甜荞花同源异型基因FeMADS1的克隆和序列结构分析

采用同源克隆方法,并结合RACE技术,从甜荞花芽分离得到1个A类MADS-box基因FeMADS1的cDNA全长,GenBank登录号为KM386627,其cDNA全长1 107bp,包括1个编码234个氨基酸、长为705bp的开放阅读框。序列同源比对和分子系统发生分析表明,其蛋白与拟南芥AGL8(FUL)的相似性最高,属A类MADS-box基因亚家族中的euFUL进化系,含MADS、I、K和C末端4个明显的结构域,并且K结构域包含K1、K2和K3共3个保守的富含疏水氨基酸残基的亚结构域,C末端结构域含FUL型基因2个特有的模体:FUL motif和paleoAP1motfi。     

重瓣榆叶梅PrtSHP的基因克隆与序列结构分析

采用同源克隆法结合3′-RACE技术从重瓣榆叶梅(Prunus triloba var.Plena)中分离得到了1个雌蕊和果实发育调控基因SHP的同源基因PrtSHP的全长cDNA(GenBank登录号:JF911701).其cDNA全长970 bp,包括1个编码244个氨基酸的735 bp的完整开放阅读框.蛋白质序列比对和分子系统发生分析表明,PrtSHP是拟南芥的SHP的同源基因,其编码的蛋白质的C末端结构域具有2个高度保守的模体(AG Ⅰ模体和AG Ⅱ模体),属C类转录因子中PLE进化系.     

拟南芥AP3基因植物表达载体的构建及在烟草中的遗传转化

拟南芥花器官B类特征基因属于MADS-box基因家族,其中APETALA3(AP3)基因在花瓣和雄蕊中特异性地表达。为探讨AP3基因在花瓣和雄蕊发育中的功能,本研究从拟南芥(Arabidopsis thaliana)花序中克隆At AP3基因构建植物表达载体,并转化烟草(Nicotiana tobacum)。通过PCR及q RT-PCR分析,表明At AP3基因成功转入烟草基因组并表达转录。表型观测显示转基因烟草雄蕊与野生型相比明显变短,说明AP3基因特异性地参与雄蕊的发育并起着至关重要的作用。     

荷花B类MADS-box基因家族NnDEF基因的克隆及表达分析

以荷花品种'重瓣一丈青'(Nelumbo nucifera‘chongban yizhangqing')为试材,采用同源克隆方法获得2个AP3/DEF同源基因NnDEF1和NnDEF2。NnDEF1基因CDS序列全长678 bp,编码225个氨基酸;NnDEF2基因CDS序列全长693 bp,编码230个氨基酸;2个蛋白的C-末端序列均包含典型的PI衍生基序和PaleoAP3基序。序列比对和系统进化分析表明:NnDEF1和NnDEF2基因属于B功能基因家族AP3/DEF亚家族,2个基因序列的同源性远高于其他物种同源基因,表明荷花进化中可能存在基因加倍事件。表达模式分析显示:NnDEF1和NnDEF2基因表达具有品种间相似性和个体内差异性,NnDEF1倾向于在花瓣和雄蕊组织中表达,在内侧花瓣表达量最高;而NnDEF2则表达较广泛,在茎、叶、萼片、花瓣组织中均有表达,在外轮花瓣组织中表达量最高。基因表达差异表明,NnDEF1基因可能在荷花瓣化现象中发挥作用。上述研究结果可为研究荷花花发育及瓣化现象分子机制奠定基础。     

甜荞FaeseuFUL基因的克隆和序列结构分析

利用基因同源克隆技术结合3' RACE和5' RACE基因克隆技术,从甜荞(Fagopyrum esculentum)花芽中克隆到1个与花序分生组织发育和果实发育等过程中起到重要作用的euFUL基因的同源基因FaeseuFUL(GenBank登录号为KM386626).序列分析表明,其cDNA全长1060bp,包括38bp的5'-UTR、1个编码231个氨基酸的696bp的完整开放阅读框以及326bp的3’-UTR.蛋白质分子序列比对和分子系统进化分析表明,FaeseuFUL基因是MIKC-type MADS-box基因,属于AP1/ SQUA亚家族的euFUL进化系,与拟南芥的AGL8/FUL的同源基因相似性达到81.4％,其编码区的C末端含有euFUL进化系的FUL基序和paleoAP1基序.     

苦瓜MADS盒基因的克隆和表达研究

根据MADS box基因保守区结构 ,设计简并性引物 ,利用 3’RACE方法 ,从苦瓜 (MomordicacharantiaL .)中分离出花特异表达基因的cDNA片段 .同时利用 5’RACE方法获得了全长cDNA ,命名为BAG .序列分析表明 ,该cDNA全长 10 0 1bp ,含一个编码 2 2 8个氨基酸的完整开放阅读框 ,5’端和 3’端非翻译区分别为 5 0、2 6 7个碱基 ,poly(A)尾巴长 2 2个核苷酸 ,具有典型的植物MADS box基因的结构 .该基因编码的蛋白质与黄瓜 (CUM10 ,CAG1) ,棉花(GHMADS 2 ) ,以及拟南芥AGL11等MADS盒基因蛋白质的同源性分别为 :95 %、93%、84 %、72 % .Southern杂交分析显示 ,在基因组中至少有两个拷贝存在 .应用RT PCR和Northern杂交结果证实 ,该基因在心皮和雄蕊中特异表达     

草莓AP1同源基因的克隆、表达及启动子分析

【目的】从草莓（Fragaria×ananassa）中克隆APETALA1(AP1)同源基因,并分析其在不同组织、器官及不同花发育阶段的表达水平,探讨其在草莓植株成花进程中的作用。【方法】根据其它物种AP1同源基因的保守序列设计简并引物,以草莓幼叶和花芽为试材,克隆得到AP1的基因片段,在此基础上利用RACE的方法分离获得其cDNA全长。利用实时定量RT-PCR分析草莓不同组织、器官及不同花发育阶段中AP1同源基因的表达水平。利用染色体步移的方法分离启动子序列。【结果】从草莓品种‘花姬’中克隆出AP1同源基因的cDNA全长序列,命名为FaAP1;其CDS长度为735 bp,编码245个氨基酸,与玫瑰AP1-1的氨基酸序列同源性最高,达到92%,与拟南芥AtAP1的氨基酸序列同源性为64.00%。FaAP1编码的氨基酸全长序列符合MADS-box基因家族特征,包含MADS-box、I-间插域、K-box域和C-末端几个结构域,是MIKC类型的MADS-box基因家族的成员。实时定量RT-PCR结果表明,在不同组织、不同花器官及不同花发育阶段中FaAP1的表达量存在差异。其启动子除了具有TATA/CAAT-box外还包含一些特异作用元件。【结论】从草莓中分离出的FaAP1基因,在花分生组织形成和花器官发育中有一定的调控作用。     

龙眼子叶胚3-磷酸甘油醛脱氢酶基因的cDNA克隆及序列分析

从龙眼子叶胚中分离得到一个大量表达的表达序列标签(EST),该EST编码序列与金鱼草3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)基因的同源性为84%,利用cDNA末端快速扩增(RACE)技术成功克隆了龙眼GAPDH基因全长序列.序列分析表明,龙眼GAPDH基因的cDNA全长为1395 bp,包括一个长1008 bp、编码336个氨基酸的开放阅读框(ORF),5′端非编码区(UTR)长71 bp,3′-UTR长316 bp.龙眼GAPDH基因编码的氨基酸序列与水稻、葡萄、小果野蕉、拟南芥、银杏等GAPDH基因的氨基酸序列同源性均高达85%以上,该基因在GenBank中的登录号为FJ694011.     

非洲紫罗兰花瓣细胞pH值测定及F3‘5’H基因片段克隆

以白色和蓝色品种的非洲紫罗兰舌状花瓣为材料,测定其细胞液pH值,并利用RT-PCR技术,以NCBI上登记的马铃薯、矮牵牛、龙胆草、金鱼草和瓜叶菊的F3‘5＇H基因片段保守区域为模板,克隆乃芍,爿基因片段,为花色显色机理研究提供理论依据。实验结果表明：蓝色品种非洲紫罗兰细胞液的pH值大于白色品种非洲紫罗兰花瓣细胞液的pH值,随着花期的延长,两个品种非洲紫罗兰细胞液的pH值变化不断增大,且白色品种非洲紫罗兰花瓣细胞液的pH值变化大于蓝色品种非洲紫罗兰花瓣细胞液的pH值;其范围均在3．0-7．0之间,呈弱酸;在两种花色品种非洲紫罗兰中,都得到了F3‘5＇H基因片段的cDNA序列长度为392bp,与马铃薯、矮牵牛、龙胆草、金鱼草和瓜叶菊的F3‘5＇H基因保守区域片段的同源性分别为63．O％、55．4％、52．8％、49．0％和47．7％。     

普通枇杷和栎叶枇杷APETALA1同源基因的克隆和序列分析

分析植物花分生组织特征基因APETALA1(AP1)同源基因的保守区序列,设计特异引物;用PCR方法从枇杷栽培品种香钟11号和野生种栎叶枇杷基因组DNA中各扩增出1个350 bp左右的片段;将该片段分别克隆到pUCm-T载体.测序和序列分析结果表明获得了枇杷AP1同源基因的片段.该基因片段的序列在2个不同种的枇杷间差异较小,均含有2个内含子,特别是外显子部分只有1个碱基的差别;编码区共编码36个氨基酸,氨基酸序列也只有1个氨基酸的差异.其序列已经在GenBank中登记(登录号分别为AY549306和AY571786).同源性比较发现该基因片段与其他作物中已经报道的AP1同源基因的同源性大都在80%以上,特别是与同属于蔷薇科的苹果的同源性最高,达到91%(栽培种)和94%(野生种),推测它们具有相似的功能.     

‘鲁星’桃中10个MADS-box基因克隆和表达分析

【目的】克隆‘鲁星’桃(Prunus persica var.nectarina‘Luxing’)中参与调控营养和生殖生长的MADS-box(Pp MADS)基因,研究其在不同组织器官中的表达特性,为解析该基因在花发育和果实发育及成熟过程中的功能奠定基础。【方法】利用同源比对和RT-PCR技术,克隆获得‘鲁星’桃中10个Pp MADS全长c DNA序列,并进行生物信息学相关分析;采用RT-PCR技术检测PpMADSs在茎、叶、萼片、子房、雄蕊、花瓣等组织以及花发育7个阶段和果实发育5个阶段的表达特性。【结果】测序结果显示,获得10个PpMADSs(Pp MADS11、12、19、20、21、22、28、29、30和31;Gen Bank登录号分别为KU559577、KU559578、KU559585、KU559586、KU559587、KU559588、KU559594、KU559595、KU559596和KU559597),其开放阅读框(open reading frame,ORF)分别为522、279、1 065、828、723、600、636、534、750和480 bp。进化分析表明,PpMADS11属于AP3亚组,PpMADS12是AGL17亚组,Pp MADS19属于MIKC*组,Pp MADS20、21和22同被分为Mα组,PpMADS28、29、30和31同属于Mγ组。亚细胞定位预测结果显示,10个PpMADS蛋白均定位于细胞核中。启动子分析显示,PpMADSs启动子区域含有多个顺式作用元件,包括光响应元件、防御及逆境响应元件、干旱诱导的MYB结合位点、热激响应元件、低温响应元件、真菌效应子响应元件、伤害响应元件、厌氧响应元件、GA响应元件、Auxin响应元件、Me JA响应元件、ABA响应元件、SA响应元件和乙烯响应元件。半定量RT-PCR和q RT-PCR结果显示,PpMADS11在茎、叶、萼片、子房、雄蕊、花瓣、花发育和果实发育中表达;PpMADS12在茎、叶、萼片、子房、雄蕊、花瓣和花发育中表达;Pp MADS19在萼片、雄蕊、花瓣和花发育中(苗期除外)表达;Mα组和Mγ组所有成员在茎、叶、萼片、子房、雄蕊、花瓣和花发育中均有表达,部分成员在果实发育中表达。【结论】10个PpMADS在‘鲁星’桃的营养生长以及花和果实发育过程中可能具有重要的调控作用。     

梅花 PmAP2基因的克隆及表达1）

为了解析梅花（Prunus mume Sieb．et Zucc．）花器官发育的分子调控机理,采用RT－PCR的方法从梅花‘三轮玉蝶’中克隆了APETALE2的同源基因PmAP2,并采用荧光定量PCR对PmAP 2的表达模式进行了分析。序列分析表明,PmAP2基因CDS区域全长1647 bp,编码548个氨基酸,含有两个保守的AP2结构域,属于AP2／ERF基因家族。多序列比对和系统进化结果显示,该基因与桃、苹果AP2基因相似性较高,分别为96％和82％。PmAP2在梅花营养器官、四轮花器官和果实中均有表达,花瓣中的表达量最高;台阁花型梅花花中PmAP2表达量最高,重瓣品种次之,单瓣品种表达量最低。 PmAP2的差异表达可能与梅花的花型进化有关。     

蝴蝶兰PhaSEP3基因的克隆及其在突变体中的表达

E类MADS-box是花器官发育分子模型中必不可少的基因,通过突变体研究其表达模式将为深入理解兰科植物花器官的分子机理与完善花发育调控理论提供依据。采用RACE(rapid-amplification of cDNA ends)技术从蝴蝶兰花瓣中克隆了一个E类MADS-box基因PhaSEP3(GenBank登录号为MZ436812),并采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析了该基因在蝴蝶兰不同组织和5种突变体中的表达水平。结果表明,该基因cDNA全长为1 236 bp,具有753 bp的开放阅读框(ORF),可编码250个氨基酸,其C端具有SEPⅠ和SEPⅡ基序。系统进化分析显示,该基因编码蛋白质与蝴蝶兰属的PeSEP3和AGL9亲缘关系最近。组织特异表达分析表明,PhaSEP3基因主要在生殖器官和授粉后子房中表达;在不同突变体中,PhaSEP3基因在侧萼唇瓣化突变体的萼片和唇瓣中表达水平显著升高;在退化雄蕊瓣化突变体的侧瓣、唇瓣和子房中表达水平显著降低,在蕊柱中的表达水平显著升高;在侧瓣唇瓣化突变体的侧瓣和唇瓣中表达水平显著升高;在侧瓣退化突变体的侧瓣中表达水平显著降低,而在蕊柱和子房中表达水平显著升高;在侧瓣雄化突变体中,该基因的表达水平在萼片和侧瓣中均显著升高。分析认为,PhaSEP3基因主要调控蝴蝶兰花器官各轮组织与授粉后子房的发育,在突变体花器官中,PhaSEP3类基因可能与其他花发育基因互作参与花器官形态的发育调控。该研究结果为进一步理解兰科植物花器官多样性的调控机理提供了资料。     

山核桃APETALA1同源基因的克隆与序列分析

根据植物花分生组织及花器官形成过程中起重要作用的APETALA1（AP1）基因的高度保守区序列,设计合成一对长度为23bp的聚合酶链式反应（PCR）引物,以山核桃Carya cathayensis因组DNA为模板,采用PCR方法扩增出长为486bp的DNA片段,克隆到pMD18-T载体。测序和序列分析结果表明,获得了山核桃AP1同源基因中的1个片段,该片段序列包含2个内含子,长度分别为86bp和291bp,编码区共编码36个氨基酸。其序列已在Gen荷Bank中注册（注册号为EU155118）,在Gen Bank中进行同源性检索结果表明,其氨基酸序列与其他植物AP1同源基因的氨基酸序列同源性高达69％～88％,推测它们在功能上也是相似的。     

杏品种花器官过冷却点及结冰点的研究

 【目的】弄清不同发育时期杏花、幼果过冷却点和结冰点变化,不同花器官过冷却点和结冰点的差异,为杏花期霜冻害机理的研究提供基础数据。【方法】以3个杏品种为试材,利用能准确模拟自然界霜夜降温过程的人工霜箱,测定不同发育时期花器官、幼果的过冷却点、结冰点,统计杏花器官受冻情况。【结果】随杏花发育进程的推移,3个杏品种自大蕾期至幼果期过冷却点、结冰点呈现明显上升趋势,表明抗寒力下降;不同品种、不同花器官过冷却点、结冰点存在差异,品种间表现为花器官过冷却点、结冰点越低,抗性越强,从过冷却点到结冰点的平均温度“跃升”值越大;过冷却点并不表示一个确定值,而是一个范围。花瓣过冷却点频率分布较雄蕊、雌蕊分散;杏花器官通过保持过冷却状态回避低温伤害,但对结冰十分敏感,一旦结冰,升温后花器官均受害而褐变。【结论】不同发育时期、不同品种不同花器官过冷却点和结冰点存在差异。     

梅州山樱花与台湾樱花花部性状的比较研究

以梅州明山自然生长的山樱花和从台湾引进并种植于明山樱花园的绯寒樱、八重樱和吉野樱为试材,对其花形、花色和花粉活力等花部性状进行了观测。结果表明,梅州山樱花的花梗较短,花瓣较小;花萼长于绯寒樱和八重樱,但明显短于吉野樱;花朵短于吉野樱而长于八重樱;山樱花与其他3种樱花的花萼、花瓣、花丝和花柱颜色有不同程度的差异。野生山樱花、绯寒樱和吉野樱的花粉活力没有明显差异;八重樱的花粉活力显著低于野生樱(p<0.01)和绯寒樱(p<0.05),而与吉野樱相比则没有显著性差异。     

毛叶枣APETALA1同源基因的克隆

分析在植物花分子生组织及花器密形成过程中起重要作用的APETALA1（AP1）基因的保守区序列，设计1对长度为23pb的PCR引物，以毛叶枣基因组DNA为模板，采用PCR方法扩增出长为648bp的DNA片段，克隆人pUCm-T载体，测序和序列分析结果 表明获得了毛叶枣AP1同源基因中部的1个片段，该片段有2个内含子，长度分别为152bp和386pb，编码区共编码36个氨基酸，其序列已在GenBank中登记（登记号为AF356541）,在GenBank中进行同源性检索，结果表明其氨基酸序列与其他植物AP1同源基因的氨基酸序列同源性高达66％－88％，推测它们在功能上也是相似的。