旋毛虫脱氧核糖核酸酶 Ⅱ酶活及酶活性位点的鉴定

以旋毛虫新生幼虫期(NBL)脱氧核糖核酸酶 Ⅱ(DNaseⅡ)基因家族中全长序列T31D4为研究对象,对其融合蛋白的核酸酶活性进行鉴定并摸索最佳酶切条件;通过序列分析预测其关键活性氨基酸位点,同时利用基因点突变技术对所预测的位点进行验证。结果表明:旋毛虫的DNaseⅡ具有核酸酶酶切活性,最佳酶切pH为5.0,同时发现其在中性(pH 7.0)及偏碱性(pH8.0)下仍具有活性。利用Maga2软件对包括旋毛虫在内的以及业已发现的来自38个物种的DNaseⅡ的94个氨基酸序列进行比对,发现一个所有物种DNaseⅡ均高度保守的组氨酸位点,该结果与目前国际上所预测的DNaseⅡ关键活性氨基酸位点不同,目前国际上所预测的组氨酸位点在旋毛虫的DNaseⅡ序列中并非组氨酸（Ｈ）,而是丝氨酸(S)或赖氨酸(K);通过点突变技术进一步验证这个组氨酸位点才是所有物种DNaseⅡ真正的活性氨基酸位点。同时推测旋毛虫的DNaseⅡ可能为一种新类型的DNaseⅡ。     

旋毛虫脱氧核糖核酸酶-Ⅱ酶活及酶活性位点的鉴定

以旋毛虫新生幼虫期(NBL)脱氧核糖核酸酶-Ⅱ(DNaseⅡ)基因家族中全长序列T31D4为研究对象,对其融合蛋白的核酸酶活性进行鉴定并摸索最佳酶切条件;通过序列分析预测其关键活性氨基酸位点,同时利用基因点突变技术对所预测的位点进行验证。结果表明:旋毛虫的DNaseⅡ具有核酸酶酶切活性,最佳酶切pH为5.0,同时发现其在中性(pH 7.0)及偏碱性(pH 8.0)下仍具有活性。利用Maga2软件对包括旋毛虫在内的以及业已发现的来自38个物种的DNaseⅡ的94个氨基酸序列进行比对,发现一个所有物种DNaseⅡ均高度保守的组氨酸位点,该结果与目前国际上所预测的DNaseⅡ关键活性氨基酸位点不同,目前国际上所预测的组氨酸位点在旋毛虫的DNaseⅡ序列中并非组氨酸(H),而是丝氨酸(S)或赖氨酸(K);通过点突变技术进一步验证这个组氨酸位点才是所有物种DNaseⅡ真正的活性氨基酸位点。同时推测旋毛虫的DNaseⅡ可能为一种新类型的DNaseⅡ。     

旋毛虫肌幼虫强反应原性抗原基因的筛选及生物学特性分析

应用感染旋毛虫60 d猪血清为抗体探针,对旋毛虫肌幼虫cDNA文库进行免疫筛选,获得旋毛虫肌幼虫期强反应原性抗原基因,利用生物学信息网站(NCBI、BLAST等)及其相关软件(DNA star等)对获得的基因进行序列分析。结果表明:筛选约2.5×105个重组噬菌体,获得13个阳性克隆,有6个克隆为同一个基因,编码蛋白与染色体结构维持蛋白(SMC蛋白,structural maintenance of chromosome proteins)同源性为48.1%,在免疫筛选中均有较强的反应信号;有3个克隆为同一个已知基因(AAF63473),编码蛋白与丝氨酸蛋白酶抑制因子(Serine protease inhibitor)同源性为99%,在免疫筛选中反应信号次之;还有2个为同一个基因,与旋毛虫线粒体(Mitochondrion ofTrichinella spiralis)DNA有较高的同源性(同源性为87.7%),编码核糖体大亚基RNA,其他2个为未曾报道过的新基因,编码不同的未知蛋白,这4个克隆在免疫筛选过程中反应信号相对较弱。得到的2个强反应原性的旋毛虫肌幼虫cDNA分子,其中相对信号最强cDNA分子编码SMC蛋白,另一个编码丝氨酸蛋白酶抑制因子,二者有望用于旋毛虫病的诊断候选抗原基因。     

短小乳杆菌S-层蛋白信号肽基因的克隆及特性分析

根据GeneBank上注册的短小乳酸杆菌S-层蛋白基因序列设计了1对引物,采用PCR法获得了S-层蛋白信号肽基因．将其克隆到pMD18-T载体并测序。序列分析表明,序列全长为370bp,其中编码信号肽部分的90bp的碱基与GeneBank中的完全相同．生物信息学分析也表明这是一段信号肽基因,氨基酸序列分析也表明它具备信号肽的典型特征。试验克隆得到了短小乳酸杆菌S-层信号肽基因。     

杨树形成层区域扩张蛋白PtEXP1基因的克隆与分析

以矮牵牛的cDNA核苷酸序列为基础,利用杨树EST数据库和毛果杨基因组测序结果,通过序列的拼接设计合成了基因特异引物,从毛白杨形成层cDNA中扩增出一个长为1 009 bp的cDNA片段,将该片段连接到pGEM-T载体中并测序。测序结果表明,该片段含有完整的开放阅读框,共编码258个氨基酸残基。蛋白序列系统进化分析结果表明,该基因属于exp ansin基因家族-αexp ansin中的A亚家族,编码的氨基酸序列与芒果、欧洲山杨×美洲山杨杂交种、拟南芥和矮牵牛的-αexp ansin基因编码的氨基酸序列同源性分别为91%,88%,86%和86%。     

条斑紫菜抗坏血酸过氧化酶基因的克隆及生物信息学分析

结合电子克隆及RT-PCR技术获得条斑紫菜(Porphyrayezoensis)过氧化物酶基因。该基因cDNA序列长847 bp,包含编码245个氨基酸的开放阅读框。生物信息学分析结果显示,该基因编码蛋白无信号肽序列,与高等植物拟南芥的细胞质抗坏血酸过氧化物酶蛋白序列同源性较高,在细胞质中行使功能。此外,该基因的进化历程基本符合植物从低等到高等的进化过程。     

旋毛虫新生幼虫期特异性基因糖蛋白表达载体的构建

根据旋毛虫新生幼虫（NBL）期特异性全长cDNA SSC1基因序列，PCR扩增目的基因，克隆人pMD18T后，根据其读码框架，克隆人表达载体pET28b，构建其原核表达载体pET28b-SSC1。分别用Sal I和Xho I、Sma I和Hind Ⅲ双酶切；XbaI单酶切鉴定重组子，结果均与预期相符，进一步测序结果也表明重组载体读码框架正确，为进一步亚克隆和表达奠定基础。     

2种泥鳅生长激素基因cDNA的克隆和原核表达研究

从脑垂体中提取总RNA,用RT-PCR方法扩增并克隆到了泥鳅和大鳞副泥鳅的生长激素(GH)基因cDNA,分析了其核苷酸序列和推测的氨基酸序列.结果表明:2种泥鳅生长激素基因的开放阅读框(ORF)均包括633个核苷酸,编码210个氨基酸,其中包括22个氨基酸的信号肽和188个氨基酸的成熟肽.在cDNA序列上2者有11个核苷酸的差异;在蛋白质水平上,2者的差异仅为1个氨基酸,位于信号肽中,在成熟多肽中,2者的氨基酸序列相同.把GH成熟肽的cDNA克隆入表达载体pET-28 a,用IPTG诱导重组蛋白的表达,其表达量超过细胞蛋白总量的50%,主要为不溶性的包含体.细菌裂解液沉淀溶于浓度为8mol/L的尿素后,用固定化金属配体亲和层析纯化,获得了分子量为24 kDa的单一蛋白带.     

猪传染性胃肠炎病毒纤突蛋白全基因的克隆与序列分析

采用RT-PCR和重组PCR扩增猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus of swine,TGEV)TSX毒株纤突蛋白(spike protein,S)基因全长cDNA序列,分离纯化PCR产物,连接到pGEM-T载体,转化大肠杆菌DH5α,筛选阳性克隆pGEM-S,并对其进行酶切鉴定和测序,对测序结果及推导氨基酸序列进行同源性分析。结果表明,S基因全长为4 350 bp(GenBank登录号DQ001167),编码1 449个氨基酸,N端前16个氨基酸为推测的信号肽序列,其后1 433个氨基酸构成成熟蛋白;与GenBank中已发表的9个TGEV毒株S基因进行比较,核苷酸序列同源性为95%～98%,推导的氨基酸序列同源性为95%～98%。基于S基因及其推导氨基酸序列的聚类分析表明,TSX株与Miller、T014、TS和HN2002株亲缘关系较近。S基因变异是由于碱基突变造成10处氨基酸发生改变,但主要抗原部位未发生任何变异,为进一步研制猪传染性胃肠炎基因疫苗提供了良好的候选基因。     

徐淮山羊PPAR基因cDNA的克隆和生物信息学分析

为克隆徐淮山羊过氧化氢酶体激活增殖受体(PPAR)基因的cDNA,探讨徐淮山羊PPAR基因的生物信息学功能.根据GenBank中发表的绵羊PPAR基因序列,设计并合成1对引物,采用RT-PCR方法克隆徐淮山羊脂肪组织中PPAR基因cDNA,提交GenBank,并运用DNAStar软件及在线工具进行生物信息学分析.成功克隆出徐淮山羊PPAR基因的编码区全序列cDNA,大小为1 428 bp,GenBank登录号为GU082382,有起始密码子ATG和终止密码子TAG,编码475个氨基酸;徐淮山羊PPAR基因序列与鸡、鼠、猪、牛、绵羊相应编码区(CDs)的同源性分别为81%、89%、92%、98%、99%,徐淮山羊PPAR氨基酸序列与鸡、鼠、猪、牛、绵羊的PPAR氨基酸序列同源性分别为92.9%、97.3%、98.3%、99.6%、99.8%;PPAR蛋白无信号肽区域,属于非分泌型蛋白.     

四翅滨藜BADH基因的克隆、序列分析及其原核表达

在构建四翅滨藜(Atriplex canescens)全长cDNA文库中通过随机克隆测序并进行EST分析基础上,得到1个四翅滨藜甜菜碱醛脱氢酶(betaine aldehyde dehydrogenase,BADH)的cDNA序列,命名为AcBADH。AcBADH cDNA包含1个长度为1 500 bp的完整开放阅读框,编码500个氨基酸,属于ALDH-SF超家族,其核酸序列与中亚滨藜的BADH基因的同源性为98%,对应编码氨基酸序列同源性为99%。将得到的序列提交GenBank(登录号:JF776157)。与其他植物BADH的氨基酸序列比对,AcBADH具有相同功能区域,包括N-端信号肽,底物结合及酶催化位点,因而推测可以参与甜菜碱的合成反应。对AcBADH与其他植物BADH的氨基酸序列的进化分析表明,AcBADH与鞑靼滨藜、中亚滨藜的亲缘关系较近。将AcBADH基因与原核表达载体pET28a连接,进行融合表达,在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达出分子质量约58 kD的蛋白。     

花生谷氨酸脱氢酶基因AhGDH1的克隆与生物信息学分析

运用电子克隆技术获得花生1个谷氨酸脱氢酶基因cDNA序列,同时设计引物以花生cDNA为模板进行扩增,经测序得到证实,命名为AhGDH1,GenBank登录号:KT933119。采用生物信息学方法,对该基因编码蛋白从氨基酸组成、基本理化性质、亚细胞定位、跨膜结构域、信号肽导肽、二级结构和三级结构等方面进行了预测和分析。结果表明:该基因cDNA序列长度为1 713bp,包含1个1 236bp开放阅读框,编码411个氨基酸;该编码蛋白含有谷氨酸脱氢酶两个典型的保守结构域。同源比对分析显示,该基因编码的氨基酸序列与鹰嘴豆等植物的谷氨酸脱氢酶基因具有高度的相似性,进一步确定该蛋白为谷氨酸脱氢酶。     

中药青天葵黄酮醇合成酶基因的克隆与生物信息学分析

【目的】克隆中药青天葵黄酮化合物生物合成途径的关键调控酶—黄酮醇合成酶(flavonol synthase,FLS)基因并分析其序列特征及编码蛋白的功能。【方法】在前期青天葵转录组测序获得的FLS基因序列片段的基础上,通过cDNA末端快速扩增技术(RACE-PCR)克隆FLS基因的cDNA全长及其编码区;利用生物信息学方法对其编码蛋白进行同源性比对和功能分析。【结果】青天葵FLS基因cDNA全长1268 bp,其中包含993 bp的开放阅读框,编码331个氨基酸。编码蛋白的氨基酸序列预测显示,青天葵FLS蛋白为酸性、亲水性蛋白,分子量约为37.3 kDa;不含有信号肽、转运肽和跨膜结构域,可能定位于细胞质中;具有黄酮醇合成酶保守功能域,与铁皮石斛等同科植物FLS蛋白的同源性可达82%。【结论】成功克隆了青天葵黄酮醇合成酶基因,为后续的基因功能鉴定和生物合成调控,进而提高青天葵黄酮类药效成分积累奠定了基础。     

黄曲条跳甲线粒体源硫辛酸蛋白连接酶的序列分析及表达

采用转录组测序和荧光定量PCR等方法,分析了蔬菜害虫黄曲条跳甲lpl基因(Pslpl基因)的cDNA序列及基因表达情况.结果表明,Pslpl基因cDNA的开放阅读框为1 182 bp,编码393个氨基酸,N端含有13个氨基酸的线粒体信号肽.Pslpl基因在黄曲条跳甲雌、雄成虫的不同组织器官中都有表达,头部和中肠相对较高.雌、雄成虫之间对比分析发现,雄虫各组织器官Pslpl基因表达量均比雌虫对应组织器官中的表达量低,但在生殖系统中相反.Pslpl基因cDNA的鉴定和表达分析为研究黄曲条跳甲硫辛酸蛋白连接酶的功能及蛋白硫辛酸修饰奠定了前期基础.     

鹅催乳素受体基因克隆与表达

应用RACE-PCR技术,克隆了全长3 159 bp鹅催乳素受体基因(gPRLR)cDNA.序列分析表明, cDNA含443 bp 5′-UTR、2 496 bp编码区(含终止密码子TAA)和220 bp 3′-UTR.比对鸡催乳素受体基因并将前330 bp看作第1外显子,则gPRLR基因可划分为14个外显子.推导的蛋白序列含831个氨基酸,与鸡、鸽及火鸡PRLR的同源性分别为87.7%、85.2%和84.8%,其N末端含24个氨基酸的信号肽,成熟蛋白含807个氨基酸.gPRLR mRNA在成年鹅睾丸、输精管、卵巢、输卵管、肾、大肠、小肠、脾组织中均有表达,其中以肾、睾丸、大肠及小肠中表达最为丰富.     

鹅催乳素受体基因克隆与表达

应用RACE-PCR技术,克隆了全长3 159 bp鹅催乳素受体基因(gPRLR)cDNA.序列分析表明, cDNA含443 bp 5′-UTR、2 496 bp编码区(含终止密码子TAA)和220 bp 3′-UTR.比对鸡催乳素受体基因并将前330 bp看作第1外显子,则gPRLR基因可划分为14个外显子.推导的蛋白序列含831个氨基酸,与鸡、鸽及火鸡PRLR的同源性分别为87.7%、85.2%和84.8%,其N末端含24个氨基酸的信号肽,成熟蛋白含807个氨基酸.gPRLR mRNA在成年鹅睾丸、输精管、卵巢、输卵管、肾、大肠、小肠、脾组织中均有表达,其中以肾、睾丸、大肠及小肠中表达最为丰富.     

猪IgGⅡB类Fc受体基因剪接异构体的克隆及序列分析

根据GenBank中猪IgGⅡB类Fc受体(swFcγ RⅡB)cDNA基因序列,利用Primer软件设计合成了1对特异性引物,应用RT-PCR技术,从猪外周血白细胞cDNA中扩增swFcγ RⅡB基因,将扩增的基因片段插入pTG19-T载体进行测序,利用DNAStar Protean软件对基因的氨基酸序列潜在抗原表位进行预测.结果表明,克隆的swFcγ RⅡB基因序列长度为951 bp,编码316个氨基酸,与已发表序列的核苷酸与氨基酸序列同源性分别为99 3%和98.3%,其胞内区多出19个氨基酸的插入,其氨基酸序列至少存在3个潜在优势抗原表位的区域.swFcγ RⅡB基因存在亚类,所克隆基因是swFcγ RⅡB基因的1种RNA剪接异构体,预示了swFcγ RⅡB基因至少存在2种RNA剪接异构体.     

驴生长激素基因cDNA的克隆及生物信息学分析

[目的]研究驴GH基因的特性与功能。[方法]以驴肝组织为材料,设计一对特异性引物,采用RT-PCR技术克隆驴GH基因cDNA序列。[结果]测序得到706bp的驴GH基因cDNA序列,此序列包含完整的GH基因的阅读框,编码216个氨基酸,驴GH基因编码的蛋白有7个的疏水区域,存在7个跨膜区和信号肽,二级结构主要以α-螺旋和不规则卷曲为主,三级结构包含第27～215位氨基酸残基。[结论]驴GH基因在进化上非常保守,基于CDS序列构建的系统进化树与比较形态学和比较生理学结果一致。     

东亚砂藓类萌发素蛋白基因RjGLP的克隆及表达分析

以东亚砂藓转录组测序获得的类萌发素蛋白基因序列为基础,采用PCR技术克隆得到该基因的cDNA全长序列,命名为RjbZIP。该序列全长为726 bp,包含669 bp的开放阅读框,编码222个氨基酸的蛋白质。生物信息学分析显示,该蛋白的相对分子质量为23 397.9,等电点(pI)为6.82,不稳定系数为14.41,为稳定蛋白。序列预测分析表明,该蛋白疏水性强,具有信号肽序列,是一种胞外基质分泌蛋白。多序列比对分析结果显示,该基因编码的蛋白具有GLPs家族的典型特征。实时荧光定量PCR研究表明,在干旱胁迫处理过程中,东亚砂藓RjGLP基因的表达量高于正常生长的材料(CK),被诱导表达,推测该基因可能参与对干旱胁迫的应答。     

东亚砂藓类萌发素蛋白基因RjGLP的克隆及表达分析

以东亚砂藓转录组测序获得的类萌发素蛋白基因序列为基础,采用PCR技术克隆得到该基因的cDNA全长序列,命名为RjbZIP。该序列全长为726 bp,包含669 bp的开放阅读框,编码222个氨基酸的蛋白质。生物信息学分析显示,该蛋白的相对分子质量为23 397.9,等电点(pI)为6.82,不稳定系数为14.41,为稳定蛋白。序列预测分析表明,该蛋白疏水性强,具有信号肽序列,是一种胞外基质分泌蛋白。多序列比对分析结果显示,该基因编码的蛋白具有GLPs家族的典型特征。实时荧光定量PCR研究表明,在干旱胁迫处理过程中,东亚砂藓RjGLP基因的表达量高于正常生长的材料(CK),被诱导表达,推测该基因可能参与对干旱胁迫的应答。