养殖刺参“腐皮综合征”致病菌——灿烂弧菌的原位杂交检测方法的建立与应用

以养殖刺参“腐皮综合征”的重要致病菌——灿烂弧菌Vibrio splendidus的16S~23S间隔区序列,设计特异性引物,用PCR方法制备地高辛(DIG)标记探针,建立了原位杂交技术检测感染刺参体内灿烂弧菌的技术方法,并利用该方法对人工感染刺参和健康刺参各组织进行检测。结果显示,感染刺参的体壁结缔组织、肌肉组织、肠粘膜上皮、辐水管等组织的原位杂交检测呈阳性,而与健康刺参组织无交叉反应。在感染组织中,阳性信号（显色）强弱清晰,能准确反映出灿烂弧菌的侵染部位及感染程度,这为探明灿烂弧菌的感染途径、感染病程等致病机理研究奠定了基础,也为养殖刺参疾病预防和健康管理提供了技术支撑。     

刺参响应灿烂弧菌侵染差异microRNAs鉴定及靶基因分析

microRNA参与基因的转录后调控,在真核生物的生长发育、细胞分化和免疫防御等过程中发挥重要作用。刺参(Apostichopus japonicus)病害问题已成为产业发展的主要限制因素之一,而其病害发生的分子机制尚待进一步完善。本研究以刺参重大疾病“腐皮综合征”的重要致病原灿烂弧菌(Vibrios splendidus)为侵染菌株,通过人工侵染实验制备患病刺参样本,采用miRNA-seq技术对侵染组(PT16S)和对照组(PT10H)各3头刺参的体壁组织进行miRNA测序,通过相关生物信息学软件对miRNAs进行鉴定和分析,筛选差异表达miRNAs (DEmiRNAs)并预测其靶基因,构建关键调控途径的miRNA-mRNA调控网络。结果显示,PT10H组平均得到5 902 588条有效序列,194个已知miRNA和19个新的miRNA;PT16S组平均得到5 053 529条有效序列,182个已知miRNA和42个新的miRNA。对2组鉴定到的miRNA进行差异表达分析,共筛选到2个上调和11个下调的具有显著差异的DEmiRNAs (P≤0.05),上调的DEmiRNAs靶基因预测结合到3010个靶基因,注释到585个GO terms及24条信号通路(P≤0.05),下调的DEmiRNAs靶基因预测到19 072个靶基因,注释到514个GO terms以及22条信号通路(P≤0.05)。对筛选到的DEmiRNAs进行实时荧光定量PCR (qRT-PCR)验证,显示miRNA-seq与qRT-PCR的一致率达到70%。根据KEGG分析结果构建泛素介导的蛋白水解途径和Notch信号通路的miRNA-mRNA调控网络,结果显示,13个DEmiRNAs分别靶向结合134个与泛素介导的蛋白水解相关的mRNAs和109个与Notch信号通路相关的mRNAs,Aja-miR-184、Aja-miR-2478和Aja-miR-9277p等DEmiRNAs可能参与对Notch信号通路和对泛素介导的蛋白水解的调控。相关研究结果将为刺参疾病发生调控网络建立和机制解析提供依据。     

弧菌对养殖大菱鲆的危害及其防治方法研究新进展

弧菌是细菌性疾病的常见病原,不但会感染大菱鲆(Scophthalmus maximus),还会对人类健康造成重大危害.大菱鲆是我国重要的海水养殖鱼类,具有较高的经济价值,然而疾病问题严重阻碍了其养殖业的发展.近年来,有关大菱鲆弧菌病检测及防治方面的研究有了新的突破.文章介绍了几种常见弧菌病原对养殖大菱鲆的危害,对新的检...     

刺参腐皮综合征病原灿烂弧菌检测探针的制备及应用

腐皮综合征是近年来养殖刺参发生的严重疾病.发病时,刺参大批死亡,经济损失惨重.以其主要致病原灿烂弧菌(Vibrio splendidus)DNA为模板,PCR扩增出16S-23S核糖体RNA基因间隔区序列,插入pMD19-T,转化大肠杆菌DH5α并测序.根据该间隔区序列,设计引物扩增177 bp的地高辛标记的探针.该探针对灿烂弧菌呈现特异性,而对其它细菌V. Fluvialis,V. Anguillarum,V. Alginolyticus,Aeromonas hydrophila,V. Harveyi,V. Parahaemolyticus,V. Vulnificus均呈阴性.探针对灿烂弧菌DNA的检出限为6.25 pg, 具有较高敏感度.用该探针对人工感染以及从青岛、烟台、威海获取的腐皮综合征发病海参和养殖水体进行斑点杂交,灿烂弧菌检出率达100%.结果表明,该探针具有良好的特异性和敏感性,可用于快速检测养殖刺参腐皮综合征的病原灿烂弧菌.用该方法检测刺参腐皮综合征尚属首次,为刺参腐皮综合征的快速诊断和防治提供技术支撑.     

我国刺参养殖常见致病原因及防控要点

刺参（Apostichopus japonicus）是目前我国北方海水养殖的主要品种之一,养殖方式主要有室内工厂化养殖、潮间带筑池养殖、底播养殖、池塘养殖、潮间带沉箱养殖、围网养殖、筏式笼养、多品种混养等。随着刺参养殖面积的逐年扩大,养殖刺参的疾病种类、发病面积及危害程度也日益增长。     

仿刺参腐皮综合征病原灿烂弧菌RPA-Cas13a检测方法的建立

为预防和控制灿烂弧菌引发的仿刺参腐皮综合征,促进仿刺参养殖业的健康可持续发展,利用LwCas13a中特异性CRISPR RNA(crRNA)与靶RNA结合后可激活Cas13a蛋白对外源RNA分子附属切割活性的特征,结合重组酶介导的聚合酶扩增技术(RPA),建立1种针对灿烂弧菌gyrB基因的快速、灵敏、特异的定量检测方法——RPA-Cas13a。RPA-Cas13a可实现在37℃恒温下、60 min内对灿烂弧菌的快速实时检测。灵敏度测试结果显示,RPA-Cas13a检测限为550拷贝/μL(gyrB),与荧光定量PCR的检测灵敏度水平一致;特异性测试结果表明,RPA-Cas13a对创伤弧菌、哈维氏弧菌、鳗弧菌等其他弧菌及产黑假交替单胞菌、嗜水气单胞菌、迟缓爱德华氏菌等常见水产动物病原菌均无交叉反应,特异性较强。RPA-Cas13a方法对仿刺参体表黏液(32份)、养殖池塘水体(15份)和表层沉积物(10份)等57份环境样本的阳性检出率为8.77%,与传统荧光定量PCR方法的检出一致性高(Kappa=1.00),无统计学差异(P>0.05)。试验结果表明,灿烂弧菌的RPA-Cas13a...     

刺参腐皮综合征重要病原灿烂弧菌DNA的探针制备及应用

腐皮综合征是近年来刺参养殖最重要的疾病,导致刺参大批死亡和惨重的经济损失。以其主要致病原灿烂弧菌（Vibrio splendidus）DNA为模板,PCR扩增出16s-23s间隔区序列,将该片段克隆进pMD19-T Vector,转化大肠杆菌DH5a,获得重组质粒转化菌并进行测序。根据序列、设计引物,合成177bp的地高辛标记DNA探针。该探针对灿烂弧菌的DNA呈现特异性,而对其它细菌Vibrio fluvialis、Vibrio anguillarum、Vibrio alginolyticus、Aeromonas hydrophila、Vibrio harveyi、Vibrio parahaemolyticus、Vibrio vulnificus的核酸均呈阴性;探针对灿烂弧菌DNA的检出极限为6.25pg, 具有较高敏感度。应用该探针对人工感染以及从青岛、烟台、威海获取的腐皮综合征发病海参和养殖水体进行斑点杂交探针检测,其检出率均为100%。研究结果表明,该探针具有良好的特异性和敏感性,可成功用于快速检测养殖刺参“腐皮综合征”重要病原灿烂弧菌。该方法应用于刺参腐皮综合征的检测尚属首次,它将为刺参腐皮综合征的快速诊断、疾病防治和养殖生产提供技术支撑和参考。     

刺参池塘养殖方法

一、池塘养殖 养殖池以长方形、南北走向为好，南北各设１个进、排水闸口，海水更换依靠自然纳潮，每天换水量为３０％，保持水深７０～１２０ ｃｍ。池中可设人工海参礁，用水泥和瓦片错差叠加而成，也可用其他材料制作，目的是给参苗创造良好的栖息环境。体长１ｃｍ的小参苗要用网袋投放：网袋口半开，让参苗慢慢爬出来。４～５ｃｍ的大参苗可直接投入池内。投放密度每平方米１０～２０只。 二、病害防治 稚参培育阶段正值夏季高温季节，加之培育密度过大，稚参易患具传染性的“溃烂病”。主要症状是稚参的皮肤溃烂，直至躯体全部烂掉而只…     

灿烂弧菌和创伤弧菌的不同保存方法比较

比较了琼脂斜面、穿刺石蜡保存法和甘油冷冻冻存法保存灿烂弧菌和创伤弧菌的效果。结果表明,甘油冷冻冻存法和穿刺石蜡保存法的保存期显著比琼脂斜面法长,保存12月后各保存方法细菌的毒力都有不同程度的下降,甘油冷冻冻存法显著好于其它2种保存方法。     

刺参养殖池塘大型藻防控技术

作为重要的养殖品种,近年来,刺参养殖在大连地区沿海广泛开展,已经成为农业支柱性产业之一.随着刺参养殖产量和规模不断扩大,存在的问题也随之显现,其中主要的一点是池塘中大型藻的大量繁殖,大批死亡影响了刺参的生长. 在大连地区刺参养殖池塘中大型藻的出现一般分为两个阶段:第一阶段是3月～5月化冰后随着水温的升高,一些以浒苔等为主的绿藻门大型藻类开始生长,这些藻类大多为低温种类,当水温在24℃后陆续死亡.第二阶段是6月～9月水温持续在25℃以上的高温期以刚毛藻为主的大型藻类大量繁殖,进入秋季随着水温下降逐渐死亡.     

池塘养殖刺参病原菌塔式弧菌的分离与鉴定

||2013年春季,福建漳州地区池塘养殖刺参（Apostichopus japonicus）感染不明病原而患病。病参表现出排脏、身体萎缩、体表溃烂等症状,俗称为腐皮综合征。为确定引起该病的病原菌,从患病刺参病灶部位分离得到1株优势菌FJY001,经回接感染试验,证实所分离的细菌为刺参的病原菌。经形态、生理生化、16S rRNA序列分析和Biolog微生物自动鉴定系统等多项指标鉴定,确定该病原菌为塔式弧菌（Vibrio tubiashii）。     

应用PCR方法检测刺参腐皮综合征病原——灿烂弧菌

腐皮综合征是近年来刺参养殖最主要的疾病,导致刺参大批死亡和惨重的经济损失.根据其主要致病原灿烂弧菌(VibrioQQQsplendidus)的16S～23S间隔区序列,设计特异性引物,利用PCR技术,从纯化的V.splendidus DNA中成功地扩增出产物大小为177bp的DNA片断,并对此方法的灵敏度和特异性进行了研究.结果表明,PCR技术对V.splendidus DNA的检测灵敏度为0.5pg,并且对灿烂弧菌的DNA呈现特异性,而与其他细菌V.Fluvialis、V.Anguillarum、V.Alginolyticus、Aeromonas hydrophila、V.Harveyi、V.Parahaemolyticus、V.Vulnificus的DNA均无交叉反应.应用PCR技术对人工感染的以及取自青岛、烟台和威海的腐皮综合征发病海参进行检测,其检出率均为100%.研究结果表明,PCR方法具有良好的特异性和敏感性,可成功用于快速检测养殖刺参腐皮综合征原灿烂弧菌.在国内,该方法应用于刺参腐皮综合征的检测尚属首次,它将为刺参腐皮综合征的快速诊断及防治提供又一新的方法.     

全国及主要刺参养殖省份刺参养殖状况分析

本文对最近6年全国及7个刺参主要养殖省份（山东、辽宁、河北、江苏、浙江、福建、广东）刺参养殖产量及养殖面积进行了研究分析。结果表明,6年中,全国刺参绝对产量呈递增趋势,由2006年的75 725 t增加到2011年的137 754 t,其中2010年产量增加较大,比2009年增加28 144 t。全国刺参产量在全国海水养殖产量的比重逐年增大,由2006年的0.52%增大到2011年的0.89%。全国刺参绝对养殖面积2007年最小为64 386 hm2（公顷）,2009年最大为153 626 hm2。全国刺参养殖面积占全国海水养殖面积百分比先升高后降低,2006年最低为4.75%,2009年最高达到8.35%。全国刺参单位面积产量2007年最高,2009年最低。辽宁省、山东省是刺参养殖两大省份,其刺参产量之和占全国刺参产量的91.4%~98.1%,并且逐年下降;其刺参养殖面积之和占全国刺参养殖面积的92.6%~99.0%,也呈逐年下降趋势。南方各省刺参产量占全国刺参产量的比重正在逐年增大,尤其是福建省2011年已成为继山东、辽宁之后的第三大刺参养殖大省。     

池塘养殖刺参大型藻类生态防控技术

正大型藻类过度繁殖是刺参池塘养殖的主要危害之一,其防治方法主要包括药物杀灭、人工捞取和生态防控三种。药物杀灭对刺参和水环境有一定毒副作用,人工捞取需耗费大量人力物力,且很难捞净,生态防控能从源头上防控大型藻类过度繁殖,还能改善池塘环境,提高刺参质量安全水平。在全社会对水产品质量安全和养殖环境生态安全日益关注的今天,健康环保地防控大型藻类,已成为刺参池塘养殖的重要内容。     

池塘养殖刺参增产实用技术之防控青苔

冥冥中,刺参养殖和青苔结下了不解之缘,不长青苔的池塘或参圈,刺参也不爱长;但长了青苔,又怕长满池子,腐烂变质、臭底,对刺参造成直接损失。不论是沙底还是泥地都会长青苔,但少量的青苔对于池塘净化水质,促进剌参生长都有益处,如何控制好青苔逐渐成了刺参养殖成败的一个关键性因素,下面就结合笔者多年的实践经验,谈谈如何防控青苔：     

仿刺参硫酸软骨素合酶1基因克隆及灿烂弧菌感染后的表达特征模式分析

硫酸软骨素在生物体应对病毒和细菌感染中起着重要作用, 为研究硫酸软骨素合酶 1 (chondroitin sulfate synthase-1, ChSy-1)在仿刺参(Apostichopus japonicus)受到灿烂弧菌(Vibrio splendidus)感染后的作用, 本研究开展了仿刺参 ChSy-1 基因(AjChSy-1)全长序列克隆和结构及系统进化分析, 并采用荧光定量 PCR 技术测定了该基因在刺参不同组织中的表达差异及灿烂弧菌感染下的表达模式。结果显示, AjChSy-1 基因 cDNA 全长为 2756 bp, 其中, 5′-UTR 长度为 194 bp, 3′-UTR 为 228 bp, ORF 为 2334 bp, 编码 777 个氨基酸。AjChSy-1 基因编码的蛋白含有糖基转移酶保守性 DXD 基序、β3-糖基转移酶基序及 β4-糖基转移酶基序等结构。刺参基因组比对发现在 chr13 染色体上存在 2 个 AjChSy-1 基因拷贝。系统进化分析表明, 刺参 AjChSy-1 编码蛋白与玉足海参(Holothuria leucospilota) 和棘冠海星(Acanthaster planci)的蛋白亲缘关系较近, 与斑马鱼(Danio rerio)、智人(Homo sapiens)等脊椎动物的蛋白亲缘关系较远。荧光定量 PCR 显示, AjChSy-1 基因具有广泛的组织表达特性, 其中, 体腔细胞中表达量最高, 体壁、性腺(雄性和雌性)和纵肌次之。在响应灿烂弧菌侵染过程中, 随灿烂弧菌侵染时间增加, 体壁中 AjChSy-1 表达量呈现先上升后下降的趋势, 在第 3、6、9 天分别为对照组的 1.79、2.06、3.12 倍, 对发病期抗病群体和易感群体中该基因的检测结果表明, 易感群体体壁该基因表达量显著低于抗病群体(P＜0.05), 表达量降低 11.4%。推测该基因可能在刺参应对灿烂弧菌中发挥免疫防御作用, 相关研究结果为解析刺参 AjChSy-1 基因功能以及抗病分子调控机制提供了参考数据。     

水产养殖中轮虫的危害及防控措施

近年来,池塘放养密度不断加大,水体富营养化及养殖底质进一步恶化,加上环渤海地区水体盐度低,致使轮虫大量繁殖,给水产养殖带来巨大危害。针对这种情况,就轮虫的生态习性、危害及防治措施简述如下。     

噬菌蛭弧菌——养殖刺参疾病生物防治的新工具

噬菌蛭弧菌是一种专门以捕食细菌为生的寄生性细菌,对诸多水产动物病原菌都有吞噬作用。养殖刺参的疾病以细菌性病害为主,利用噬菌蛭弧菌可以预防刺参疾病的发生。     

对刺参养殖密度的建议

刺参是我国传统的名贵海产品,具有很高的食用和药用价值。在刺参的养殖过程中密度是关键。根据试验,体长4cm的大酋,放养密度适于在2万头／亩以下;浅海网围养殖,放养密度为1万一1．5万头／亩;沉箱养殖,最好位于海带或扇贝养殖筏架下,建议投苗量也不超过60头／平方米。对刺参养殖密度的建议     

蛭弧菌的生物学特性及其在刺参养殖中的应用前景

蛭弧菌是一种以捕食细菌为生的寄生性细菌,对诸多水产动物病原菌具有吞噬和裂解作用。蛭弧菌能够预防水产动物的细菌性疾病、改善养殖环境以及增强水产动物机体免疫力。养殖刺参的疾病以细菌性病害为主,利用蛭弧菌可以预防刺参疾病的发生。关键词蛭弧菌水产养殖刺参应用前景