福建笋子芥种质资源遗传多样性的RAPD分析

从200个随机引物中筛选出10个引物,对11份笋子芥材料进行RAPD分析,并对笋子芥遗传多样性和分类进行研究.结果表明:10个引物共扩增出93个位点,其中多态性谱带65条,多态性程度为69.9%;平均每个引物产生9.3条多态性谱带,每个引物可扩增出7-13条,谱带大小为100-2000 bp.聚类分析结果表明,遗传距离为0.38时,11份笋子芥可聚成四大类群.     

基于转录组测序的花椒属物种EST-SSR标记开发

【目的】开发适用于花椒（Zanthoxylum bungeanum）和竹叶花椒（Zanthoxylum armatum）的EST-SSR引物,为花椒属物种的鉴定及遗传多样性探究提供分子标记。【方法】对花椒和竹叶花椒分别进行转录组测序(RNA-seq),基于得到的EST序列开发SSR引物。在2种花椒的EST-SSR引物中分别随机挑选60对引物,用12份材料（4份花椒和8份竹叶花椒）为样本,利用琼脂糖凝胶电泳验证其特异性。从有特异性条带的引物中,再随机选取花椒和竹叶花椒SSR引物各15对,选取6个（2份花椒和4份竹叶花椒）样本,利用聚丙烯酰胺银染电泳进行多态性检测。【结果】花椒共有64 944条Unigene,碱基对长度共54 073 890 bp,含有12 746个SSR位点,分布在10 595条Unigene上,SSR位点出现频率为19.63%,平均分布距离4.24 kb。竹叶花椒Unigene共75 669条,碱基对长度58 975 053 bp,共15 096个SSR位点,分布在12 612条Unigene上。SSR位点出现频率为19.95%,平均分布距离为3.91 kb。60对花椒引物中,有46对成功扩增出特异性条带,扩增效率76.67%;60对竹叶花椒引物中,有41对扩增出特异性条带,扩增效率68.33%。花椒和竹叶花椒的特异性条带大小在100~300 bp,主要集中在150~250 bp。多态性验证试验中,15对花椒引物中有12对产生了多态性条带,多态率80.00%;15对竹叶花椒引物中则有14对产生了多态性条带,多态率93.33%。【结论】基于花椒和竹叶花椒转录组高通量测序结果开发的EST-SSR分子标记引物,具有较明显的特异性和多态性。     

小麦叶锈菌特异分子标记建立

利用21对EST-SSR引物、30对SSR引物及40对小麦叶锈菌EST引物,以小麦条锈菌为对照,对小麦叶锈菌基因组DNA进行PCR扩增筛选。三类引物在小麦叶锈菌和小麦条锈菌基因组中分别扩增出55、77、53个稳定条带,其中多态性条带分别为25、36、12个,平均多态性百分率分别为45.45%,46.75%,22.64%。每对引物等位基因数为1~9,3种引物平均等位基因数分别为2.6、2.6、1.3。2对小麦叶锈菌中单一等位基因的EST引物EST-6和EST-23可在小麦叶锈菌中分别扩增出625和384bp的特异片段。进一步用其他6种锈菌和小麦散黑穗病菌对这2个特异引物进行检测,均未扩增出其特异性片段,表明引物EST-6和EST-23在小麦叶锈菌中具有特异性。     

部分杧果种质资源遗传多样性的SRAP和ISSR分析

利用SRAP和ISSR分子标记,对20份杧果种质资源进行遗传亲缘关系分析,为杧果种质资源的鉴定和杂交育种亲本选配提供参考依据。结果显示,在SRAP分析中,从80对引物中选出12对引物组合共扩增出224条谱带,每对引物组合扩增谱带数在13~21条,平均为18.7条,其中多态性谱带为194条,平均多态性谱带为16.2条,多态性比率为86.61%,材料间相似遗传系数变化范围为0.54~0.94;在ISSR分析中,从100条引物中选出10条引物共扩增出179条谱带,每条引物扩增谱带数在11~20条,平均为17.9条,其中多态性谱带为153条,平均多态性谱带为15.3,多态性比率为85.35%,材料间相似遗传系数变化范围为0.58~0.90。SRAP和ISSR标记分别在相似系数0.624和0.665水平上,均可将20份杧果种质资源分成4大类群,SRAP和ISSR标记都能将供试材料完全区分开来,聚类结果具有很高的一致性,均适用于杧果材料的遗传多样性分析,可用于杧果遗传亲缘关系的研究。     

黄鳝EST-SSR标记的开发及其通用性检测

利用SSRrepeat软件对NCBI数据库中黄鳝肠道EST序列进行挖掘、验证,分析微卫星(SSR)在这些序列中的总体分布特点,并开发黄鳝EST-SSR引物。结果显示,在黄鳝肠道的814条EST序列中共搜索到51个SSR位点,分布在43条EST中,出现频率为6.27%。这些EST-SSR的平均长度为18.80 bp。其中,三核苷酸重复为主导类型,占总SSR的49.02%,其次为二核苷酸重复,占29.41%。四、五、六碱基重复序列分别占微卫星总数的3.92%、11.76%、5.88%。多态性引物验证结果表明,在设计合成的21对EST-SSR引物中,12对在黄鳝中获得有效扩增。其中7对引物显示出多态性,共扩增出29个等位基因;每个位点等位基因数为2~7个(平均4.14),观测杂合度(Ho)为0~0.857 1,期望杂合度(He)为0.135 1~0.822 7,多态信息含量(PIC)为0.123 8~0.781 1。在鲤形目和鲈形目中进行的跨物种扩增结果表明,12对引物中有7对引物在5个不同物种间得到成功扩增,5对引物在个别物种间表现出多态。研究获得的EST-SSR引物,可用于黄鳝的种资资源评价及遗传结构研究。     

20份新疆紫花苜蓿种质RAPD和ISSR遗传多样性分析

【目的】采用RAPD和ISSR分子标记对新疆20份野生紫花苜蓿种质进行遗传多样性分析。【方法】用梯度PCR仪对RAPD引物和ISSR引物进行扩增筛选,筛选出多态性好的引物用于20份种质材料的研究。【结果】通过筛选分别得到6对RAPD和ISSR引物对20份新疆紫花苜蓿进行遗传多样性分析。6对RAPD引物共扩增出93个条带,多态性带91个,多态带百分率97.85%;平均每引物扩增出15.50条带,每引物平均扩增出的多态条带15.17。6对ISSR引物共扩增出157个条带,多态性带152个,多态带百分率96.82%;平均每引物扩增出26.17条带,每引物平均扩增出多态条带25.33。RAPD标记的Nei’s基因多样性变异范围为0.176 3~0.274 0,平均0.207 1;ISSR标记的Nei’s基因多样性范围为0.085 0~0.154 1,平均0.113 3。【结论】2种标记聚类分析结果均表明种质聚类与地理来源有一定的相关关系。     

亚麻EST-SSR标记开发

为了进一步开发利用现有亚麻EST-SSR资源,从NCBI公共数据库下载7 947条亚麻EST,去除低质量和冗余序列后,筛选得到含有SSR的序列共239条,检出率为3.0%。其中二核苷酸重复49条,共7个重复类型;三核苷酸重复160条,共41个重复类型;四核苷酸重复30条,共11个重复类型。根据不同的重复类型共设计65对EST-SSR引物,在20份材料PCR扩增检测结果表明,有52对引物有目的扩增产物,其中32对扩增条带清晰且具有多态性,占设计引物的49.2%,通过聚类分析可将20份亚麻材料划分为五大类,验证了EST-SSR分子标记在亚麻遗传多样性分析中应用的可行性。     

用EST-SSR标记评价21份黄瓜种质的遗传多样性

采用15对EST-SSR引物对21份不同生态类型(华北型、华南型、欧洲温室型和野生种)的黄瓜种质进行了分析,共检测到65个等位基因,平均4.33个,多态性信息量(PIC)值变幅0.177 ～0.748,平均值为0.470,表明12对引物具有高度或中度多态性.NTSYS软件聚类分析表明,21份黄瓜种质可分为2大类,外来种...     

基于ISSR分子标记的红豆草资源遗传多样性分析

【目的】分析评价红豆草（Onobrychis viciaefolia）种质资源间亲缘关系的远近,为红豆草的良种选育提供了科学依据。【方法】利用ISSR分子标记技术对国内外22份红豆草种质资源进行遗传多样性分析。【结果】用13条引物扩增共获得101条谱带,其中多态性条带98条,多态性比率为97.12%,平均每条引物扩增出7.8个条带,平均多态性条带为7.5条,平均等位基因数（Na）、平均有效等位基因数（Ne）、Nei’s基因多样性指数（H）和香农多样性指数（I）均值分别为1.97、1.49、0.30和0.46。【结论】遗传相似性系数聚类分析表明,22份红豆草种质资源在遗传系数0.69处可聚为4大类群,其中2668号和1号单独聚为一类,与其他材料遗传差异较大。     

枸杞品种SRAP分析

应用相关序列扩增多态性(SRAP)标记,对15个枸杞品种进行了遗传多样性分析。从36对引物组合中筛选8对引物组合用于PCR扩增,共获得39条谱带,多态性条带为37条,平均多态性百分率为94.8%,每对引物组合扩增出条带数3~9条不等,平均每对引物组合得到4.8条。15份材料之间遗传相似系数范围介于0.13~1.00之间,说明供试枸杞品种间存在丰富的遗传多样性。     

基于荧光检测技术的多花黑麦草EST-SSR指纹图谱的构建

【目的】构建基于EST-SSR荧光标记的多花黑麦草(Lolium multiflorumLam.)DNA指纹鉴定体系,为多花黑麦草品种鉴定提供高通量技术手段,为不同品种的合理应用提供参考依据,有效保护农民利益和育种权益。【方法】利用表型性状差异大的3个品种(特高Tetragold、长江2号Changjiang No.2和阿伯德Aubade),通过聚丙烯酰胺凝胶电泳从200对EST-SSR引物中筛选出扩增条带清晰、多态性好、扩增稳定的30对引物。在筛选出的每对引物5′端添加荧光标记FAM后,采用毛细管法通过DNA分析仪检测200个单株不同等位变异的扩增片段,从30对EST-SSR引物中筛选出25对扩增稳定的荧光引物,建立基于高通量荧光SSR标记的多花黑麦草品种鉴定体系。【结果】通过25对EST-SSR引物构建的DNA指纹图谱来进行10个多花黑麦草材料的品种鉴定。25对EST-SSR引物共检测到127个等位基因,等位变异扩增片段长度范围为51—249 bp,每对引物可检测到有效等位基因数为2—11个,特异等位基因最多可检测到11个(N101),平均每对引物4.00个;多态性位点的比率范围为33.33%—100.00%。平均PIC值为0.702,Shannon指数最大为3.322(N101),平均为1.929,基因多样性指数变幅为0.159—0.500,平均0.318,可鉴别的材料数为0—10个;其中14对特征引物在10个品种(系)上可检测出25个特异等位基因。综合来看,引物N101在200对引物中鉴别效率最高,可直接将10个多花黑麦草品种(系)区分开,在长江2号、赣选1号和川农2号上同时检测出特异等位基因。但由于多花黑麦草在品种间与品种内变异均较高,因此为鉴定更多材料,从25对引物中选择了6对扩增和检测效果较好的引物(N54、N101、N146、N151、N154、N156),6对引物可检测到的稳定等位基因数均不小于19个,在达伯瑞和邦德上最多可检测到22个等位基因。通过6对高效引物构建了10个多花黑麦草品种(系)的DNA指纹图谱,包括标准模式图、图谱代码和图谱QR编码。首次利用EST-SSR荧光标记毛细管电泳检测,为10个多花黑麦草材料分别构建了唯一的指纹代码和QR编码。【结论】利用6对高效引物构建了多花黑麦草SSR高通量鉴定体系,其中荧光引物N101多态性最高,可直接鉴别10个多花黑麦草品种(系)。     

基于近缘物种SSR引物和EST-SSR序列的梅花SSR引物开发

为获得更多的梅花SSR引物,本研究筛选了84对梅花近缘物种的引物,并从梅花EST数据库的序列中设计了23对EST-SSR引物,用12个梅花品种对这些引物进行了多态性检测。结果表明,近缘物种的引物有69对能扩增出条带,有效扩增率达82.1%,从中筛选的14对引物共得到85个等位基因,平均值为6个。有效等位基因数在2.07...     

基于干旱胁迫下杉木转录组序列的EST-SSR分子标记开发

利用干旱胁迫下杉木转录组数据进行杉木EST-SSR分子标记的开发。对干旱胁迫下的杉木组培材料在Solexa mRNA-Seq平台的二代高通量测序技术下进行了转录组测定,序列拼接后共得到75 357个片段,总长度65.29 Mb,共含有EST-SSR位点2 383个,其中三核苷酸重复类型数量最多,占总数的41.21%。随机挑选120个EST-SSR,用Primer Premier 5软件设计引物,再以遗传距离较远的8份杉木DNA样品为模板,通过8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,从120对引物中初选出电泳条带较好的24对引物,用24份杉木DNA样品进行毛细管电泳检测。结果表明:在初选出的24对EST-SSR引物中有23对引物检测出特异性峰;在24份杉木样品中共检测到等位基因94个,平均每个位点4.087 0个,等位基因变异数范围2~9个;有效等位基因数范围1.086 8~6.914 3个,平均有效等位基因2.089 0个;观测杂合度范围0.250 0~1.000 0;期望杂合度范围0.082 4~0.896 1;多态性信息指数范围0.173 2~2.035 3。开发得到的一组杉木EST-SSR分子标记为研究杉木的遗传多样性、种群结构、DNA指纹数据库构建和遗传信息的保存提供了基础。     

北美鹅掌楸EST-SSR跨属间通用性

利用从北美鹅掌楸(Liriodendron tulipifera Linn.)EST序列中开发的176对SSR引物,以国内木兰科10属43种的DNA样品为材料,检测了该批引物在木兰科各属间的通用性.132对引物在北美鹅掌楸中有效扩增,108对在鹅掌楸(L. chinense Sarg.)中有扩增产物,在鹅掌楸属内的通用...     

绿豆高密度分子遗传图谱的构建

【目的】在前期研究的基础上,进一步利用绿豆基因组SSR、EST-SSR、STS和普通菜豆基因组SSR等标记构建绿豆遗传连锁图谱,为绿豆重要性状相关基因的定位、克隆及分子标记辅助选育新品种等研究搭建技术平台。【方法】利用澳大利亚引进的Berken（高感豆象绿豆栽培种）× ACC41（高抗豆象绿豆野生种）及其重组自交系（recombinant inbreed line,RIL）群体,对6 686对引物进行PCR扩增及多态性筛选,包括6 100对绿豆基因组SSR、149对EST-SSR、13对STS和424对普通菜豆基因组SSR引物,将亲本间多态性引物,进一步分析重组自交系群体。结合前期研究的分子标记数据,利用Mapmarker/Exp 3.0软件构建遗传图谱,并设置LOD≥3.0,最大图距50.00 cM。用Joinmap 4.0软件进行图谱整合。【结果】用2个亲本共筛选了6 686对SSR引物,共有3 691对引物有稳定的扩增产物,得到有多态的引物有588对。其中,通过磁珠富集法开发的绿豆SSR引物6 100对,有效扩增3 459对,有效扩增率56.7%,得到多态性引物559对;通过转录组测序开发的绿豆MGCP引物149对,有效扩增126对,有效扩增率84.6%,得到多态性引物21对;通过磁珠富集法开发的菜豆SSR引物424对,有效扩增97对,有效扩增率22.9%,得到多态性引物6对;绿豆STS引物13对,有效扩增9对,有效扩增率69.2%,得到多态性引物2对。表明不同来源和种类的SSR引物在RIL群体亲本中的有效扩增率有明显差别,绿豆EST-SSR引物（84.6%）最高,绿豆STS引物（69.2%）和SSR引物（55.7%）次之,菜豆SSR引物（22.9%）最低。获得一张含有585个标记（499个SSR标记、74个RFLP标记、9个STS标记和3个RAPD标记）的绿豆遗传图谱,图谱总长732.9 cM,包括11个连锁群,每个标记间的平均距离为1.25 cM,平均长度为66.63 cM。每个连锁群长度为45.2-112.8 cM,每条染色体上面的标记数为35-92个,平均53.18个。标记位点数最多的连锁群LG1含92个标记,长度为112.8 cM;标记位点数最少的连锁群LG11仅含有35个标记,长度为48.7 cM。对图谱的585个标记位点进行χ2测验,在P＜0.05和P＜0.01条件下,分别有79个和151个标记表现为偏分离,占总标记位点数的39.3%。【结论】构建了一张目前国内外发表的标记数最多、密度最高的绿豆遗传连锁图谱。     

基于转录组信息的坛紫菜EST-SSR标记的开发及新品系SW-81的种质鉴定

基于坛紫菜（Pyropia haitanensis）转录组序列信息进行EST-SSR标记的开发,并利用多态性SSR标记构建DNA指纹图谱用于坛紫菜新品系SW-81的种质鉴定。结果显示：转录组数据中共检测出9 033个微卫星位点,其中三核苷酸重复类型为绝对优势基元,占比高达95%;经Primer 5.0软件对微卫星位点进行引物设计,并从中随机合成187对微卫星引物进行有效性分析,最终获得92对有效引物,其中42对为多态性EST-SSR标记,多态扩增率约为22.46%;利用开发的多态性EST-SSR标记构建了适用于5个坛紫菜品系的DNA指纹图谱,为新品系SW-81的种质鉴定提供有效的分子检测手段。上述结果表明：坛紫菜基因组中有着丰富的微卫星位点,且同一位点的基因序列在不同品系间存在变异,表现为扩增产物的多态性。基于EST-SSR标记的多态性分析可为坛紫菜种质资源的管理与鉴定提供有效的分子检测手段。     

中国50个甘蓝代表品种EST-SSR指纹图谱的构建

【目的】研究甘蓝DNA指纹鉴定方法,并构建50份中国甘蓝代表品种DNA指纹数据库,为甘蓝品种特异性、真实性、纯度鉴定提供参考依据。【方法】首先,利用6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳技术和来源不同的甘蓝材料对已开发的甘蓝EST-SSR引物进行筛选,获得多态性引物;然后将可用于甘蓝DNA指纹鉴定的核心引物正义链5′末端分别标记TAMRA、HEX、 ROX、6-FAM四种荧光,利用DNA分析仪检测不同等位变异的扩增片段大小,并确定每个等位变异的标准品种。利用核心引物扩增结合标准品种的片段大小,构建中国50个甘蓝代表品种的SSR指纹数据库。通过人工构建模拟群体对‘中甘21’品种真实性进行鉴定,进而对该指纹鉴定技术进行验证。【结果】利用6份来自中国不同生态条件、植物学性状差异较大的甘蓝品种对978对EST-SSR引物进行初步筛选,获得带型清晰、具有多态性的引物128对。进一步根据引物扩增带型清晰、多态性信息指数较高、不同等位变异的带型易于区分、在染色体上分布均匀原则,筛选出20对核心引物。该套引物可以检测甘蓝染色体20个位点的58个等位变异,平均每条染色体上被检测位点2.22个,平均每个位点包含2.9个等位变异,其中引物BoE607、BoE723等位变异数最多为5个,PIC值处于0.34-0.76之间。通过DNA分析仪检测显示等位变异扩增片段长度范围143-296 bp。利用20对核心引物构建50份中国甘蓝代表品种DNA指纹数据库,并阐述了甘蓝SSR-DNA指纹鉴定的应用和技术流程。本研究还对来自甘蓝主产区的31份‘中甘21’品种进行真实性鉴定,结果显示指纹鉴定与田间鉴结果完全一致。【结论】筛选获得20对核心引物,用于构建中国50个甘蓝代表品种DNA指纹数据库,通过构建人工模拟群体对‘中甘21’品种的真实性进行鉴定,准确率达100%。     

山西省吉县刺槐无性系种质遗传多样性的EST-SSR分析

目的了解各对EST-SSR引物检出的等位简单序列重复片段数量,解析吉县良种基地刺槐无性系种质的多态性状况与种质间亲缘关系,为引物利用和刺槐种质遗传管理提供参考。方法利用课题组开发的45对EST-SSR引物进行PCR扩增,使用毛细管电泳仪对产物进行检测,用Popgene 1.32版软件对群体遗传参数进行评估,利用NTsys 2.10e进行聚类分析。结果45对EST-SSR引物中,除了引物RP-24均表现出良好的多态性。44对引物共检测到等位重复序列298个,每对引物检测到2 ~ 15个,平均6.77个。群体观测杂合度（H_o）的变化范围为0.022 7 ~ 0.842 1,平均为0.412 6。期望杂合度（H_e）的变化范围为0.088 7 ~ 0.822 3,平均为0.484 0。引物多态性信息量（PIC）变化范围为0.085 2 ~ 0.796 6,平均为0.444 4。结论该基地的刺槐无性系种质具有较高的遗传多样性。由聚类结果可知,在遗传距离为0.81时,可将96份刺槐无性系种质聚成5类。聚类图在分子水平上显示了刺槐无性系种质间的亲缘关系,研究结果对于利用这些引物用于刺槐的种质评价、资源管理和辅助育种有积极的参考价值。      

胡桃EST-SSR标记的筛选及引物设计

[目的]筛选胡桃的EST-SSR分子标记并对其进行引物设计。[方法]利用生物信息学方法对NCBI网上公开的5213条胡桃（Juglans regia Linn.）ESTs序列进行EST-SSR特征分析,利用利用Primer3.0软件对筛选出的EST序列设计引物。[结果]在ESTs序列中共检索出207个SSR,其中无冗余序列188,检出率为3.97%,平均分布距离为21.12kb,包括92种重复基元,其中以二核苷酸和三核苷酸重复类型为主,分别占总数目的31.40%和35.27%;对随机筛选出的50条SSR引物进行PCR扩增验证,初步筛选出30对引物。[结论]通过对胡桃EST序列中SSR位点的发掘分析,有针对性地设计EST-SSR引物,将为胡桃科EST-SSR分子标记的开发奠定基础。