烟草PR1a基因启动子的克隆及其活性检测

【目的】从烟草中克隆得到病程相关蛋白1a基因的启动子PR1aP,并对其进行活性检测。【方法】通过PCR方法,从烟草基因组中克隆病程相关蛋白1a基因的启动子PR1aP,构建该启动子驱动的可溶性绿色荧光蛋白基因(smGFP)的植物表达载体p3300-PR1aP-GFP,并用农杆菌介导法将其导入烟草,检测转基因烟草植株经水杨酸(SA)诱导前后GFP的表达水平,通过SDS-PAGE和ELISA对其在不同诱导条件下GFP的表达情况进行分析。【结果】序列分析表明,PR1aP的长度为1 320 bp,含已报道序列的全部顺式作用元件,如水杨酸相关的W-box、ACGT序列等,也有增强子as-a-like元件及CAAT、TATA等常见应答元件。PCR检测结果显示,成功地获得了转基因植株;荧光检测表明,启动子PR1aP在正常条件下不表现活性,而在水杨酸诱导下有GFP表达。SDS-PAGE和ELISA分析结果表明,当水杨酸诱导时间为72 h、质量浓度为0.25 mg/L时,GFP表达量达到最大值,GFP最高占到总可溶性蛋白的0.083%,产率最高可达15μg/g。【结论】烟草病程相关蛋白1a的启动子PR1aP具有水杨酸诱导性。     

人骨形成蛋白2基因的克隆及序列测定

为了获得人骨形成蛋白2(hBMP-2)基因,以GeneBank(NM001200)中的hBMP-2基因编码序列为依据设计引物,采用RT-PCR技术从人胎盘中获得hBMP-2基因cDNA,并将其重组到pMD18-T载体中,转化到大肠杆菌JM109后挑选阳性克隆,经双酶切鉴定并进行测序。结果表明,获得的基因片断为hBMP-2全编码序列,同源性为99.9%。     

硫缓解龙葵镉毒害效应的研究

采用水培试验,研究了不同浓度镉和硫交互处理下,龙葵（Solanum nigrum L.）生物量、镉含量、各器官非蛋白巯基含量的变化,以及镉在龙葵各器官的亚细胞分布情况。结果表明：（1）适量的硫可以增加龙葵的生物量;（2）龙葵地上部镉含量随着镉处理浓度的提高而降低,地下部镉含量则相反。同一浓度镉处理下,龙葵地上、地下部的镉含量都随着硫处理浓度的提高而呈现一定的下降趋势;（3）不同处理条件下,植物体内非蛋白巯基含量无显著差异;（4）镉主要集中在细胞壁而不是细胞器中。故推测,硫是通过阻止龙葵对镉的吸收而不是促进无毒化合物（Cd—S4-complex）的形成来缓解龙葵的镉毒害症状。     

平邑甜茶金属硫蛋白基因MhMT2的克隆和表达分析

【目的】克隆平邑甜茶金属硫蛋白（metallothionein,MT）基因,探讨该基因对逆境的响应机理,为苹果抗逆分子育种提供依据。【方法】采用电子克隆和RT-PCR技术从平邑甜茶叶片中克隆MhMT2基因,利用生物信息学方法对获得的cDNA序列及推测氨基酸序列进行分析,通过定量PCR技术研究在胁迫条件和激素处理下该基因在叶片中的表达模式。【结果】平邑甜茶MhMT2基因cDNA全长534 bp,具有1个243 bp的完整开放阅读框,编码含80个氨基酸的多肽,其分子量为7.87 kD。同源性比对显示,MhMT2编码的氨基酸序列与其它植物的MT2蛋白有很高的相似性,其中与小金海棠的同源性最高,达到96.4%。MhMT2编码的多肽包含14个Cys残基,其N端富含Cys的结构域具有C-C、C-X-C和C-X-X-C基序,而C端仅有C-X-C基序。聚类分析显示,该基因属于植物MT2基因家族。定量PCR分析表明,MhMT2基因在叶中表达量最高,其次是根,在茎中表达量最低。在ABA、H2O2、机械损伤及NaCl处理下,该基因在叶片中的表达都上调,其中以H2O2最明显。【结论】对MhMT2基因在ABA、H2O2、机械损伤及盐胁迫下的表达模式分析,预示该基因表达水平在植物抗逆反应中起着重要作用。     

OsMT-1-4c 基因原核表达载体的构建、表达及重金属抗性研究

为研究水稻抗重金属的特性,构建了水稻金属硫蛋白(metallothionein,MT)原核表达载体PGEX4T-3-Os MT-1-4c,并转化到Rossetta菌株中诱导表达,得到大小为33.643 k Da的GST-Os MT-1-4c重组蛋白。将得到的沉淀用1×PBS溶解并在低温下超声破碎,离心并电泳检测,然后纯化得到融合蛋白。并在重金属Cd~(2+)胁迫下诱导表达重组载体和空载体菌株,发现能表达GST-Os MT-1-4c蛋白菌株比表达GST蛋白菌株抗重金属的能力强。     

胡杨叶绿素a/b结合蛋白基因的克隆及序列特性分析

采用RT-PCR和RACE-PCR技术,首次从胡杨中克隆到捕光叶绿素a／b结合蛋白基因全长cDNA,命名为PeCab（GenBank序列号：EU078170）。序列分析表明：该基因全长为992bp,开放阅读框为792bp,编码263个氨基酸,属于光系统Ⅱ类型ⅠCab基因,与植物Cab家族基因具有较高同源性,并且与双子叶植物的Cab家族基因的亲缘关系更近。半定量RT-PCR分析表明,该基因受光诱导表达,对6-BA、GA3和NAA三种激素的诱导均有应答,但在黑暗和ABA激素处理下,PeCab基因在转录水平上的表达基本没有变化。本研究丰富了Cab家族基因库资源,对揭示胡杨光保护及对各种环境适应性机理的研究奠定了基础。     

柽柳金属硫蛋白基因的克隆及分析

应用生物信息学技术从柽柳cDNA文库中分离出了一种金属硫蛋白全长cDNA序列,去除PolyA后该基因全长517bp。其中,5′非翻译区31bp,3′非翻译区267bp,开放读码框(ORF)长219bp,编码72个氨基酸,含13个半胱氨酸Cys,分布在蛋白质的N端和C端,呈CXC形式排列,基因编码蛋白的分子量为7.1kD,等电点为4.71。疏水性分析表明,蛋白的30～50个氨基酸之间有较强的疏水性,经过Pfam15.0(St.Louis(USA))分析证明,为金属硫蛋白家族基因。金属硫蛋白基因参与了植物的发育、胚胎发生、抵抗逆境胁迫等多种生理过程,是一种重要的功能基因。此基因的Genbank登录号为AY620987(基因),AAT39518(蛋白)。     

转mMT—I基因F3代烟草金属结合特性研究

研究表明转ｍＭＴ－Ｉ基因Ｆ３代烟草金属结合特性有以下４点;①单元素处理转基因烟草元素吸收量远远大于多元素处理,并且比对照烟草能结合更多的金属;②混合元素处理的方差分析结果显示,转基因烟草根及茎叶中的Ｃｄ,Ｚｎ和Ｃｕ含量均比对照烟草高,以Ｃｄ的吸收最显著;③在酸性土壤中,转基因烟草吸收Ｃｄ,Ｚｎ的量大于碱性土壤,Ｃｕ则相反,在中性土壤中吸收量最高;④转基因烟草结合金属的量随ＭＴ含量的增高而增加。     

橡胶树Lhcb2基因的克隆与表达特性分析

基于从基因组中获得的基因序列,应用RT-PCR技术从橡胶树叶片中分离得到1条849bp的cDNA;该cDNA包含1个798bp的ORF,编码265个氨基酸,理论分子量为2866kD,等电点为542,属于叶绿体定位的类囊体膜蛋白;蛋白含有3个跨膜螺旋,2个C端螺旋,1个保守的捕光叶绿素a/b结合蛋白结构域,1个三聚化基序,以及多个类胡萝卜素和叶绿素结合位点,根据进化关系可归为LHCB2亚家族;蛋白与蓖麻、野草莓、可可、葡萄和棉花中同源蛋白的一致性均接近95%,在进化上显示出高度的保守性,将基因命名为HbLhcb21。表达分析显示,HbLhcb21倾向于在叶片中表达,且其转录水平随着叶片的成熟而逐渐增加,但随着叶片的衰老而明显下调。     

灵芝金属硫蛋白基因的克隆及序列分析

采用RT-PCR和3′-RACE相结合的方法获得了灵芝(Ganoderma lucidum)金属硫蛋白的cDNA序列。该序列全长为315bp,5′-端非翻译区为47bp,3′-端非翻译区具有166bp,开放阅读框长度为102bp(包括一个终止密码子),可编码33个氨基酸。在其编码的氨基酸序列中半胱氨酸(Cys)含量最高,占21.2%,其次是丝氨基酸(Ser)和丙氨基酸(Ala),均占12.1%。对其编码的氨基酸序列进行分析发现该序列具有金属硫蛋白的保守序列模式,是金属硫蛋白家族的成员。     

龙葵果中原花青素优化提取试验研究

以野生龙葵果为原料,以原花青素提取率为考察指标,研究提取溶剂浓度、料液比、提取温度、提取时间等因素对原花青素提取效果的影响。通过正交试验,确定野生龙葵果中原花青素的最佳提取工艺条件为:提取溶剂为60%的乙醇,料液比1∶15,提取温度25℃,提取时间80 min。此优化条件下提取野生龙葵果中原花青素的含量最高,达0.055 2%。     

野生龙葵果红色素的稳定性分析

为了对龙葵果红色素的进一步开发利用提供理论依据,对不同条件下龙葵果红色素特征吸光值的变化进行了研究,探讨了其在不同温度、光照、pH、金属离子、H2O2、食品添加剂等条件下的稳定性。结果表明,该色素在酸性条件下(pH≤3)具有较好的稳定性;温度不超过60℃比较稳定;具有一定的耐光性;Na+、Ca2+和Mg2+对色素溶液无影响,Cu2+和Al3+对色素溶液有增色作用,Fe3+对色素有不良影响,能使色素溶液变色;氧化剂H2O2对色素有严重的破坏作用;蔗糖、葡萄糖对色素溶液具有一定的护色作用,高浓度的苯甲酸钠可加速色素降解。     

龙葵超声波乙醇提取物抑菌作用研究

[目的]研究龙葵乙醇提取物的抑菌作用。[方法]以天然植物龙葵为原料,采用超声辅助乙醇提取龙葵生物活性成分,将提取物配置成50、100、150、200 mg/m L 4种不同浓度的溶液,利用滤纸琼脂扩散法研究不同浓度龙葵生物成分对枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌3种菌种生长的影响。[结果]一定浓度的龙葵乙醇提取液对3种菌种均有抑制作用,且随着龙葵提取液质量浓度的增加,3种菌种的抑菌效果越显著,其中对金黄色葡萄球菌抑制效果最明显。[结论]龙葵提取液具有一定的抑菌作用,且抑菌效果随着龙葵提取液浓度的增加而增强。     

龙葵果提取物抗氧化活性测定及酚类活性成分分析

[目的]比较不同龙葵果提取物的抗氧化活性,同时测定其活性成分.[方法]用浓度60％乙醇浸提龙葵果,获得粗提物,减压蒸馏后分别用正丁醇、乙酸乙酯、氯仿3种溶剂萃取,采用DPPH·、·OH,O2-·清除法对各提取物的抗氧化作用进行评价,并与浓度60％乙醇粗提物溶液进行比较;分别测定4种龙葵果提取物中酚酸、黄酮、原花青素和花色苷的含量.[结果]浓度60％乙醇粗提物对DPPH·和·OH的清除效果最好,清除率分别为（68.45％±2.68％）和（49.12％±2.26％）;乙酸乙酯萃取物对O2-·的清除率最大为（79.64％±5.16％）.浓度60％乙醇粗提物中花色苷浓度为3.65 mg/ml,而乙酸乙酯萃取物中含有高浓度黄酮,浓度为3.42 mg/ml.[结论]龙葵果提取物中起主要抗氧化作用的是花色苷和黄酮.     

微生物对龙葵的生理活性和吸收重金属的影响

采用温室盆栽实验,接种从垃圾填埋场土壤中筛选的淡紫拟青霉菌和绿色木霉菌,研究其对龙葵(Solanum nigrumL.)的生理活性和吸收重金属的影响。结果表明,菌株对龙葵生长有促进作用,可增强龙葵对Cd、Pb的吸收能力。单一Cd污染时,淡紫拟青霉菌能增强龙葵的抗氧化能力,促进Cd从植物地下部分向地上部分迁移;单一Pb污染时,绿色木霉菌能降低龙葵的抗氧化能力,不能明显促进Pb的迁移。在Cd、Pb复合污染时,两种真菌的混合液能较好地促进龙葵对重金属的吸收,龙葵对Cd的富集系数最高可达到4.25,而其对Pb的富集系数最高仅为0.19。     

龙葵上柑橘木虱存活观察与黄龙病检测

柑橘木虱是毁灭性病害黄龙病的媒介,其寄主范围比较严格,仅为芸香科内的一些植物。我们发现在自然状态下,柑橘木虱成虫可在柑橘园中常见茄科杂草-龙葵上停留。对比试验显示,木虱成虫在龙葵上的存活期最长可达45天,而在藿香蓟、含水海绵和无水海绵上分别为27、9天和2天;通过实时荧光PCR检测发现部分龙葵叶片中含有黄龙病病原菌。这些非寄主植物可能有助于柑橘木虱躲避不良环境或长距离迁移扩散,成为柑橘木虱和黄龙病的潜在库源。     

龙葵对棉花生长的影响及其经济阈值分析

【目的】研究棉田龙葵对棉花生长和产量性状的影响及其防治经济阈值,为制定棉田龙葵的防治指标和措施提供科学依据。【方法】在大田条件下,研究不同密度（0、1、4、7、10、15株/m²）龙葵持续危害对棉花农艺性状和产量性状的影响,采取模型拟合法分析不同密度龙葵与棉花产量损失率间的函数关系,并根据经济危害允许水平分析龙葵的防治经济阈值。【结果】棉花的株高、茎粗、主茎节数随龙葵密度的增加而降低,龙葵对棉花中部铃铃数和产量具有显著影响（P<0.05）。当龙葵密度为1株/m²时,棉花产量损失率为60.92%;当龙葵密度达到15株/m²时,棉花产量损失率为100%。对数模型y =12.594 ln（X） + 58.025能较好地拟合龙葵密度与棉花产量损失率间的关系,根据经济危害允许水平和对数模型,人工防除龙葵的经济阈值为0.016 株/m²,96%精异丙甲草胺EC化学防除的经济阈值为0.017 株/m²。【结论】龙葵对棉花的抑制效应与其密度呈正相关,当田间龙葵持续危害密度高于0.016 株/m²时,即160 株/hm²,应及时防除。     

不同季节龙葵叶面微生物与叶片冻害的关系

为了探明植物叶面微生物与叶片冻害的关系 ,于不同季节 (冬季和夏季 )对龙葵叶片进行无菌水清洗和不清洗处理 ,将叶片置于 - 17℃冰箱中冷冻不同时间 ,观察叶片冻害情况 ,并对叶面微生物作了分离、鉴定 .结果表明 ,冬季冷冻 1m in可见叶片的冻斑 ,其平均直径为 (2 .6 0± 0 .2 4) m m ,水清洗组叶片冻斑比未清洗组冻斑减少71% ;夏季冷冻 1m in未见冻斑 ,冷冻 5 min叶片出现冻斑 ,其平均直径为 (1.80± 0 .17) mm ,水清洗组叶片冻斑较未清洗组减少 76 .7% .随着冷冻时间的延长 ,叶片冻害加重 ,冬季 1h,夏季 1.5 h,未清洗组叶片全部冻坏 .相应水清洗组叶片全部冻坏时间为 1.5 ,2 h.嫩叶对照组叶片 ,冬季冷冻 1min,冻坏面积达 80 % ,冷冻 30 min叶片全部冻坏 ;夏季冷冻 5 m in,冻坏面积达 72 % ,冷冻 40 m in叶片全部冻坏 .从龙葵叶片上分离出 5类叶面微生物 ,分别是 G+球菌 ,G+杆菌 (2类 ) ,G-杆菌 ,放线菌 ,其中数量最多的是 G+球菌     

镉对龙葵幼苗生长和生理指标的影响

采用营养液培养法研究了镉胁迫条件下龙葵幼苗生长、生理响应及镉积累特性.结果表明,镉胁迫下,龙葵幼苗生长受到一定程度的抑制,并且具有浓度效应和时间效应.镉胁迫还导致龙葵叶片色素含量下降.叶绿素a、b和类胡萝卜素平均含量在高浓度镉(150 μmol·L-1)处理条件下分别较对照降低55.5%、63.9%和43.3%.低浓度镉(25 μmol·L-1)处理15 d内显著促进龙葵幼苗根系活力,平均根系活力较对照上升10.4%,而高浓度镉处理下,根系活力呈现先升后降的趋势,镉处理10 d之后达到峰值;随着镉浓度的升高和胁迫时间的延长,龙葵幼苗叶片相对电导率、丙二醛(MDA)含量和渗透调节物质均呈现显著上升趋势.相对于对照植株,低浓度镉处理下龙葵叶片平均相对电导率、MDA含量、可溶性糖和脯氨酸含量上升17.7%、117.7%、5.6%和95.3%,而高浓度镉处理下上升幅度更大,分别为39.0%、194.6%、56.3%和758.0%.从积累部位来看,镉主要积累在龙葵幼苗地上部,镉含量由高到低依次为叶片>茎>根系,高浓度镉胁迫20d之后根茎叶镉含量为5 d时的1.73、1.49和1.40倍,分别为1 287.25、1 718.14和2 385.27 μg·g-1DW.     

刈割对龙葵生长和富集镉的影响及其机理

通过盆栽实验,研究了25mg·kg-1镉胁迫下刈割对超富集植物龙葵(Solanum nigrum L.)再生长能力和富集镉效果的影响。结果表明留茬30cm轻度刈割,新芽再生速度较快,留茬15cm深度刈割处理的再生速度则相对较慢,二者差异显著,但相对于对照来说刈割处理都能显著提高龙葵的生物量和生长速率。通过对不同时期龙葵体内的镉积累量的比较,发现刈割能有效提高龙葵富集镉的能力。刈割是提高龙葵对镉污染土壤修复效率的一种策略。