南美白对虾精子超低温冷冻保存技术研究

【目的】建立一种南美白对虾精子超低温冷冻保存方法,为南美白对虾优良种质的长期保存奠定基础。【方法】利用胰蛋白酶消化法获得游离的南美白对虾精子,分别使用灭菌天然海水、无钙人工海水、3％等渗NaCl溶液和0．9％生理盐水作为基础液,并以不同浓度的二甲基亚砜（DMSO）、甘油、甲醇及其与海藻糖的混合溶液作为抗冻剂,在4种不同降温程序下超低温冷冻保存南美白对虾精子,然后在不同的温度下复苏冷冻精子,以伊红-苯胺黑染色法检测精子存活率。【结果】使用1．00g／L胰蛋白酶消化精荚5min能获得大量游离的南美白对虾精子,以灭菌天然海水为基础液,以10％DMSO和0．25mol／L海藻糖为抗冻剂,在P．1降温程序（4℃平衡30min,以．5℃／min的速率降至-20℃;-20℃平衡5min,以-10℃／min的速率降至-80℃;-80℃平衡5min,然后置于液氮中保存）下超低温冷冻保存南美白对虾精子,经37℃水浴复苏后精子存活率最高。【结论】建立的南美白对虾精子超低温冷冻保存方法具有可行性,为南美白对虾精子冷冻保存库的建立提供了技术支撑。     

不同抗冻剂对西伯利亚鲟精子冷冻保存的影响

[目的]研究不同抗冻剂对西伯利亚鲟精子的冷冻保存效果,筛选出合适的鲟鱼精子超低温冷冻保存抗冻剂.[方法]采用计算机辅助精子分析系统(CASA),检测10％、15％、20％的甲醇(MeOH)和二甲基亚砜(DMSO)分别作为抗冻剂超低温保存西伯利亚鲟精液活力及运动参数差异.[结果]以MeOH和DMSO作为抗冻剂,在浓度分别...     

褐牙鲆消化道粘液细胞的类型及分布

采用阿利新兰—过碘酸雪夫氏反应(AB-PAS)染色法和不同pH(1.0、2.5、3.1)的AB染色法,对褐牙鲆进行显微观察,发现褐牙鲆食管、胃、幽门垂和肠道均有粘液细胞分布.根据AB-PAS染色结果将褐牙鲆粘液细胞分成Ⅰ-Ⅳ4种类型:Ⅰ型呈红色,AB呈阴性反应,PAS呈阳性反应,含中性粘多糖;Ⅱ型呈蓝色,AB呈阳性反应,PAS呈阴性反应,含酸性粘多糖;Ⅲ型呈紫红色,AB和PAS均呈阳性反应,主要含有PAS呈阳性反应的中性粘多糖,同时含有少量AB呈阳性反应的酸性粘多糖;Ⅳ型呈蓝紫色,AB和PAS均呈阳性反应,主要含有AB呈阳性反应的酸性粘多糖,同时含有少量PAS呈阳性反应的中性粘多糖.AB(pH 2.5、3.1)染色显示,粘液细胞含酸性粘液(蓝色);AB(pH 1.0)染色显示,粘液细胞含弱的和强的硫酸化酸性粘液(蓝色).食管、胃、幽门垂和肠道含有大量粘液细胞,食管和中后肠以Ⅲ型和Ⅳ型细胞为主,幽门垂和前肠含有许多Ⅰ型细胞,胃只含大量的Ⅰ型细胞.通过对各部位粘液细胞的分类和比较可以看出,粘液细胞的分布和类型与其所在部位执行的功能有密切的关系.     

美洲鲥鱼精子超低温冷冻保存技术初探

对美洲鲥鱼精液的超低温冷冻保存技术进行了研究。以解冻后精子的活力为参数,探讨了鱼用任氏液为稀释液、不同体积分数甲醇为保护剂、不同冻前平衡时间以及不同精液稀释比对美洲鲥鱼精液进行超低温冷冻保存的保护效果。结果显示,以鱼用任氏液和体积分数为10%的甲醇组成抗冻保护剂,精液稀释比(精液与抗冻保护剂的体积比)为1∶3,于4℃冰箱平衡20 min,液氮面上方6 cm处平衡10 min,然后在液氮面上平衡5 min,最后投入液氮中的保存方式,保存60 d后检查精子活力,存活率可达80%。研究结果为保护淡水鱼类的种质资源提供了理论基础。     

猪精液稀释液中不同水质对精子活力的影响

通过对猪精液稀释液采用不同水质的试验研究，结果表明：无污染的高山矿泉水和质量好的蒸馏水作稀释用水的精子存活时间最长，而用天然河水作稀释用水的精子存活时间最短。     

褐牙鲆消化道内分泌细胞免疫组织化学的定位

应用过氧化物酶标记的链霉亲和素免疫组织化学技术,用抗5-羟色胺(5-HT)、生长抑素(SST)、胃泌素(Gas)、胰高血糖素(G lu)等4种抗哺乳动物血清对褐牙鲆消化道内分泌细胞进行免疫组织化学定位的研究.结果表明:5-HT免疫阳性细胞在消化道各段均有分布,胃各部分布较多,食管和肠管分布较少;SST在胃贲门部和胃体部数量较多,胃幽门部较少,食管和肠管各段均未检出;Gas分布于胃幽门部和前肠、中肠、后肠,从胃幽门部到后肠呈递减分布趋势,食管、胃贲门部和胃体部均未检出;G lu免疫阳性细胞分布于前肠和中肠,其余各段均未检出.     

褐牙鲆耐热相关分子标记筛选及遗传多样性分析

通过高温刺激(32℃)获得褐牙鲆的耐热群体和热敏感群体,利用扩增片段长度多态性(amplified fragment length polymorphism,AFLP)和微卫星技术筛选与褐牙鲆耐热性相关的分子标记,并分析了两个群体的遗传多样性。采用81对AFLP引物组合和42对微卫星引物进行耐热相关分子标记的筛选,结果表明:1个AFLP位点(A3)在热敏感群体中出现的频率显著高于耐热群体,与耐热性存在显著的负相关(P<0.01),相关系数达到-0.453;4个AFLP位点在耐热群体中出现的频率显著高于热敏感群体,与耐热性存在显著正相关性(P<0.01);微卫星引物Po25A和205TUF扩增出的位点S1和S2与耐热性存在显著负相关性(P<0.01),相关系数分别为-0.408和-0.398。群体遗传多样性分析表明耐热群体与热敏感群体的遗传变异水平较高,两个群体的遗传多样性水平相当。研究的结果不仅为褐牙鲆的耐高温选育提供技术支持,而且可以为鱼类抗逆性研究提供参考数据。研究亮点:利用AFLP和微卫星技术筛选褐牙鲆耐热相关的分子标记并分析其群体的遗传多样性。研究的结果不仅为褐牙鲆的耐高温品系选育提供技术支持,而且可以为鱼类抗逆性研究提供参考。     

超低温冷冻保存对西伯利亚鲟精子酶活性的影响

为西伯利亚鲟(Acipenser baerii)精子超低温冷冻保存体系优化及冷冻精子保存效果提供理论支撑,以西伯利亚鲟新鲜精子为对照,研究超低温冷冻保存(-196℃)条件下精子中总ATP酶(ATPase)、谷胱甘肽还原酶(GR)、肌酸激酶(CK)、乳酸脱氢酶(LDH)、琥珀酸脱氢酶(SDH)、过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)等的酶活性变化。结果表明:超低温冷冻前后西伯利亚鲟精子内的GR酶活性从(23.36±1.69)U/mL升至(94.61±4.13)U/mL,差异显著;CK酶、LDH酶、SDH酶、CAT酶及SOD酶的酶活性均显著降低,分别从(6.64±0.58)U/mL、(6 695.78±123.47)U/L、(24.91±1.63)U/mL、(112.33±6.38)U/mL、(61.99±4.15)U/mL降至(5.27±0.23)U/mL、(4 388.32±93.28)U/L、(17.45±0.94)U/L、(67.58±3.87)U/mL、(46.38±2.54)U/mL;总ATP酶从冻前的(18.77±1.23)U/mL降至(16.32±0.87)U/mL,差异不显著。超低温冷冻保存对西伯利亚鲟精子酶活性均有显著影响。     

牙鲆有丝分裂雌核发育二倍体的遗传特性分析

对牙鲆Paralichthys olivaceus有丝分裂雌核发育后代进行了遗传差异分析,并将其与同一母本的减数分裂雌核发育二倍体和普通二倍体进行了比较。结果表明:有丝分裂雌核发育二倍体可分为两部分,即纯合子(Mitotic-A)和杂合子(Mitotic-B);Mitotic-A、Mitotic-B、减数分裂雌核发育二倍体(MGD)和牙鲆普通二倍体(ND)的平均纯合度分别为1.000 0、0.328 4、0.252 1、0.183 3,4个群体的亲代与子代之间的平均遗传相似系数分别为0.707 1、0.874 8、0.894 0、0.660 2,子代个体间的平均遗传相似系数分别为0.546 0、0.792 1、0.836 6、0.675 9,这表明Mitotic-A与Mitotic-B具有完全不同的遗传特征;MitoticB在poli110TUF、poli1906TUF位点纯合个体所占的比例较高(34.10%、73.86%),而MGD在这两个位点全部表现为杂合(0、0),Mitotic-B在poli1490TUF、poli1498TUF位点纯合个体所占的比例较小(10.23%、9.66%),而MGD在这两个位点全部表现为纯合(100%、100%),这说明诱导方式不同,重组交换的结果则不同。研究表明,Mitotic-B与MGD虽然都是杂合子,由于诱导方式不同,导致其遗传特征也不同。     

溶藻弧菌疫苗对牙鲆免疫效果的研究

利用福尔马林灭活法制备了溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)疫苗,腹腔注射接种牙鲆(Paralichthys olivaceus),在以牙鲆血清为抗原制备兔抗鱼血清多克隆抗体的基础上,采用ELISA方法检测了接种疫苗后鱼血清中特异性抗体的变化;此外通过攻毒实验测定了疫苗对牙鲆的保护率。ELISA检测结果表明在接种疫苗后第7d抗体效价为1:64,在免疫后第7~8周达到最高抗体效价1:2048;攻毒实验结果显示受免鱼对溶藻弧菌的免疫保护率为73.3%,且溶藻弧菌疫苗对鳗弧菌(Vibrio anguillarium)、副溶血弧菌(Vibrio prarhaemolyticus)也具有一定的免疫保护性,其免疫保护率分别为56.25%、64.71%。     

饲料添加剂半胱胺对牙鲆毒性作用的初步研究

[目的]研究饲料添加剂半胱胺对牙鲆的毒性作用。[方法]采用腹腔注射和口腔灌服2种方式按等对数浓度梯度进行半胱胺对牙鲆的急性毒性试验,同时采用一次腹腔注射方式以100 mg/kg BW的半胱胺剂量对牙鲆进行亚急性毒性试验。[结果]急性毒性试验表明,腹腔注射组半胱胺96 h的LD50为263.6 mg/kg BW,95%可信区间为237.40~292.80 mg/kg BW,其安全剂量为26.36 mg/kg BW。口腔灌服组半胱胺96 h的LD50为1754.70 mg/kg BW,95%可信区间为1534.60~2006.30 mg/kg BW,其安全剂量为175.47 mg/kg BW。亚急性毒性试验表明:在注射100 mg/kg BW半胱胺后2 h,与对照相比,牙鲆血浆葡萄糖含量显著升高,尿素氮含量显著降低;血浆谷草转氨酶活性随注射时间有所升高,谷丙转氨酶活性随注射时间有所降低。[结论]半胱胺对牙鲆的毒性属于低等毒性。     

显微注射抗冻剂对牙鲆(Paralichthys olivaceus)胚胎毒性及冷敏感性的影响

摘要 鱼类胚胎冷冻保存经过多年研究,尽管有所突破,但目前仍未达到应用水平,其主要原因是由于鱼类胚胎体积大、卵膜通透性差等特点,导致传统的平衡法,无法使抗冻剂足够、有效的进入胚胎内部起到保护胚胎的作用。而在鱼类胚胎冷冻保存中利用显微注射技术,可直接将抗冻剂注射到鱼类胚胎卵黄囊内,这一定程度上弥补了普通平衡法的不足,提高抗冻剂对胚胎的保护程度。本研究主要对抗冻剂的选择、抗冻剂对牙鲆胚胎的注射剂量、注射浓度、以及注射后牙鲆胚胎的冷敏感性进行了比较分析。结果表明：1、牙鲆胚胎较适宜的显微注射剂量为750pl。2、几种抗冻剂注射牙鲆胚胎后的毒性大小相对排列为PVP>蔗糖,DMSO > MeOH > PG,其中注射PG获得的胚胎成活率和孵化率最高,注射PVP获得的胚胎成活率和孵化率最低,而PG与MeOH组成混合抗冻剂PM毒性更低获得的胚胎成活率和孵化率更高。而任何一种抗冻剂均随着浓度的增加其毒性随之增加。3、另外,在冷敏感实验中,显微注射6M的PM的胚胎胚胎,应用程序化法处理,以2℃/min的速率降至-20℃,平衡10min后解冻处理,发现注射PM的胚胎低温处理后成活率为25.07±1.57%,而6M的PM五步平衡法同步处理的对照组胚胎成活率为20.88±2.84%,说明显微注射的胚胎冷敏感性一定降低。     

牙鲆早期胚胎发育的盐度胁迫研究

研究了盐度对牙鲆受精卵的沉浮性及早期胚胎发育的影响。结果表明:受精卵在海水盐度30以上为浮性,盐度27.5时为悬浮,盐度25以下为沉性;孵化期适盐范围为25~45,最适盐度范围为30~35;在盐度15~20和45~50下,牙鲆受精卵孵化率显著下降,仔鱼的畸形率大幅上升;牙鲆原肠期对盐度变化的耐受力高于囊胚期,囊胚期高于4细胞期。     

牙鲆不同家系早期形态性状差异比较

通过测定牙鲆(Paralichthys olivaceus)11个家系后裔不同时期的生长资料,对全长、体长、头长、尾柄长、眼后头长、体高和尾柄高等7个形态性状进行相关分析和主成分分析,并对全长、绝对增长率、生长指标和体型指数进行方差分析,建立7个性状的生长方程。结果表明,7个形态性状之间均呈高度正表型相关,全长贡献率是形态性状中最高的。家系I33I03、I08I09和GBI09在全长方面具有明显优势,其中家系I08I09为绝对增长率和生长指标最优的家系,需加强选育。在体型指数分析结果中,家系C64I03在全长/体高指标上表现最好,而I19I03和I32I03是尾柄长/尾柄高指标最优的家系,这3个家系是选择牙鲆优良体型的重点对象。用Logistic生长方程进行了7个形态性状的拟合,其中5个性状的生长方程拟合度达到了0.93以上。     

饥饿和恢复投喂对牙鲆代谢的影响

2003年3月26日～4月30日,对体重(5 93±1 20)g、全长(8 58±0 39)cm的牙鲆Par alichthysolivaceus(TemmincketSchlegel),在(20±1)℃条件下进行饥饿和恢复喂食试验,研究饥饿和恢复喂食对牙鲆代谢的影响。结果表明,随着饥饿时间的延长,牙鲆的代谢率明显地呈直线下降,由试验开始的291 31mg/(kg·h)(以O2计,下同)饥饿15d后下降至135 42mg/(kg·h)(O2),下降了53 5%;恢复喂食后,牙鲆的代谢率明显升高,饥饿5d组(S5)在恢复喂食的第5d,代谢率恢复到对照组水平,饥饿10d组(S10)在试验结束时接近对照组水平,而饥饿15d组(S15)在试验结束时代谢率仍大大高于对照组。在恢复喂食期,牙鲆耗氧率与饥饿处理时间总体上呈正比,即饥饿处理时间越长,牙鲆的耗氧率越高。     

饥饿和恢复投喂对牙鲆代谢的影响

2003年3月26日～4月30日,对体重(5 93±1 20)g、全长(8 58±0 39)cm的牙鲆Par alichthysolivaceus(TemmincketSchlegel),在(20±1)℃条件下进行饥饿和恢复喂食试验,研究饥饿和恢复喂食对牙鲆代谢的影响。结果表明,随着饥饿时间的延长,牙鲆的代谢率明显地呈直线下降,由试验开始的291 31mg/(kg·h)(以O2计,下同)饥饿15d后下降至135 42mg/(kg·h)(O2),下降了53 5%;恢复喂食后,牙鲆的代谢率明显升高,饥饿5d组(S5)在恢复喂食的第5d,代谢率恢复到对照组水平,饥饿10d组(S10)在试验结束时接近对照组水平,而饥饿15d组(S15)在试验结束时代谢率仍大大高于对照组。在恢复喂食期,牙鲆耗氧率与饥饿处理时间总体上呈正比,即饥饿处理时间越长,牙鲆的耗氧率越高。     

牙鲆Follistatin cDNA的克隆与序列分析

为研究海水鱼中Follistatin基因的序列特征,从受精后67 h的牙鲆受精卵中克隆获得牙鲆Follistatin基因cDNA序列,并对其进行序列分析.结果表明,在牙鲆中并没有发现Follistatin基因的可变式剪切现象;牙鲆Follistatin基因cDNA序列全长963 bp.序列分析结果显示:牙鲆与Takifugu rubripes的亲缘关系最近.Follistatin蛋白中高度保守的半胱氨酸和甘氨酸残基的生物学功能可能是维持蛋白空间结构的稳定.     

牙鲆继饥饿后的摄食和生长的研究

对牙鲆Paralichthys olivaceus(体重5.93 g±1.20 g)继饥饿后的摄食和生长进行了研究。牙鲆饥饿5d(S5)、10 d(S10)和15 d(S15)后恢复喂食20 d,对照组持续喂食20 d,测定恢复喂食期间牙鲆的摄食率(FR)、食物转化效率(FCE)、吸收率(AE)和排粪率(DR),同时测定饥饿和恢复喂食期间牙鲆的全长、体重、特定生长率(SGR)、比肝重(HSI)、肝胰脏和肌肉中的RNA/DNA。结果表明:恢复喂食过程中,牙鲆的FR先升高后下降,而FCE则均先下降后升高;S5和S10组牙鲆的总吸收率(TAE)高于对照组,而S15组则低于对照组;S5组牙鲆的全长和体重接近对照组,而S10和S15组则不如对照组;饥饿处理组牙鲆的SGR在恢复喂食后先升高后降至对照组水平;饥饿时间越长,牙鲆的HSI越小,在恢复喂食过程中HSI逐渐接近对照组;饥饿时间越长,肝胰脏和肌肉中的RNA/DNA越小,在恢复喂食过程中RNA/DNA迅速升高,接近或超过对照组;在20 d的恢复喂食过程中,S5组出现完全补偿生长,S10和S15组出现部分补偿生长。研究表明,牙鲆在恢复喂食过程中,通过先提高FR后再提高FCE的方式产生补偿生长。