抑制性差减杂交技术(SSH)及其研究应用进展

高等生物大约含有 10万个不同的基因 ,其中仅有 15 %即 15 0 0 0个表达 ,基因表达的变化是调控细胞生命活动过程的核心机制 [1 ] 。因此 ,通过比较同一类细胞在不同生理状态下或在不同生长发育阶段的基因表达差异 ,可为分析生命活动过程提供重要信息。生物体几乎所有的生命活动过程包括病理的变化 ,从本质上讲均是基因表达变化的结果。因此 ,关于真核生物发育过程中基因表达与调控的研究已引起人们的高度重视。过去 ,人们对差异表达基因的分离主要依赖于示差筛选和差别杂交技术 ,但它们又存在着重复性差、敏感度低等缺点。近几年 ,随着 PC…     

mRNA差异显示技术的研究进展

在高等生物的发育过程中,基因的表达具有组织特异性及生长期特异性,正是由于基因的差异表达决定了所有的生命过程。在个体发育调节,细胞增殖、分化与凋亡,生理刺激,病理变化,以及某些药物的治疗等都会出现ｍＲＮＡ表达水平的变化。分析不同类型细胞中基因表达的差异,并克隆那些对生命过程以及病理变化至关重要的特异性表达基因,是分子生物学研究的重要任务。传统的基因分离方法主要有扣除杂交和差异杂交技术。虽然用这些技术已成功分离许多重要的基因,但技术操作繁琐,花费时间长,重复性差,效率低,而且只能进行２种组织样品的比…     

几种差异表达基因筛选方法比较

生命有机体在不同发育时期不同部位的基因表达具有差异性,其按照时间和空间顺序有序地进行复杂而精细的网络调控过程。基因的这种差异表达决定着每一个生命体的生长发育、分化、细胞周期调控、衰老及死亡等生命过程。比较不同细胞或不同     

小鼠新的印迹基因MPI的克隆及其特征

ＤＤＲＴ－ＰＣＲ技术用于寻找小鼠印迹基因的原理,主要通过观察小鼠亲本及它们杂交后代等位基因的多态表达,就能清楚区分基因的母源表达与父源表达,从而筛选出印迹基因。本研究通过ＤＤＲＴ－ＰＣＲ技术克隆到了一个新的印迹基因,并对其染色体定位,基因结构和表达等特性进行了初步研究。     

抑制性消减杂交技术(SSH)在动物免疫相关基因方面的研究进展

正对于一个生物个体来讲,尽管所有细胞的基因组成是相同的,但在不同的细胞、同一细胞不同的分化阶段或受到外界的不同刺激时,相关基因的表达及蛋白质的功能都会有所差异[1]。基因的差异表达是调控生物生命活动的核心机制,个体的生长发育和衰老死亡,以及对各种环境因子的应答,本质上都离不开差异基因的表达。为了阐明各种生命过程的分子机制,必须对差异表达基因进行分离、克隆并进一步研究,抑制性消减杂交     

鸡溶菌酶基因3‘端MAR在同源细胞系对基因表达调控的研究

用带有鸡溶菌酶基因增强子和启动子的编码细胞氯霉素乙酰基转移酶的融合基因，在其上游区、下游区或在上游和下游和下区同时插入鸡溶菌酶基因３＇端核基质附着区的不同表达载体ＭＥＰＣ、ＥＰＣＭ和ＭＥＰＣＭ，稳定转染鸡ＨＤ１１Ｐｒｏｍａｃｒｏｐｈａｇｅ同源细胞系，筛选不同表达载体稳定整休整合的细胞株，检测ＣＡＴ表达水平，确定表达基因拷贝数，从而分析鸡溶菌酶基因３＇端ＭＡＲ对基因表达的影响。稳定整合表达和瞬时表达     

鸡溶菌酶基因3＇端MAR在同源细胞系对基因表达调控的研究

用带有鸡溶菌酶基因增强子（Ｅ）和启动子（Ｐ）的编码细菌氯霉素乙酰基转移酶（ＣＡＴ）的融合基因（ＥＰＣ），在其上游区、下游区或在上游和下游区同时插入鸡溶菌酶基因３＇端核基质附着区（ＭＡＲ）的不同表达载体ＭＥＰＣ、ＥＰＣＭ和ＭＥＰＣＭ，稳定转染鸡ＨＤ１１Ｐｒｏｍａｃｒｏｐｈａｇｅ同源细胞系，筛选不同表达载体稳定整合后的细胞株，检测ＣＡＴ表达水平，确定其表达基因拷贝数，从而分析鸡溶菌酶基因３＇端ＭＡＲ对基因表达的影响。稳定整合表达和瞬时表达实验结果表明，鸡溶菌酶基因３＇端ＭＡＲ在同源细胞系对基因表达没有激活作用，与该基因５＇端ＭＡＲ在同源或异源细胞系中能激活基因表达形成鲜明对照，说明５＇瑞ＭＡＲ和３＇端ＭＡＲ在调节鸡溶菌酶基因表达上存在一种协调关系。     

副猪嗜血杆菌细胞致死膨胀毒素各亚基处理PK-15细胞的基因表达谱分析

为研究副猪嗜血杆菌(H.parasuis)细胞致死膨胀毒素(CDT)各亚基(Cdt A、Cdt B和Cdt C)的相关生物学功能,本研究采用基因芯片技术对以CDT各亚基处理的PK-15细胞基因表达谱进行检测和分析。通过比较各亚基处理细胞与空白对照细胞基因表达谱的检测结果显示,Cdt A、Cdt B和Cdt C作用PK-15细胞后,处理细胞中分别有91个基因、126个基因及135个基因出现差异表达变化。根据芯片结果选取变化较显著的基因进行荧光定量RT-PCR验证,结果与基因芯片检测结果基本一致。基因注释(GO)分析表明,这些蛋白分别参与免疫系统调节、生物调控、代谢过程和定位等过程。本研究结果为进一步研究CDT的致病作用机制奠定了基础。     

mRNA差异显示技术及其在动物科学研究中的应用

基因表达的变化是调控细胞生命活动过程的核心机制,分析不同细胞或同类细胞在不同发育阶段、不同生理状态下基因的表达状况,可以为研究生命活动过程提供重要信息。mRNA差异显示技术(differentialdisplay,DD)是目前应用比较广泛的在mRNA水平上检测基因表达的方法之一。本文介绍了mRNA差异显示技术原理及其优缺点,对包括引物设计改进、反应条件的优化、差异条带显示方法改进和降低假阳性策略等在内的技术改进进行了概述,对mRNA差异显示技术在动物生理学和病理学、动物胚胎、个体发育、动物遗传育种、动物营养研究中的应用作了概括介绍。     

抑制性消减杂交技术在动物疫病防控中的应用

抑制性消减杂交技术(SSH)是一种高效分离差异表达基因的方法,可以在转录水平研究机体在不同生理时期、环境变化、疾病等条件下的基因表达差异,因其具有灵敏度高,重复性好的特点,已被广泛用于寻找差异基因的研究。为筛选与病原体致病相关基因,了解病原体与感染细胞之间的分子响应机制,从分子水平探讨某病原体的致病机制;为研究不同强弱毒株之间的毒力差异,寻找新的毒力基因。应用SSH技术,可以同时从病原体和宿主细胞两个层面进行基因表达差异研究。通过构建病原体表达的差减文库或宿主细胞的表达差异文库,分别寻找病原体或宿主细胞的差异表达基因,为进一步研究病原体在机体内引起的各种病变的分子机制,以及今后动物疫病的基因治疗及基因疫苗的研制奠定基础。     

猪链球菌2型感染的A549细胞表达谱研究

采用人全基因组芯片的方法研究猪链球菌2型感染的A549细胞中各基因的表达变化。结果表明,有130个基因的表达具有显著性差异,其中61个基因表达为上调,69个基因表达下调。通过分析,其中77个差异表达基因可分为32个生物学功能类别,包括了信号转导、细胞凋亡、Toll样受体信号通路、细胞分化等生物学过程。     

东方山羊豆脱水蛋白基因的克隆及初步分析

 采用ＳＭＡＲＴ ＲＡＣＥ 方法,从东方山羊豆盐诱导抑制性差减杂交ｃＤＮＡ 文库中分离到了一个脱水蛋白（GoDHN）基因。该基因ｃＤＮＡ 全长１１６９ｂｐ,开放阅读框８４３ｂｐ,编码２８１ 个氨基酸,编码的蛋白质分子量为２８．７１ｋＤａ。经实时荧光定量ＰＣＲ 分析,GoDHN 基因在东方山羊豆的茎和叶中表达量明显高于根中表达量,并且基因表达受ＡＢＡ、ＮａＣｌ和ＰＥＧ 的诱导,随着诱导时间的增加,表达量呈持续增长趋势。这些结果表明,DHN 基因在东方山羊豆的抗逆性中可能起到重要的调控作用。本研究成功构建了ｐＣＡＭＢＩＡ１３０２-ＤＨＮ 植物表达载体,为下一步转基因研究奠定了基础。     

基因差异表达分析技术在寄生虫学中的应用研究进展

生物体表现出的各种生物学特性,主要是由于基因在不同细胞间及不同生长阶段的选择性差异表达引起的.这些基因的差异表达按特定的时间和空间顺序有序地进行着,决定了生命活动的多样性.而基因差异表达研究的各种分析技术正是在此基础上发展起来并在兽医寄生虫学中得到广泛应用.以mRNA差异显示、抑制消减杂交法和DNA微列阵分析等为代表的基因差异表达分析技术,在基因表达谱的分析及基因生物学功能研究,阐述寄生虫的发病机制,寄生虫疾病诊断,筛选合适的药物靶标和疫苗候选分子有效地防病治病方面发挥着重要作用.     

不同被毛密度獭兔的皮肤组织差异表达基因研究

为了筛选出不同被毛密度獭兔皮肤组织中差异表达的基因,本研究采用Agilent公司家兔全基因表达谱芯片对不同被毛密度獭兔皮肤组织总RNA进行了芯片杂交,通过实时定量PCR对部分差异表达基因进行了验证,并对基因表达谱进行了分析.结果表明,芯片试验共检测到2 657个差异表达的基因,其中包含1 106个已知功能的基因,表达上调的基因687个,表达下调的基因419个.GO分析表明,参与细胞增殖、分化、凋亡,信号传导及离子转运等生命过程的多种基因的表达水平发生了明显改变.实时定量PCR所得结果与基因芯片结果基本吻合.结果说明不同被毛密度獭兔皮肤组织的基因表达谱存在差别,这些基因的异常表达,可能参与皮肤毛囊的形成或分化过程,最终导致獭兔被毛密度的差异.这些基因的发现为进一步寻找与被毛密度相关的分子标记,并最终实现獭兔生产中的早期选育提供了研究方向.     

敲除小RNA gcvB后沙门菌的转录组分析

为筛选与沙门菌小RNA gcvB相关的靶基因,采用高通量的转录组测序(RNA-seq)技术对野生型沙门菌和敲除小RNA gcvB沙门菌的mRNA进行对比分析,全面地预测GcvB的靶基因的数量与种类,通过GO和KEGG数据库对筛选基因进行比对注释,进一步分析筛选基因的主要功能及涉及的生物过程。并利用荧光定量PCR对部分差异表达基因进行验证。结果显示:差异表达基因共1 244个,其中基因表达上调678个,基因表达下调566个。GO富集分析显示,差异表达基因主要涉及氧化还原活性、铁离子结合、运动活性等分子功能,细菌鞭毛的细胞成分,细胞呼吸、钴胺素代谢过程和钴胺素生物合成过程等生物过程。KEGG数据库分析显示,差异表达基因主要参与细菌趋化性、卟啉和叶绿素代谢、不同环境中的微生物代谢、双组分系统、甲烷代谢等14个信号通路。对筛选出的10个差异表达基因进行荧光定量PCR验证,结果显示:差异表达基因相对表达量与RNA-seq测序结果基本一致。本研究为进一步探明小RNA gcvB与靶基因相互作用、小RNA的调控机制,以及沙门菌致病机制奠定了基础。     

IBDV野毒株主要结构蛋白基因RT─PCR方法的建立

借助计算机软件，在分析比较了９个传染性法氏囊病病毒（ＩＢＤＶ）Ａ片段结构蛋白基因的基础上，设计并合成了２对ＶＰ２和ＶＰ３基因ＰＣＲ引物，经ＲＴ－ＰＣＲ反应条件优化选择，成功地建立了ＲＴ－ＰＣＲ方法，用于扩增ＩＢＤＶＶＰ２和ＶＰ３基因，经琼脂糖凝胶电泳和分子杂交鉴定，获得４个ＩＢＤＶ野毒株ＶＰ２和ＶＰ３基因，为ＩＢＤＶ分子生物学研究奠定了基础     

用RT—PCR检测犬外周血液单核细胞中犬瘟热病毒核衣壳蛋…

为了迅捷地诊断犬瘟热病毒（ＣＤＶ）感染，本研究采用及转录－聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）技术，检测犬外周血液核细胞（ＰＢＭＣ）中ＣＤＶ核衣壳蛋白（ＮＰ）基因。以两套引物针对ＣＤＶＯｎｄｅｒｓｔｅｐｏｏｒｔ毒株ＮＰ基因的两个片段。应用ＲＴ－ＰＣＲ〉以６株ＣＤＶ毒株感染Ｖｅｒｏ细胞，用ＣＤＶ人工感犬染的的ＰＢＭＣ，在这两处细胞的提的ＲＮＡ中，手增ＮＰ基因片段，取得了较好的结果。在３２例临床疑为ＣＤＶ感染     

IBDV野毒株主要结构蛋白基因RT—PCR方法的建立

借助计算机软件，在分析比较了９个传染性法氏囊病病毒（ＩＢＤＶ）Ａ片段结构蛋白基因的基础上，设计并合成了２对ＶＰ２和ＶＰ３基因ＰＣＲ引物，经ＲＴ－ＰＣＲ反应条件优化选择，成功地建立了ＲＴ－ＰＣＲ方法，用于扩增ＩＢＤＶ ＶＰ２和ＶＰ２基因，经琼脂糖凝胶电泳和分子杂交鉴定，获得４个ＩＢＤＶ野毒株ＶＰ２和ＶＰ３基因，为ＩＢＤＶ分子生物学研究奠定了基础。     

脑心肌炎病毒感染神经细胞的基因表达谱分析

脑心肌炎病毒(EMCV)可感染人和多种动物。为了探索EMCV对N2a细胞转录组的影响,揭示基因表达与致病性之间的关联,本研究用EMCV BD2毒株感染N2a细胞,收集感染后7 h的细胞样本,提取总RNA,使用NimbleGen杂交体系将标记好的ds-cDNA与小鼠基因表达谱芯片杂交,对芯片进行扫描,获得差异表达基因数据;应用生物信息学方法对筛查出的差异表达基因数据进行分析,筛选差异表达的免疫相关基因及信号通路;利用real-time FQ-PCR方法,对微阵列数据结果进行验证。结果表明,EMCV感染N2a细胞后共有21 143个差异表达基因;通路分析表明,差异表达的主要信号通路包括PI3K-Akt信号通路、MAPK信号通路、细胞因子间相互作用、趋化因子信号通路、TCR/RLR信号通路和细胞凋亡通路等;Real-time FQ-PCR检测的10个差异表达基因的变化情况与通过微阵列分析预测的变化一致。