预变性5min,94℃变性30 s,46℃退火45 s,72℃延伸2 min,40个循环.     

漾濞泡核桃ISSR-PCR反应体系的建立和优化

以漾濞泡核桃优株为研究对象,研究其ISSR-PCR反应体系中的5个影响因子(模板DNA浓度、Taq DNA聚合酶浓度、引物浓度、dNTPs浓度、Mg2+浓度)对PCR扩增效果的影响,从而建立起漾濞泡核桃的最佳ISSR-PCR反应体系。结果表明:模板DNA最佳浓度为50 ng/(25μL),Taq聚合酶浓度为0.75U/(25μL),引物浓度为0.7mmol/L,dNTPs浓度为0.20mmol/L,Mg2+浓度为2.0mmol/L,利用该最佳体系对试验中所选取的样本进行扩增反应。建立了适宜于漾濞泡核桃的ISSR-PCR扩增的最佳体系,该体系的建立为利用ISSR分子标记技术对漾濞泡核桃进行种质资源研究奠定了基础。     

采用正交设计方法优化观赏桃ISSR-PCR反应体系

为了获得观赏桃ISSR-PCR最佳反应体系,并为观赏桃遗传多样性研究打下基础,采用正交设计的方法对观赏桃ISSR-PCR反应体系的5因素(Taq DNA聚合酶、Mg~(2+)、模板DNA、dNTPs、引物)的浓度进行研究,用SPSS软件处理分析数据。试验结果表明,观赏桃的最佳反应体系(25μL)为Taq DNA聚合酶0.4 U,1mmol/LMg~(2+),模板DNA10~80 ng,dNTPs 0.20 mmol/L,引物浓度0.3μmol/L,并且在梯度退火试验后发现49.3℃为最佳退火温度。这一体系反应稳定、重复性强,可以用于观赏桃基因研究。     

野生小果油茶ISSR-PCR反应体系的建立与优化

为建立一个具有良好稳定性和可重复性的野生小果油茶ISSR-PCR反应体系,以提取的野生小果油茶总DNA为供试材料,利用单因素试验,正交试验设计L16(45)和方差分析对DNA模板的量,引物浓度,dNTPs浓度,Mg2+浓度,Taq DNA聚合酶的量5个影响ISSR-PCR反应体系的因素进行优化研究。确定野生小果油茶ISSRPCR最优反应体系为:在20μL的反应体系中,DNA模板为30 ng,引物浓度为0.7μmol/L,dNTPs浓度为0.25mmol/L,Mg2+浓度为2.0 mmol/L,Taq DNA聚合酶的量为1.75 U。方差分析结果表明,5个因素对体系的影响均未达到显著水平,其中引物浓度对反应体系影响最大。应用建立的体系对5份野生小果油茶样品进行扩增,证明了该体系具有稳定性和可重复性。     

川山茶ISSR-PCR及SSR-PCR优化体系建立及比较

以川山茶品种"茶睡莲"为试验材料,以改良CTAB法提取高质量DNA,采用正交设计L16(45),探讨了Mg~(2+)、dNTPs、引物、TaqDNA聚合酶和模板DNA浓度对川山茶ISSR-PCR和SSR-PCR反应体系的影响。建立了相关优化体系:20μL的ISSR-PCR扩增体系中含20 ng模板DNA,2μL10×Buffer,2 mmol/L Mg~(2+),0.15 mmol/L dNTPs,0.6μmol/L引物和1 U TaqDNA聚合酶,扩增退火温度为55℃,35个循环;20μL的SSR-PCR扩增体系中含50 ng模板DNA,2.5 mmol/L Mg~(2+),0.05 mmol/L dNTPs,0.2μmol/L引物和0.5 U TaqDNA聚合酶,最佳退火温度为52℃,最佳循环数为38。应用该优化体系,分别用27个川山茶品种DNA进行了ISSR-PCR扩增和SSR-PCR扩增,结果显示,建立的优化体系具有较高稳定性。     

粗皮桉 ISSR-PCR 反应体系优化

为建立粗皮桉 ISSR-PCR 优化反应体系,先通过单因素试验确定影响粗皮桉 ISSR-PCR 5个因素(Mg²⁺、dNTP、Taq DNA 聚合酶、DNA 模板、引物)的较适宜浓度范围,在此基础上进一步通过正交试验对5个因素4个水平进行优化,并用 DPS 软件分析试验结果。结果表明粗皮桉 ISSR-PCR 的优反应体系为：在25μL 反应体系中,10×PCR buffer 2.5μL、MgCl 2.0 mmol·L^-1、dNTPs 0.3 mmol·L^-1、Taq DNA 聚合酶1.25 U、DNA 模板60 ng、引物0.8μmol·L^-1。通过梯度试验确定的扩增程序为：94℃预变性5 min,然后按94℃变性1 min,51℃退火3 min,72℃延伸2 min,进行35个循环,最后72℃延伸5 min,4℃保存。     

南方红豆杉ISSR-PCR反应体系的建立与优化

以南方红豆杉DNA为模板,采用正交试验设计对影响南方红豆杉ISSR-PCR扩增的参数进行了优化。结果表明较佳的南方红豆杉ISSR-PCR的反应体系(20μL)为模板DNA 60 ng,10×PCR buffer 2.0μL,25 mmol/L的MgCl21.0μL,2.5 mmol/L的dNTPs 1.0μL,10μmol/L的引物1.0μL和反应酶0.2 U。适宜的扩增条件为94℃预变性4 min,41个PCR循环(94℃变性30 s,54.5℃退火45 s),72℃延伸80 s,72℃延伸5 min,4℃保存。     

山茶ISSR扩增条件的优化

以山茶基因组DNA为材料,测试山茶ISSR扩增的最适退火温度,并采用单因素试验,测试了模板DNA量,Mg2+浓度,dNTP浓度,BSA浓度,引物用量,Taq酶用量等6个因素对山茶ISSR扩增的影响。结果显示:山茶ISSR扩增的最适退火温度为56.3℃;适宜的扩增体系为:10μL PCR反应体积中,1×Taq酶配套缓冲液(10 mmol.L-1Tris.HCl pH 9.0,50mmol.L-1KCl,0.1%Triton X-100),2 mmol.L-1MgCl2,0.6 mmol.L-14×dNTP,2 mg.ml-1BSA,16 ng模板DNA,10 pmol引物,0.5 U Taq酶。     

贯叶金丝桃ISSR反应体系的建立与优化

以药用植物贯叶金丝桃为研究对象,对其ISSR—PCR反应体系中模板DNA用量、Mg2＋浓度、dNTP浓度、Taq酶含量及退火温度等因素进行了梯度试验,得到最佳ISSR—PCR反应体系,并初步筛选出13条条带清晰、多态性高、重复性好的ISSR引物,为贯叶金丝桃遗传多样性及种质资源鉴定等方面的研究奠定基础。     

药用半枫荷基因组总DNA提取及ISSR-PCR反应体系优化

利用正交试验设计方法,对影响ISSR-PCR反应的Mg2＋、dNTPs、引物和Taq DNA聚合酶等因素进行优化的结果表明：在20μL PCR反应体系中含10×PCR Buffer,0.018μmol/L引物,4.0 mmol/L Mg2＋,15 ng/μL模板DNA,1.5 U Taq DNA聚合酶,4种dNTPs各0.15 mmol/L为半枫荷ISSR-PCR最适反应体系。     

野杏SSR-PCR反应体系优化

为建立稳定可靠的野杏SSR-PCR反应体系,以3个野杏无性系170号、240号、263号和1个西伯利亚杏无性系508号为试验材料,采用L16(45)正交试验设计对影响野杏SSR-PCR反应的5个因素在4个水平上进行优化。结果表明:各因素对反应体系的影响由大到小依次为DNA模板浓度、引物、dNTP、Mg2+、Taq聚合酶。野杏SSR-PCR最佳反应体系(总体积20μL):dNTPs 0.45 mmol/L、Mg2+2 mmol/L、Taq酶1.125 U、引物0.125μmol/L、DNA模板20 ng。选用引物X128和60个野杏样木对该体系进行稳定性验证,扩增产物集中在100～200 bp,稳定度高,多态性良好,该体系可应用于野杏分子标记辅助育种等方面的研究中。     

台湾水青冈ISSR-PCR体系的优化

分析了ISSR-PCR体系中Mg2+、dNTP和BSA浓度,以及模板DNA、引物和TaqDNA聚合酶用量等6个因素对反应结果的影响,建立了适合于台湾水青冈ISSR-PCR扩增的反应体系:10μL PCR反应液中,含10 ng DNA,1.5 mmol.L-1Mg2+,0.125 mmol.L-14×dNTP,1×TaqDNA聚合酶配套缓冲液(10 mmol.L-1Tris-HCl,pH值9.0,50 mmol.L-1KCl,0.1%Triton X-100),0.6 UTaqDNA聚合酶,2 mg.mL-1BSA和3pmol引物。应用优化的ISSR-PCR体系从100个ISSR引物中筛选出12个稳定性好,重复性高的引物,对22株台湾水青冈个体的DNA进行扩增,结果表明优化的ISSR-PCR体系完全适合于台湾水青冈的ISSR分析。     

短柄ISSR-PCR反应体系的优化

以短柄(Quercus glanduliferavar.brevipetiolata)的DNA为材料,对影响PCR扩增效果的一些因素诸如模板DNA用量、Taq酶的用量、镁离子浓度、dNTP的浓度、引物用量和牛血清白蛋白浓度等指标进行筛选和优化。结果显示适合短柄ISSR-PCR分析最适宜的PCR反应条件为:10μL PCR反应体积中,1×Taq酶配套缓冲液(10 mmol.L-1Tris-HCl,pH9.0,50 mmol.L-1KCl,0.1%Triton X-100),0.75UTaq DNA聚合酶,2 mmol.L-1MgCl2,0.2 mmol.L-14×dNTP,12 pmol引物,10 ng模板DNA,2 mg.mL-1牛血清白蛋白。短柄ISSR扩增较适宜的退火温度为54.4℃。     

红松SSR-PCR反应体系的建立与优化

为了建立红松SSR-PCR最佳反应体系,以CTAB法提取的红松针叶DNA为模板,应用单因子试验及L16(45)正交试验系统分析了DNA模板浓度、Mg2+浓度、dNTPs浓度、引物浓度、Taq酶浓度等对SSR-PCR扩增结果的影响,并对延伸时间、热循环参数进行了探讨,建立了稳定的、可重复的红松SSR-PCR最佳反应体系及PCR扩增参数。结果表明,PCR的最佳反应体系为:10μL体系中,1×PCRbuffer1μL、DNA模板50～120ng,Mg2+3mmol/L,dNTP0.4mmol/L,引物0.5μmol/L,Taq酶0.75U。利用该体系筛选出扩增条带清晰、多态性丰富的SSR引物13对。在此反应体系下,所扩增谱带清晰、稳定、多态性高。     

方竹和合江方竹种质遗传多样性研究

目的,建立及优化方竹和合江方竹的ISSR-PCR反应体系,分析其12个种质资源的遗传多样性。方法,采用L16（4^5）正交试验建立、优化ISSR-PCR反应体系,利用该体系分析12个不同种源的方竹和合江方竹的遗传多样性。结果最佳ISSR-PCR的最佳体系为：1×Reaction Buffer、dNTPs 100μmol/L、MgCl22.5 mmol/L、引物0.1μmol/L、Taq 0.8 U以及DNA 20 ng。12个供试竹种被分为两大类群,其中除方竹遂昌种源2外的其他方竹竹种亲缘关系相当接近,归为一个亚群;合江方竹杭州种源和合江方竹莲都种源归到一个小亚群中。