鳜鱼传染性脾肾坏死病毒(ISKNV)的快速PCR检测方法灵敏性的比较

传染性脾肾坏死病毒(ISKNV)是鳜鱼重大疫病病原,该病毒引发的鳜鱼传染性脾肾坏死病(Infection spleen and kidney necrosis)能导致养殖生产巨大经济损失。为满足水产疫病预防与诊断需求,该文将一种集DNA快速提取与PCR快速扩增为一体的分子生物学检测方法与试剂盒提取DNA法和传染性脾肾坏死病毒检测方法(SC/T7211-2011)中PCR方法进行比较,旨在为基层水产一线水生动物疫病预防与控制提供一种快速检测方法。     

现代生物技术检测对虾病毒病在商业化应用中的限制

对虾病毒性疾病有多种,如白斑病毒、桃拉病毒、黄头病毒等。多年来,科研人员对病毒病的诊断方法进行了大量的研究,现代生物检测技术得到较多应用,如酶联免疫吸附（ELISA）、聚合酶链式反应（PCR）、核酸探针斑点杂交等,发表了较多提取病毒、改进病毒检测方法等文章。检测方法越来越简易、灵敏,并开发有WSSV、TSV等病毒检测试剂盒。利用现代生物检测技术诊断对虾病毒病对监测养殖生产中的疾病流行趋势有一定的作用,但各种检测方法大都局限于国家机构的实验室进行,难以大规模商业化应用。是什么原因使先进的检测技术无法服务于养殖生产？现结合生产以及科研实践进行多方面探讨,供参考。     

现代生物技术检测对虾病毒在商业化应用中的限制

对虾病毒性疾病有多种,如白斑病毒、桃拉病毒、黄头病毒等。多年来,科研人员对病毒病的诊断方法进行了大量的研究,现代生物检测技术得到较多应用,如酶联免疫吸附(ELISA)、聚合酶链式反应(PCR)、核酸探针斑点杂交等．发表了较多提取病毒、改进病毒检测方     

对虾防病养殖研究新进展

中科院上海生化所在测定对虾病毒的基因DNA部分序列的基础上,建立的对虾病毒PRC(聚合酶链式反应)检测方法,具有很高的灵敏、准确、专一性强的特点,其灵敏度可在0.1微克左右的患病虾组织中检出病毒。中国水产科学研究院东海水产研究所科技人员经3年的“对虾弧菌病病原理及防治技术研究”。从三省一市养殖病虾中分离出53株弧菌,并对其致病性、生物学特性作了研究,表明副溶血弧菌、溶藻弧菌、鳗弧菌、非01群霍乱弧菌是对虾主要常见致病菌。并从21种药物中筛选出10种对对虾弧菌病高度敏感的抗菌药。南美白对虾6年前由中科院海洋所的专家引进后开展一系列的试验研究。获得大批量的育苗成功。南美白对虾是世界三大虾种之一。具有水环境、饵料要求低、全年皆可繁殖,抗病力强、生长期短等特点,是一种开发价值很高的养殖品种。中国水产科学研究院东海水产研     

杂交鳢(斑鳢♀×乌鳢♂)弹状病毒TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

为了建立一种能在临床上快速、准确检测杂交鳢弹状病毒(HSHRV)的TaqMan实时荧光定量PCR方法,利用PCR技术扩增HSHRV-C1207 G蛋白的全长序列,构建重组质粒,作为荧光定量PCR的标准品,根据HSHRV-C1207 G蛋白的保守序列,设计合成了一对能特异性扩增143 bp片段的引物和TaqMan探针,以标准品为模板建立HSHRV的TaqMan实时荧光定量PCR检测方法,并对该方法的灵敏度、可重复性和特异性进行评价。结果显示:建立的荧光定量PCR检测方法标准曲线有较好的线性关系,相关系数(R2)为0.999,斜率为-3.290;荧光定量PCR最低可以检测到10个病毒核酸分子拷贝,而传统PCR方法最低可检测到1×103个拷贝;38个平行样品重复性实验组内变异系数为0.84%;对其他6种水产养殖常见病毒均无扩增反应。应用该方法对采集的21份患病鳢样品进行检测,其中18份为阳性,与细胞分离和电镜观察结果相同;以传统PCR方法检测同样的样品,仅13份为阳性。本研究建立的TaqMan实时荧光定量PCR方法灵敏度高、特异性强,能较好的用于临床HSHRV的检测,对病毒病原定量检测与杂交鳢弹状病毒病的快速诊断具有重要意义。     

基于毒力基因的罗非鱼无乳链球菌三重PCR检测方法的建立及应用

无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)作为罗非鱼主要病原,传染力强、致死率高,部分鱼从发病到死亡无明显病症,难以确定鱼体是否携带该病原菌,建立适用于生产一线的无乳链球菌检测技术势在必行。根据GenBank中无乳链球菌透明质酸酶基因(hylB)、青霉素结合蛋白基因(pon A)和CAMP因子基因(cfb)的保守序列,设计3对特异性引物,对多重PCR的反应条件和体系进行优化,建立基于毒力基因的罗非鱼无乳链球菌三重PCR检测方法,并运用该方法检测来自广东省不同地区的罗非鱼组织样品。构建的三重PCR检测方法仅在无乳链球菌中扩增出3条特异性条带,而在罗非鱼和常见的水产病原菌菌株中均未扩增出任何条带,表现出良好的特异性;以无乳链球菌基因组DNA浓度7.24×10~(–5)~5.65 ng/μl为模板进行扩增,该三重PCR能检测到的最低模板浓度为1.81×10~(–3) ng/μl,表现出较高的灵敏度;运用该方法检测188个罗非鱼组织样品,其阳性检出率与常规细菌分离鉴定阳性率一致,以常规细菌分离鉴定为标准,对该三重PCR检测方法进行评价,其诊断敏感性(Dse)和诊断特异性(Dsp)均为100%。结果表明,构建的三重PCR检测方法不仅显著提高了检测的准确度和灵敏度,还可在同一反应中同时检测3种无乳链球菌毒力基因,为无公害水产品中无乳链球菌的快速检疫、水产养殖病害早期预警提供了一种快速、精准和高效的检测技术。     

上海地区养殖罗氏沼虾头部“白点病”的诊断

上海郊区养殖的罗氏沼虾出现了头部“白点病”,造成大量沼虾死亡。患病罗氏沼虾的明显临床症状是位于额角基部的造血组织呈白色不透明状。组织病理学检查表明,病虾造血组织细胞出现异常的嗜碱性包涵体。超微病理研究发现,其造血细胞的细胞质被大量病毒颗粒侵染,该病毒颗粒呈二十面体结构,直径大小为(153±8)nm。聚合酶链式反应(PCR)检测表明,该病毒三磷酸腺苷(ATP)酶基因与十足目虹彩病毒(DIV1)基因序列一致性达100%。根据综合病理和分子检测结果,确认此次上海地区养殖罗氏沼虾“白点病”是由十足目虹彩病毒(DIV1)导致的。文章可为罗氏沼虾“白点病”的诊断和病害防控提供理论依据。     

蛙病毒PCR检测方法的建立与比较分析

为了进一步丰富蛙虹彩病毒检测方法，实验针对蛙病毒3型(frog virus 3,FV3)核衣壳蛋白(major capsid protein,MCP)基因保守区设计一对特异性引物，并选取另外2种蛙病毒PCR检测方法进行对比实验，通过反应体系的优化、反应特异性和敏感性实验，建立了一种针对FV3的PCR检测方法。结果显示，该方法最低检测限可达1.2个拷贝数的病毒粒子，与神经坏死病毒、虾血细胞虹彩病毒、大口黑鲈虹彩病毒、锦鲤疱疹病毒、鲤浮肿病毒、传染性脾肾坏死病毒、加州鲈弹状病毒等常见水产动物致病毒株无交叉反应。临床样品检测表明，该方法所获得的检测结果与另外2种方法一致，结果可靠。本研究所建立的FV3 PCR检测方法，具有简便、快速、敏感度好、特异性高、低成本等特点，可用于FV3蛙病毒的快速诊断和分子流行病学调研。     

用nested—PCR方法快速检测鲑鱼肾杆菌

描述了用嵌套式聚合酶链式反应(nested PCR)快速检测鲑鱼细菌性肾病病原鲑鱼肾杆菌的方法。以BKDR和BKDF为引物,扩增鲑肾杆菌编码57kDa主要可溶性蛋白基因中501bp的DNA片段,再用引物BKDR2和BKDF2扩增其中长度为314bp的DNA片段。用其它15种常见鱼类致病菌验证这两组引物的特异性,结果没有非特异性的DNA片段被扩增出来。用酚抽提法和煮沸加冻融的方法获得的细菌裂解产物,PCR检测的灵敏度均可达到1.8×103CFU·mL-1,用Nested PCR进一步扩增PCR扩增的产物,检测灵敏度可再提高100倍。检测鲑鱼肾杆菌菌悬液与鲟卵的混合物,结果表明,该方法能准确、可靠、快速地检测鲑肾杆菌。     

猪瘟病毒实验室诊断研究进展

猪瘟的实验室诊断中,主要有针对病毒抗原、抗体及分子生物学检测三大类方法。病原检测方法有免疫组化法、酶联免疫吸附试验(ELISA法)、免疫金标记技术等;抗体检测有免疫荧光中和试验(IFCNT)、间接血凝试验(IHA)等;分子生物学检测有反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)等。     

基于牡蛎疱疹病毒DNA聚合酶基因的巢式PCR检测方法的建立及应用

为了建立适用于Os HV-1不同变异株的检测方法,在牡蛎疱疹病毒(Os HV-1)3个变异株全基因组序列比对的基础上,筛选到牡蛎疱疹病毒基因组中高度保守的DNA聚合酶(DNA polymerase)基因,据此设计巢式PCR引物,优化PCR反应体系和条件,建立了基于Os HV-1 DNA聚合酶基因的巢氏PCR检测方法(P-n PCR检测方法),利用P-n PCR与Cn PCR检测方法对不同年份和宿主来源的Os HV-1疑似感染样本进行检测。结果显示,Pn PCR检测方法能稳定地检出100拷贝/μL的病毒DNA;P-n PCR较C-n PCR检测方法具有更强的特异性和更高的检出率。研究表明,本研究建立的P-n PCR检测方法适用于Os HV-1不同变异株的检测,可为该病毒的检测和流行病学调查提供可靠的技术支持。     

PCR技术在水产养殖动物细菌性病原检测中的应用

近年来PCR技术的迅速发展，带动了水产病原的检测技术不断向着快速、准确的方向发展。文章回顾了PCR技术在水产养殖动物细菌性病原检测中应用，并对水产养殖细菌性疾病诊断技术的发展方向作了展望。     

中国对虾杂交优势对自然感染白斑综合征病毒的抗病力分析

中国对虾杂交优势对自然感染白斑综合征病毒的抗病力分析=Analysis of the resistance of heterosis in Fenneropenaeus chinensis to natural infection with white spot syndrome virus ［刊,中］/李素红（中国水产科学研究院黄海水产研究所,青岛 266071),张天时,孟宪红,孔杰//水产学报,—2007,31(1).-68～75 一个包括42个全同胞家系的中国对虾选育群体,荧光标记后每个家系各取40尾健康个体混养,自然发病并确认感染白斑综合征病毒(white spot-syndrome virus,WSSV)。发病1周后将所有个体取出,统计各家系的存活率,并对活体利用巢式聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)进行WSSV检测。对存活率进行分析,结果显示：4个家系的存活率在60％以上,7个家系的存活率在20％以下;存活率与第一次扩增阳性率、第二次扩增阳性率呈不显著负相关。第一次扩增阳性率与第二次扩增阳性率呈极显著正相关。结合两次扩增的阳性率分析得出：青岛野生群体内自交产生的一个家系和韩国群体养殖家系与乳山野生群体杂交产生的一个家系在抗病力上显著优于其它家系;经独立样本t检验表明,群体间交配组合的存活率差异不显著,因此家系选育可能是进行抗WSSV品种选育的重要途径。多重比较结果发现：韩国群体养殖家系(♂)与乳山野生群体(♀)杂交后代的存活率(56.20%±8.75%) 显著高于韩国群体养殖家系自交后代(22.50%±2.50%) (P<0.05),说明该杂交后代在抗WSSV方面有一定程度的杂种优势。而韩国群体养殖家系 (♂)和乳山野生群体(♀)的杂交后代所表现的杂种优势(26.95)与其反交后代(3.85)差异显著。图3表5参15 关键词：中国对虾; 巢式PCR; 白斑综合征病毒 E-mail:kongjie@sina.com     

猪流行性腹泻病毒诊断技术概述

猪流行性腹泻病毒(PEDV)是一种能够导致哺乳仔猪出现严重肠道疾病的病原,危害严重。因此,正确且快速地诊断PEDV感染对于该病毒的防控至关重要。目前已经研究出一些诊断方法可有效用于PEDV蛋白质或核酸的检测,包括病毒分离,免疫荧光(IF),免疫组化(IHC),聚合酶链反应(PCR)和等温扩增测定。另外,也研究出了几种血清学测定方法,用于检测PEDV的抗体。就PEDV当前的诊断方法进行概述,比较它们之间的优劣,为临床诊断和实验室研究提供参考。     

快速检测水产动物疫病免疫技术研究

水产动物疾病的危害出现了日益严重的趋势,迫切需要各种灵敏、准确、快速的检测技术,其中免疫学方法以高特异性、高灵敏度在近20年里已广泛应用于水产动物疾病诊断,包括单克隆抗体技术、免疫荧光技术、免疫酶技术、免疫印迹等。免疫学方法比传统方法在许多方面有了较大进步,但也存在一些问题,随着现代分子生物学技术的高速发展,聚合酶链式反应(PCR)和核酸杂交等手段使免疫诊断显示了更加巨大的应用前景。一、单克隆抗体技术单克隆抗体与常规血清抗体相比,特异性强,能识别单一抗原决定簇,且容易制备,在对抗原,尤其是细胞表面抗原的特异性诊…     

猪圆环病毒2型快速检测方法研究进展

猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)可以引起猪生殖和呼吸道疾病、断奶仔猪综合征、皮炎和肾炎等，给全球养猪业造成了严重的经济损失。快速、精准的检测方法对该病毒的防控尤为重要。对近年来国内外已发表的PCV2快速检测方法的原理、特点及检测应用进行综述，主要介绍了基于PCR的检测方法(常规PCR、巢式PCR、荧光定量PCR、多重PCR、纳米PCR、数字PCR及其他基于PCR的方法)、核酸等温扩增技术(环介导等温扩增、重组酶介导等温核酸扩增、重组酶聚合酶扩增)、基因芯片、原位杂交、液相芯片系统以及免疫学检测方法(免疫层析技术、酶联免疫吸附试验、琼脂扩散试验、斑点测点法、表面等离子体共振技术)。此外，也对相关方法的未来发展方向进行了展望，以期为我国有效防控PCV2传播和感染提供科学而全面的参考。     

实时荧光定量PCR技术及其在水生动物病毒病定量检测中的应用

聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction, PCR)是美国科学家Mullis于1983年发明的一种在体外快速扩增特定基因的方法,其最早的应用报道是Saiki等[1]1985年应用于β-珠蛋白基因的扩增和镰状细胞性贫血的诊断分析.     

WSSV和IHHNV对虾病毒的胶体金免疫层析快速检测

为了快速、方便地检测出这2种病毒,研究将PCR核酸扩增的高灵敏度和胶体金免疫层析技术快速、简便、直观的优点结合起来,建立了同时检测2种对虾病毒(WSSV和IHHNV)的同步PCR-胶体金免疫层析检测方法。采用了生物素标记和地高辛(Digoxigenin)标记引物。PCR扩增产物利用胶体金免疫层析技术进行检测。胶体金免疫检测试剂条的检测线(T线)处的层析膜处点上地高辛的单抗,经地高辛标记的PCR扩增产物可在T线上被检测到,在10 min内即可得到检测结果。同时,在PCR过程中使用UNG(尿嘧啶-DNA糖基酶),极大地控制了遗留污染。通过此方法检测对虾WSSV和IHHNV病毒的灵敏度均可达到10~100个拷贝,高于国家标准PCR检测法10~100倍。此检测方法让工作人员避免了接触有毒和诱导突变的试剂,免除基层检测实验室购买电泳设备和荧光检测系统的投资。     

对虾黑鳃病、红体病的诊断及防治

对虾是我国水产经济动物的一大品种,随着人工养殖时间的延长,对虾自身抗病力减弱,环境污染,病原体较多,对虾病害已成为威胁对虾养殖业的一个严重问题。多年来,我们对养殖对虾主要疾病的病原及防治方法进行了深入的研究,在养殖过程中建立了严格的消毒措施,控制病毒的传播途径，建立了实用、灵敏、准确的病原监测程序，推广使用快速、灵敏的对虾病毒检测技术（PCR检测方法及核酸探针检测方法），     

特种水产养殖动物病毒病原的研究现状

本文举例阐明了病毒(及类似病毒)病原引起的突发性传染病给我国特种水产养殖业带来的重大损失和潜在威胁;分别对国内外爬行动物(包括鳖)、两栖动物(包括蛙)、虾、鳗等特种水产养殖动物病毒病原研究的情况进行了概述;将已知的病毒种类和中英文名称,按不同宿主归类列出;并根据最新资料以及有关工作进展情况,对上述几种特种水产养殖动物病毒病原研究的动态作了简介。