家畜胚胎体外生产技术

家畜胚胎体外生产技术是胚胎工程技术的重要内容之一。本文对家畜胚胎体外生产的相关主要技术环节,包括卵母细胞的体外成熟技术、体外受精技术及早期胚胎的体外培养技术等进行了综述,同时对该技术的发展前景进行了展望。     

猪体外胚胎生产的研究进展

与牛羊等动物的体外胚胎生产（in vitro production，IVP）技术相比，猪IVP技术尚不成熟。猪IVP主要存在卵母细胞的细胞质成熟差、多精子受精率高和胚胎质量差的问题，这严重制约了该繁殖生物技术在转基因猪生物反应器领域的应用。笔者在查阅近10年的国内、外相关研究后，从如何优化猪卵母细胞的体外成熟（in vitro maturation，IVM）、体外受精（in vitro fertilization，IVF）和胚胎的体外培养（in vitro culture，IVC）3个方面进行了探讨。     

水牛胚胎体外生产研究综述

近年来采用其它家畜上的程序来进行水牛体外胚胎生产(invitroproduction,IVP)引起了越来越多的关注。水牛胚胎体外生产已获得了较高的卵母细胞成熟率、受精率和卵裂率,但囊胚发育率和体外胚的移植成功率仍较低,水牛IVP胚胎体外生产效率比黄牛低得多。在IVP技术应用于水牛生产育种之前,还有一些问题必须解决。笔者对水牛胚胎体外生产的不同技术,包括未成熟卵母细胞的体外培养成熟和受精以及胚胎体外培养卵裂发育至囊胚等进行综述。还讨论了胚胎体外生产存在的问题及可能的解决方案。     

奶牛性控胚胎体外生产的影响因素及控制措施

针对奶牛胚胎体外生产环节,对体外受精和培养等技术进行了研究,旨在建立奶牛性控胚胎体外生产技术体系。结果表明,卵母细胞外周卵丘细胞至少保持3层以上,在成熟基础液中添加10ng/ml的EGF,利于核质成熟;在精子获能液中添加咖啡因降低精子的存活时间;牛胚胎前3d用CR1aa BSA培养,再用SOFaa 5?S培养,获得高的囊胚发育率,并且添加50ng/mlIGF-I后胚胎的发育得到了很大的改善。利用性控精液进行体外受精,受精率有轻微下降,但对生产的胚胎发育质量无明显(P>0.05)影响,胚胎移植后受胎率为40%左右。     

牛早期胚胎在不同培养液中体外发育比较

以卵丘/颗粒细胞单层作为共培养饲养层，比较了体外受精胚，卵母细胞孤雌激活胚和体细胞核移植胚在几种培养液中体外发育能力，以期筛选较适合体细胞克隆胚胎的体外培养系统。将体外受精卵分别置5种培养液中培养，囊胚发育率分别为20.43％、24.12％、32.10％、20.29％和29.03％，在CM1和CM2中囊胚的孵化率分别为8.64％和20％，结果表明，在添加10％的FBS时培养效果较好。卵母细胞孤雌激活胚在CM2-CM5中囊胚发育率分别是25.09％、29.84％和29.93％。核移植胚胎在CM3和CM5培养液中囊胚发育率为13.04％和9.26％。表明在共培养条件下CM3和CM5可以用于核移植胚胎的体外培养。     

优化牛体外胚胎生产技术体系的研究进展

本文阐述了体外受精技术在牛胚胎工程和育种研究中的重要意义，介绍了牛体外胚胎生产技术各阶段的研究进展，分析了当前牛体外卵母细胞成熟、体外受精及早期胚胎体外培养的研究现状，并提出了有效的措施。     

猪囊胚的体外生产技术

利用屠宰场猪卵巢卵母细胞经体外成熟、体外受精后,体外培育至囊胚阶段,并以体外生产的猪囊胚细胞数来衡量囊胚质量.试验共对5 84 9枚猪卵母细胞进行体外成熟、体外受精,其中3974枚卵母细胞在体外受精后发生卵裂,卵裂率为6 6 4 %±1 6 % ,2 136枚发育形成囊胚,占卵裂胚数的5 6 2 %±2 4 % ,占卵母细胞数的36 7%±1 3% ;检查了98枚囊胚,其平均细胞数为4 1 6±1 8;另外又检查了4 7枚囊胚,其平均内细胞团细胞数为3 85±0 5 6、滋养层细胞数为4 4 70±2 87.     

牛胚胎体外培养体系的优化

将体外受精后的牛卵母细胞随机分组进行培养,比较了胎牛血清(FBS)和发情后7 d牛血清(E 7BS)、不同培养液(CR 1+3 m g/mL BSA、SOF+3 m g/mL BSA和SOF+0.1 m g/mL PVA)、共培养体系和不同培养液体积(0.1,0.5和2.0 mL)对胚胎发育的影响,优化了牛胚胎体外培养体系,并对该体系的稳定性进行了检验。结果表明,优化后的牛胚胎培养体系为:前48 h用CR 1+3 m g/mL BSA培养液,48 h后用CR 1+体积分数10%E 7BS培养液培养120 h,培养液体积为0.5 mL,并且采用共培养,受精后颗粒细胞保留48 h。用该培养体系培养的牛胚胎发育良好,平均囊胚率为44.9%,表明该优化培养体系较稳定。     

猪体外成熟,受精卵的体外培养研究

用自己改良的发育培养基使３．９％￣２０．１％体外成熟体外受精卵在体外发育过了４－细胞阻滞期，到达８￣１６－细胞期，个别发育到桑椹期；培养中还观察到葡萄糖对猪胚胎的体外发育没有抑制作用，说明葡萄糖不是猪胚胎体外培养中出现阻滞的原因，在培养基中添加ｐＦＦ可促进猪胚胎体外发育，使发育至８￣１６－细胞期的胚胎率从３．９％，提高到１０２．２％。     

牛体外胚胎生产技术在沈阳实现突破

2008年8月,经专家鉴定委员会鉴定,沈阳金秋实牧业有限公司在“活体采卵法牛性控胚胎生产技术及产业化开发”科技研发项目上取得了重大突破,达到国际先进水平。     

牛胚胎移植过程中应注意的几个操作细节

阐述了供体牛在人工授精、胚胎采集及受体牛黄体检查和胚胎输入过程中的操作细节。     

牛卵母细胞体外成熟及体外受精的研究

本研究分析了卵巢不同性周期阶段（卵泡期、黄体期）、外源激素（ＦＳＨ、ＬＨ、雌激素）和不同卵泡液浓度（１０％,２０％,３０％）对卵母细胞体外成熟的影响。结果表明,卵巢的不同性周期阶段对卵母细胞体外成熟的影响不大（６３９％和５８７％）;成熟培养基中添加ＦＳＨ（１０ｍｇ／Ｌ）,ＬＨ（５ｍｇ／Ｌ）和同时添加ＬＨ、雌二醇（１ｍｇ／Ｌ）,可以促进卵母细胞的体外成熟,成熟率分别为６３０％,６４０％,６９１％;卵泡液（１０％,２０％,３０％）代替血清,其成熟率分别为５０７％,５７６％,５１９％,２０％ｂＦＦ效果最好。本研究对精子的两种处理方法进行了比较,发现在相同精子密度条件下（１×１０６～２×１０６个／ｍＬ）,Ｐｅｒｃｏｌ液处理精子的受精率（４７１％）显著低于上浮法处理精子的受精率（５７１％）（Ｐ＜００５）。     

牛体外受精胚胎无血清培养的研究

以TCM199为基础液,对常规IVM/IVF牛早期胚胎进行了无血清（1mg/ml,PVA,聚乙烯醇）和有血清（20%FCS）培养的对比实验。通过在无血清培养液中加入9种添加物,初步筛选出了在5%CO#-2、95%空气、39℃、饱和湿度培养环境下的牛体外受精胚胎无血清培养体系为：TCM199+EDTA0.1mmol/L+I5μg/ml+T5μg/ml+S5ng/ml+EGF10ng/ml+牛磺酸7mmol/L+亚牛磺酸5mmol/L+PVA1mg/ml+青霉素100iu/ml+链霉素100mg/ml。无血清培养与有血清培养囊胚率（7.1%对14.3%）、扩展囊胚率（4.3%对7.1%）,均无显著差异(P > 0.05)。实验结果还表明,外源激素（雌激素和孕酮）对胚胎发育无促进作用;有血清组与无血清组胚胎的各发育阶段（桑椹胚、囊胚、扩展囊胚）细胞核数量无明显差异（P > 0.05）。     

牛卵巢卵母细胞体外成熟的研究

研究了卵巢采卵方法以及卵巢保存温度和时间、性周期阶段、激素和培养基对牛卵母细胞体外成熟的影响。结果表明:从屠宰场获取的卵巢,先切剖或抽吸卵泡再切割卵巢,可显著提高可用卵母细胞数。卵巢保存时间在 2 h 以内最好,最长不超过 6 h。30~39 ℃的生理盐水保存卵巢,卵母细胞的成熟率(63.9 %)和卵裂率(34.4 %)均显著高于 2~8 ℃(16.7 %、0 %)和 20~29 ℃(54.1 %、31.7 %)保存的。采集卵母细胞时卵巢所处性周期阶段(卵泡期、黄体期)对卵母细胞体外成熟的影响不大(成熟率分别为 69.2 %、64.3 %)。M199 是牛卵母细胞体外成熟理想的培养基,M199 + 50 IU/mL LH+ 100 IU/mL FSH + 1μg/mL 17?-E2和 M199 + 50 IU/mL GnRH+1μg/mL 17?-E2都是牛卵母细胞体外成熟理想的培养系统(成熟率分别为 69.4 %、67.5 %,卵裂率分别为 35.4 %、42.7 %)。     

体外生产的牛胚胎在不同发育期的性比率

本研究旨在证实牛体外培养的雄性胚胎生长发育是否快于雌性胚胎。胚胎的性别鉴定采用多聚酶链式反应（ＰＣＲ）技术。在体外受精的第５天，胚胎根据发育期划分为三个组：１６细胞期，多于１６细胞期和桑椹期。在３个组中，雄性胚胎所占百分率分别是３２％，５３％和６３％。在体外受精的第７天，胚胎根据发育期划分为４个组：桑椹期、早期囊胚期、囊胚期和扩张囊胚期。在性别鉴定后，４个组中雄性胚胎所占百分率分别是２８％，３８％，６０％和７０％。结果表明：牛早期胚胎在体外培养条件下，雄性发育快于雌性。     

HA对牛卵母细胞体外成熟和早期胚胎体外发育影响的研究

在TCM-199中添加一些确定的辅助成分,探讨在无血清培养基中添加不同浓度HA对牛卵母细胞体外成熟及早期胚胎体外发育的影响。结果表明,在卵母细胞成熟培养液(TCM-199-m)中添加4.0mg/mL的HA时,卵母细胞的成熟率和卵裂率与对照组(BSA)无显著差异(P>0.05),分别为85.14%,83.57%和89.47%,85.24%,但显著高于其他各浓度组(P<0.05),表明HA在卵母细胞无血清成熟培养中可代替BSA。在受精卵体外培养液(TCM-199-c)中添加HA时,囊胚发育率与对照组(BSA)差异不显著(P>0.05),分别为27.64%和26.51%,但显著高于TCM-199-c组(P<0.05),表明HA对牛胚胎体外发育具有明显的促进作用,在无血清培养中可以代替BSA。当在TCM-199-c+HA中添加少量的BSA时,囊胚发育率(31.19%)显著高于其他各组(P<0.05),表明HA欲完全代替BSA还有不完善之处,有待进一步研究。     

胚胎分割技术在牛育种中的研究进展

胚胎分割技术是动物克隆技术之一,是胚胎生物工程技术的重要组成部分。牛胚胎分割技术是在牛胚胎移植技术的基础上发展起来的,其研究已经较为完善。牛胚胎分割的成功,是增加胚胎数目和生产同卵双胎或多胎、获得更多牛犊、扩大优良畜种繁殖后代的有效方法。笔者对胚胎分割技术在牛育种方面的应用进行了介绍。