鸡γ-干扰素基因的瞬时表达及其抗病毒活性检测

采用PCR技术从质粒pET-ChIFN-γ中扩增得到IFN-γ基因,将其亚克隆到真核表达载体pCAGGS中。将鉴定正确的克隆命名为pCAGGS-ChIFN-γ,体外转染CEF细胞,24小时后经间接免疫荧光（IFA）和免疫印迹（Western-blot）检测,表达蛋白具有良好的免疫原性。然后利用表达绿色荧光蛋白（GFP）的重组水疱口炎病毒（VSV*GFP）在CEF细胞上检测表达的ChIFN-γ抗病毒活性（AVA）,经检测其抗病毒活性为2×103AU/mL,并且其活性可被抗鸡IFN-γ的多克隆抗体阻断。结果表明：ChIFN-γ在鸡胚成纤维(CEF)细胞中成功表达,并且表达的ChIFN-γ具有良好的抗病毒活性。     

信号转导及转录活化因子基因(stat3)转染牛乳腺上皮细胞及生物学特性观察

应用PCR技术从含有人信号转导及转录活化因子(star3)基因cDNA的质粒pOTa7中扩增star3基因片段.将其克隆入真核表达载体pEGFP-C1中.构建重组表达质粒.利用脂质体介导法将重组表达质粒转染原代牛乳腺上皮细胞(bovinemammary epithelial cells).G418筛选阳性克隆.RT-PCR检测star3基因在牛乳腺上皮细胞中的表达,并通过流式细胞术(flowcytometry)检测转染细胞的增殖能力、周期以及DNA含量.结果表明.转染24 h后大约16%的细胞被导入含star3基因的重组表达质粒.在mRNA水平证实细胞内有stat3基因的高表达.导人star3基因后,细胞增殖能力增强,染色体变为三倍体,细胞的增殖寿命较对照细胞延长了13代.表明导入star3基因能延长体外培养的牛乳腺上皮细胞的寿命.     

STAT3基因转染牛乳腺上皮细胞及生物学特性观察

应用PCR技术从含有人STAT3基因cDNA的质粒pOTB7中扩增STAT3基因片段。将其克隆入真核表达载体pEGFP-C1中,构建重组表达质粒。利用脂质体介导法将重组表达质粒转染原代牛乳腺上皮细胞(Bovine Mammary Epithelial cells)。G418筛选阳性克隆,RT-PCR检测STAT3基因在牛乳腺上皮细胞中的表达情况,并通过流式细胞术(Flow cytometry)检测转染细胞的增殖能力、周期以及DNA含量。结果表明,转染24h后大约16%的细胞被导入含STAT3基因的重组表达质粒。在mRNA水平证实细胞内有STAT3基因的高表达。导入STAT3基因后,细胞增殖能力增强,染色体倍数发生变化,细胞的增殖寿命较对照细胞延长了13代,表明导入STAT3基因后,能延长体外培养的牛乳腺上皮细胞的寿命。     

绿脓杆菌ATCC27853菌株外毒素A全长编码基因的克隆及其在 HEK 293T细胞中的表达

采用PCR方法从绿脓杆菌ATCC27853菌株基因组扩增其外毒素A（PEA）全长编码基因,并将PEA基因插入到pcDNA3.1A真核表达载体中,构建成pcDNA3.1/ PEA质粒表达载体。经磷酸钙介导将重组质粒转染 HEK293T 细胞进行表达。结果表明本文克隆的PEA基因与标准菌株PA103碱基序列基本相似,同源性达99%。表达产物经蛋白免疫印迹法（Western-blot）检测,表明本文构建的含有原基因信号肽的PEA基因能够在真核细胞进行分泌性表达,这为基于PEA的免疫毒素、疫苗佐剂和疫苗载体的研究奠定了基础。     

一种新的猪α-干扰素基因克隆及其在大肠杆菌中表达

提取经新城疫病毒诱导培养的猪外周血白细胞总RNA,RT-PCR扩增出猪α-干扰素基因并克隆到T载体.测序结果表明,扩增片段含有信号肽的猪α-干扰素完整基因,与GenBank上登录的猪α1-干扰素基因同源性为97.2%.亚克隆猪α-干扰素成熟蛋白编码基因并对其5'段前1个稀有密码子进行大肠杆菌(Escherchia coli)偏嗜性改造.构建了猪α-干扰素原核单纯表达载体pCIFNA,实现了猪α-干扰素在大肠杆菌中的表达,表达产物约占菌体总蛋白的15.6%.表达产物以包涵体形式存在,用含6 mol/L盐酸胍的变性液溶解及含GSH-GSSG复性液复性处理,复性后的表达产物经凝胶层析纯化后,细胞病变抑制法测定结果表明,重组猪α-干扰素具有较高抗病毒活性,约为1.66x106U/mg.     

牛γ-干扰素在大肠杆菌与毕赤酵母中的表达及抗病毒活性比较**

用RT-PCR从经ConA刺激的荷斯坦奶牛外周血淋巴细胞总RNA中扩增了BolFN-γ基因，克隆人pGEM T-easy载体测序。再亚克隆其成熟肽基因，分别构建大肠杆菌（Escherichia coli）表达载体pET28a／BolFN-γ和毕赤酵母（Pichia pastoris）表达载体pPICZα／BolFN-γ前者存Ecoli BL21中经IPTG诱导实现了高效表达，表达蛋白占菌体总蛋白的30％，表达产物以包涵体形式存；后者存P. pastorisGS115中经甲醇诱导实现了高效分泌表达，表达产物直接分泌到培养上清中，表达量约为1．0g／L。分别在CEF／VSV和MDBK／VSV细胞系上对2种表达蛋白的抗病毒活性进行了比较，结果表明，两种重组蛋白在MDBK／VSV抗病毒活性高于在CEF／VSV上的活性，而毕赤酵母表达的蛋白抗病毒活性高于大肠杆表达蛋白，约为前者的2倍。     

牛nanog基因原核表达载体构建及其在大肠杆菌中的表达

从6周龄的胎牛（Bos taurus）原始生殖嵴中提取总RNA,通过RT-PCR扩增nanog基因,将其克隆到PMD-18T载体,然后再亚克隆到pGEX-KG表达载体上,获得原核表达质粒pGEX-KG-nanog,限制性内切酶分析和DNA测序证明所插入片段为牛nanDg基因编码序列。重组质粒转化大肠杆菌JM109（Escherichia coli）,在不同的培养温度（25、30和37℃）和不同浓度的IPTG（0．10、0．25、0．50、1．00和2．00mmol／L）诱导下均获得了表达,结果表明,培养温度和IPTG浓度对GST-Nanog融合蛋白在大肠杆菌中的表达影响甚微;经Western blot检测证实该蛋白约60kD,并具有GST抗原活性,证实目的蛋白为Nanog蛋白。     

鸡γ-干扰素基因(ChIFN-γ)的瞬时表达及其抗病毒活性检测

采用PCR技术从质粒pET-ChIFN-γ中扩增得到鸡(Gallus gallus)γ-干扰素(chicken interferon gamma,ChIFN-γ)基因,将其亚克隆到真核表达载体pCAGGS中.将鉴定正确的克隆命名为pCAGGS-ChIFN-γ,体外转染鸡胚成纤维(CEF)细胞,24 h后经间接免疫荧光(IFA)和免疫印迹(Western blot)检测,表达蛋白具有良好的免疫原性.然后利用表达绿色荧光蛋白(GFP)的重组水疱口炎病毒(VSV*GFP)在CEF细胞上检测表达的ChIFN-γ抗病毒活性(AVA),经检测其抗病毒活性为2×10~3AU/mL,并且其活性可被抗鸡IFN-γ的多克隆抗体阻断.     

猪粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（pGM-CSF)基因的克隆与原核表达

通过RT-PCR方法,从经ConA刺激的猪外周血淋巴细胞中扩增出猪粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（pGM-CSF）编码区的cDNA并将其克隆至pMD-19T载体,序列测定表明pGM-CSF基因的长度为435 bp,编码144个氨基酸。通过PCR方法获得缺失其N端17个氨基酸残基信号肽序列的成熟pGM-CSF蛋白基因,将其克隆至原核表达载体pET-32a（+）,构建重组表达质粒pET-GM并转入大肠杆菌(Escherichia coli )BL21（DE3）中进行诱导表达。经SDS-PAGE电泳和Western blot分析表明,表达的重组蛋白分子量约31 kD,主要以包涵体形式存在,表达量占菌体总蛋白的30.4% 。采用Ni2+-NTA亲和层析柱对经稀释复性的重组蛋白进行纯化,并采用MTT法以TF-1细胞检测纯化产物的生物学活性。结果表明,重组蛋白可有效刺激TF-1细胞增殖,其活性达到3.43×105 IU/mg。     

GatewayTM系统快速构建番木瓜环斑病毒CP和CI基因的反向重复序列表达载体1

本试验设计了含有attB侧翼序列的引物用于番木瓜环斑病毒的外壳蛋白基因（CP）和运动蛋白基因（CI）扩增。在BP重组酶的作用下,将CP基因和CI基因分别与受体载体pDONRTM221发生重组反应,产生入门克隆。接着,在LR重组酶作用下,将入门克隆与目的载体pHellsgate12发生重组反应,通过平板培养筛选及PCR扩增和酶切反应,获得了含CP基因和CI基因反向重复序列的表达载体。     

猫白介素-18基因的分子克隆、序列分析及其表达研究

根据GenBank中报道的猫白介素-18基因（IL-18）序列，对用ConA刺激的实验猫外周血单核细胞（PBMCf）进行了RT-PCR扩增；将扩增得到的PCR产物纯化后克隆入pMD18-T中得到重组质粒pTIL-18，进行核苷酸序列测定，并与不同物种的IL-18基因进行了序列比较。结果该基因全长579bp，编码192个氨基酸。在推导的猫IL-18氨基酸序列中，无信号肽序列和潜在的N-联糖基化位点，但存在4个Cys残基。与不同物种IL-18相比，猫IL-18与犬、羊、牛和猪IL-18核苷酸和推导的氨基酸序列有较高的同源性，与小鼠和鸡IL-18有明显的种属差异。将pTIL-18双酶切，回收目的基因片段亚克隆到大肠杆菌表达载体pET28a中构建了重组质粒pETIL-18，转化大肠杆菌BL21（DE3），并用IPTG进行了诱导。结果重组菌菌体裂解物经SDS-PAGE电泳可检测到相对分子量为27.5 kDa的重组目的蛋白。经凝胶薄层扫描，目的蛋白表达量可占菌体蛋白的13.6%。     

猪圆环病毒2型河南分离株进化分析及ORF2基因的表达

根据GenBank中猪2型圆环病毒的核苷酸序列,设计两对引物,对来源于河南省不同地市的4株PCV2细胞培养物进行鉴定,并扩增出ORF2基因,克隆到pMD18－T载体上,获得重组质粒pMD18-T-ORF2,并对其进行测序,结果表明所克隆的ORF2基因与其它PCV2 ORF2基因核苷酸同源性在92.4%～99.6%之间,氨基酸同源性在90.6％～97.9％之间。同时采用PCR从重组质粒pMD18-T-ORF2中扩增出587bp的ORF2基因,克隆到表达载体pET-32a,成功构建了重组质粒pET-32a-ORF2,经诱导表达了ORF2基因编码的结构蛋白,表达的重组蛋白为融合蛋白,分子量为40kD,经Western-Blot检测,重组蛋白可被PCV2阳性血清识别。     

鸡MHC I α-生物素化序列融合基因的构建、表达及纯化

实验克隆了莱航鸡(Gallus gallus )MHC I α (BF2)(GenBank登陆号：AY989897)全基因，分析了其信号肽序列，构建了缺失信号肽且拼接了BirA底物肽序列(BSP)的融合蛋白重组表达载体pET-BF2-BSP，在大肠杆菌(Escherichia coli )中得到表达，并优化了诱导剂浓度、起始诱导菌体浓度及诱导时间等表达条件。SDS-PAGE分析结果表明所得融合目的蛋白约为40 kD，Western-blot结果显示该重组蛋白成功融合了6×His标签；pET-BF2-BSP最优化表达条件分别为：菌体起始诱导浓度OD600nm 0.8~1.2，IPTG诱导浓度1.1 mmol/L，诱导时间2~4 h；建立了该重组蛋白变性状态下通过镍柱亲和层析纯化包涵体的方法。实验获得了高纯度的在体外构建鸡MHC-肽四聚体所需的重组蛋白BF2-BSP。     

嗜热子囊菌光孢变种cbh1基因的cDNA克隆及在毕赤酵母的高效表达

以嗜热子囊菌光孢变种(Thermoascus aurantiacus var. levisporus)总RNA为模板，通过RT-PCR克隆出外切纤维二糖水解酶基因cbh1片段，采用RACE方法获得全长cDNA克隆，其全长为1 710 bp，编码一种由457个氨基酸组成的单肽，推导的氨基酸序列中1～19位为信号肽序列，GenBank的登录号为AY840982。将该片段克隆到毕赤酵母(Pichia pastoris)分泌型表达载体pPIC9K上，获得表达重组质粒pPIC9K/cbh1，转化毕赤酵母GS115，所得重组子经PCR验证后进行诱导表达，筛选出一重组子GSp-15,经144 h诱导后，外切纤维二糖水解酶表达量为1.17 mg/mL，产酶活力为20.3 U/mL。     

人胰腺激肽释放酶cDNA的克隆、序列分析和原核表达

摘要: 为了研制人激肽释放酶（KLK1）特异单克隆抗体和进行重组酶的鉴定及纯化，根据已发表的人KLK1序列设计引物，用PCR扩增法从人胰腺单链cDNA库中特异地扩增出KLK1 cDNA。将其克隆入pGEM-T载体中,对5个重组质粒进行了序列测定，其中1个cDNA克隆的核苷酸序列与已发表的人肾/胰/唾液腺KLK1 cDNAs序列完全相同或有3个核苷酸差异。将去除信号肽序列的KLK1 cDNA以正确阅读框插入表达载体pGEX-4T-3,构建成重组质粒pGEX-KLK1。此重组质粒转化的E.coli 经IPTG诱导后表达分子量为48 kDGST-KLK1融合蛋白，表达产物主要以不溶性包涵体形式存在，可溶性部分能被Glutathione Sepharose 4B特异吸附，两者都能被GST特异单克隆抗体识别。用SDS-PAGE分离纯化的融合蛋白免疫小鼠，获得的抗血清的ELISA效价为1∶1600。结果表明，克隆的人KLK1 cDNA及其表达产物是正确的，可以用于人KLK1单克隆抗体的制备。     

黑曲霉木聚糖酶基因（xynB）的克隆及真核分泌表达

通过RT-PCR方法,以黑曲霉(Aspergillus niger)GIM3.452总RNA为模板,克隆出木聚糖酶B(xy-lanase B,xynB)基因的成熟肽编码序列(567 bp),编码188个氨基酸.将其与猪腮腺分泌蛋白(parotid secretoryprotein,PSP)基因的信号肽序列通过重叠延伸PCR(SOE-PCR)得到拼接片段PSxynB,并将其克隆到真核表达载体pcDNA6/HisTMA中,得到重组质粒pcDNA-PSxynB,重组质粒经过酶切、测序鉴定,证实含有目的片段,且构建正确.在脂质体介导下将重组质粒pcDNA-PSxynB转染猪肾细胞(PK15),通过RT-PCR证实其在PK15细胞中表达,并在细胞培养液中测到了木聚糖酶活最高达36.4 IU/mL.     

牛杀菌/通透性增加蛋白氮端片段的原核表达

目的 克隆牛杀菌/通透性增强蛋白(BPI)N端cDNA,构建原核表达载体,在大肠杆菌中表达BPI蛋白,并纯化重组蛋白。方法 参照Genbank报道的序列,应用RT-PCR技术,从牛嗜中性粒细胞mRNA中扩增出杀菌/通透性增加蛋白基因,然后将该基因插入原核表达载体pGEX-4T-1中,重组质粒转化大肠杆菌BL21,进行诱导表达。结果 获得BPI N端长度为714 bp的基因片断,序列分析证实该片断中有1个点突变。大肠杆菌中的表达产物为相对分子质量约为52×103的GST-BPI融合蛋白。结论 成功的表达和纯化了BPI重组蛋白。