黑曲霉GAⅠ基因的克隆及在P.pastotis中的分泌表达

采用RT-PCR技术，从黑曲霉的菌丝体RNA中扩增出葡萄糖淀粉酶GAⅠ的结构基因，将其连接到pPICZαA载体中，转入巴斯德毕赤酵母GS115中，获得8株重组酵母：甲醇诱导目的蛋白分泌表达，葡萄糖淀粉酶酶活最高达174U／mL，占上清液蛋白的36％。     

黑曲霉GAⅠ基因的克隆及在P.pastoris中的分泌表达

采用RT-PCR技术,从黑曲霉的菌丝体RNA中扩增出葡萄糖淀粉酶GAI的结构基因,将其连接到pPICZαA载体中,转入巴斯德毕赤酵母GS115中,获得8株重组酵母;甲醇诱导目的蛋白分泌表达,葡萄糖淀粉酶酶活最高达174 U/mL,占上清液蛋白的36%.     

正调控元件拷贝数对黑曲霉PglaA启动子的影响

为获得转录水平更高的强启动子,提高黑曲霉中重组蛋白表达量,研究在黑曲霉葡萄糖淀粉酶基因启动子PglaA基础上,构建分别含2、4、6个拷贝的正调控元件片段PglaA2R、PglaA4R、PglaA6R启动子。以黑曲霉木聚糖酶基因xynB为目的基因,研究正调控元件拷贝数对PglaA启动子的影响。构建黑曲霉表达载体pSZHG2R-xynB、pSZHG4R-xynB、pSZHG6R-xynB,采用农杆菌介导法转化黑曲霉CICC2462。获得目的基因表达框整合在葡萄糖淀粉酶基因位点的纯合黑曲霉重组菌株PglaA2R-xynB、PglaA4R-xynB、PglaA6R-xynB。经SDSPAGE检测观察到重组菌株分泌约24.0 ku木聚糖酶蛋白条带。经酶活检测表明,木聚糖酶活力在第8天达最高,重组菌株PglaA4R-xynB(7 705.36 U·mL~(-1))、PglaA6R-xynB(8 466.32 U·mL~(-1))比PglaA2R-xynB(5 890.77 U·mL~(-1))分别提高1.31倍和1.44倍。荧光定量PCR结果表明,重组菌株PglaA4R-xynB、PglaA6R-xynB的xynB基因mRNA比PglaA2R-xynB分别提高2.2倍和5.3倍。可知,PglaA启动子正调控元件多拷贝显著提高木聚糖酶表达。     

混合发酵对纤维素酶和淀粉酶活性的影响

采用混合培养法 ,研究了假丝酵母对黑曲霉和烟曲霉固态发酵中纤维素酶及淀粉酶活性的影响。结果表明 :1接入少量假丝酵母混合培养 ,可明显提高黑曲霉和烟曲霉纤维素酶系中滤纸酶、羧甲基纤维素酶、微晶纤维素酶及淀粉酶的活性。混合培养时 ,黑曲霉发酵产物中上述 4种酶的峰值酶活较黑曲霉单独培养时分别提高 36 .1% ,11.1% ,16 .2 %及 4 1.8% ;烟曲霉分别提高 2 4 .9% ,5 2 .8% ,4 0 .8%及 16 3.5 %。 2混合培养时 ,在黑曲霉和烟曲霉中 ,除黑曲霉的滤纸酶和淀粉酶外 ,其余纤维素酶和淀粉酶的产酶高峰期较单纯培养提前 2 4 h出现 ,接入酵母菌加快了发酵进程 ,使发酵周期缩短。 3接入酵母菌后 ,黑曲霉和烟曲霉固态发酵产物中细胞外可溶性蛋白质峰值含量 ,较无酵母菌接入时分别提高 34.8%和 4 1% ;且细胞外可溶性蛋白质含量随发酵时间的变化趋势与纤维素酶及淀粉酶的活性变化趋势吻合 ,揭示了混合培养时纤维素酶及淀粉酶活性提高是酶蛋白合成与分泌量增加的结果。 4酵母菌利用了固态发酵中水解形成的纤维二糖等小分子还原糖 ,解除了纤维二糖对纤维素酶和淀粉酶合成的反馈阻遏 ,提高了发酵产物的酶活性。     

1株黑曲霉固态发酵豆渣生产纤维素酶及淀粉酶工艺的优化

以豆渣为主要原料,利用黑曲霉为产酶菌株,在29℃下,通过固态发酵法生产纤维素酶和淀粉酶。单因子和正交试验结果表明,产纤维素酶的最佳条件为:15 g干豆渣、含水量55%、黑曲霉接种量1.7 mL、培养时间84 h;产淀粉酶的最佳条件为:15 g干豆渣、含水量60%、黑曲霉接种量1.5 mL、培养时间60 h。在此条件下,纤维素酶活力达475 U/g,淀粉酶活力为198 U/g。说明利用黑曲霉对豆渣进行固体发酵产酶是可行的,具有良好的应用前景。     

运动发酵单胞菌表达载体的构建

能源和环境问题是目前制约世界经济发展的两大难题,利用微生物生产燃料乙醇,已引起各国的普遍关注。运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)是目前发现的乙醇发酵能力最强的微生物之一,但其只能以葡萄糖、果糖和蔗糖为底物。为了扩大运动发酵单胞菌的底物利用范围,本研究构建了重组表达载体pBPSG、pBPSE、pBPSGE,将瑞氏木霉内切葡聚糖酶基因和黑曲霉葡萄糖淀粉酶基因引入运动发酵单胞菌ATCC31821,在运动发酵单胞菌内源强启动子和转录终止信号的调控下获得表达,在胞外和胞内都检测到了活性,这为下一步试验打下基础。     

赤霉素对黑曲霉发酵法生产葡萄糖酸的影响

[目的]探索赤霉素对黑曲霉发酵法生产葡萄糖酸的影响。[方法]还原糖采用3,5-二硝基水杨酸比色法测定,用紫外分光光度计测定菌液浓度。[结果]不同浓度的赤霉素对黑曲霉生长都有促进作用,质量浓度为0.05、0.10、0.50、1.00、1.50 mg/L的5个处理组64h后菌浓度分别比对照组提高了25.12%、35.39%、32.16%、50.44%和31.38%,最佳质量浓度为1.00 mg/L。同时,对各组发酵液进行还原糖测定,表明赤霉素对葡萄糖转化为葡萄糖酸有促进作用,其最佳质量浓度为1.00 mg/L。[结论]在一定的浓度范围内,赤霉素对黑曲霉生长和摇瓶发酵的提高是有效果的。     

葡萄糖氧化酶的应用进展

葡萄糖氧化酶是需氧脱氢酶,易溶于水,不溶于有机溶剂,主要与过氧化氢共同作用催化葡萄糖产生葡萄糖酸,同时消耗氧。工业生产多从黑曲霉中提取,无毒、无害,具有去除葡萄糖、脱氧、杀菌等功能,广泛应用于食品、饲料、医药、检测试纸和生物传感器等方面。本文综述了葡萄糖氧化酶的研究及其应用进展。     

昼夜变温促进小麦幼苗生长的酶学研究

从酶学角度对昼夜变温促进小麦生长进行了研究。发现昼夜变温条件下生长的小麦幼苗其淀粉酶和葡萄糖－６－磷酸脱氢酶的活性具有昼夜周期特性,白天活性较高,夜晚较低,而恒温条件下生长的小麦幼苗则无此特性。另外测得两种酶活性最适温度淀粉酶是３５℃,而葡萄糖－６－磷酸脱氢酶为３０℃。     

响应面法优化黑曲霉发酵产葡萄糖酸的研究

[目的]建立黑曲霉发酵产葡萄糖酸的理论预测模型,降低葡萄糖酸的生产成本。[方法]采用响应面法研究pH值、温度、发酵罐转速和葡萄糖浓度及其交互作用对葡萄糖转化为葡萄糖酸的影响。根据影响因素与响应值之间的回归方程得最佳发酵条件。[结果]pH值、温度、转速和初始葡萄糖浓度对响应值的影响显著。失拟项的p值为0.052 374,回归方程的R2为95.50%。模型验证结果表明,模型预测值和实测值吻合极好。在最佳条件(pH值6.0,温度30.7℃,转速267 r/min初始葡萄糖浓度125.2 g/L)下,响应值最大(0.947 38),黑曲霉发酵试验数据稳定,且葡萄糖转化率比原始条件(pH值6.0,温度30℃,转速240 r/min,初始葡萄糖浓度100 g/L)下的高,平均可达93%。[结论]在最佳发酵条件下,实际试验值与模型预测值基本一致,预测模型能较好地反映实际情况。     

黑曲霉β-葡萄糖苷酶水解大豆异黄酮糖苷研究

试验进行了黑曲霉生产β-葡萄糖苷酶研究;该黑曲霉β-葡萄糖苷酶有较高的热稳定性,50℃加热2h后酶活力减少为原来的92%。确立了该黑曲霉β-葡萄糖苷酶水解大豆异黄酮糖苷反应最佳方案;通过与酸水解和苦杏仁β-葡萄糖苷酶水解效率比较,发现该黑曲霉β-葡萄糖苷酶有较好的水解大豆异黄酮糖苷的能力。     

丁香[Syzygium aromaticum (L.) Merr.et Perry]挥发油中天然抗菌成分研究

研究结果表明，丁香[Syzygium aromaticum(L．)Merr．et Perry]挥发油及其衍生物均可抑制黑曲霉(Aspergillus niger)和扩展青霉(Penicillium expansun)的生长，丁香挥发油对黑曲霉的最小抑菌浓度为50％，对扩展青霉的最小抑菌浓度为25％；丁香挥发油衍生物对黑曲霉的最小抑菌浓度为25％，对扩展青霉的最小抑菌浓度为20％。用GCMS详细分析了丁香挥发油的化学成分，共鉴定了20个化合物，其中主要成分为丁香酚，含量占挥发油成分总量的68．0278％。     

抗黑曲霉乳酸菌筛选及其抑菌性能研究

本文以10株小米发糕源乳酸菌为研究对象,采用双层平板划线法和96孔板法筛选出对黑曲霉具有较好抑制效果的乳酸菌株,并以乳酸菌对黑曲霉菌落的抑菌率为指标,研究不同pH值、温度、酶处理下乳酸菌对黑曲霉的抑制效果。结果表明：菌株1-6-2X抗黑曲霉效果最好,抑菌率达到87.78%,在pH值3.0～5.0时仍保持抑菌性,有良好的热稳定性,经胃蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶处理后抑菌率显著下降,可作为开发抗黑曲霉乳酸菌的出发菌株。     

桔梗总皂苷与桔梗总次皂苷祛痰作用的比较

采用小鼠酚红祛痰法比较了桔梗总皂苷及桔梗总次皂苷的祛痰作用。试验结果表明:桔梗总皂苷及黑曲霉转化的桔梗总次皂苷均能增加小鼠呼吸道酚红排泌量(P<0.05)。桔梗总皂苷及桔梗总次皂苷的高、中剂量组有较强的祛痰作用。     

麸皮、黑曲对玉米醋功能性的强化作用

为了研究在发酵过程中添加麸皮以及黑曲对成品玉米醋功能性的影响,利用分光光度法测定了玉米醋、麸皮玉米醋、麸皮黑曲玉米醋对二苯代苦味酰基自由基(DPPH.)的清除率及其总抗氧化能力,并通过动物试验比较了在发酵过程中添加麸皮和黑曲酿制的成品醋对小白鼠的减肥降脂作用。结果表明,麸皮玉米醋和麸皮黑曲玉米醋对二苯代苦味酰基自由基(DPPH.)均有很强的清除作用,麸皮黑曲玉米醋的清除率最高;麸皮黑曲玉米醋的体外总抗氧化能力高于麸皮玉米醋;通过对小鼠血清总胆固醇、甘油三脂、高密度脂蛋白、生殖器周围脂肪总重及脏器系数的比较分析发现,麸皮黑曲玉米醋和麸皮玉米醋较玉米醋的减肥降脂效果更为明显,表明在发酵过程中添加麸皮和黑曲可显著增强玉米醋的功能性。     

黑曲霉菌渣资源化再利用途径分析

黑曲霉菌渣是黑曲霉发酵法生产葡萄糖酸钠后产生的废弃物,其资源化利用已成为企业扩大生产亟需解决的问题。对该菌渣有效成分检测得知,该菌渣有害金属元素均小于城镇垃圾农用控制标准、有机-无机复混肥料控制标准和鱼粉、猪、家禽添加剂预混合饲料卫生指标,有机质含量符合有机肥料中的有机质含量指标,总糖、粗纤维、粗蛋白、脂肪等营养成分含量较多,同时也含有丰富的N、P、K、Ca、Mg、Fe等元素,可从有机肥料和禽畜饲料方向进行资源化利用,有利于减轻环境污染及实现变废为宝,具有积极的社会、经济和生态效益。     

石墨材料对黑曲霉和金黄色葡萄球菌生长的不同作用

向PDA培养基中加入膨胀石墨观察黑曲霉的生长,向牛肉膏蛋白胨培养基中加入膨胀石墨观察金黄色葡萄球菌的生长。结果发现:不加膨胀石墨的PDA培养基中黑曲霉菌落直径小于加入膨胀石墨的培养基中黑曲霉菌落直径。不加膨胀石墨的牛肉膏蛋白胨培养基中金黄色葡萄球菌落直径大于加入膨胀石墨的培养基中金黄色葡萄球菌落直径。证实在PDA培养基中膨胀石墨对黑曲霉生长有促进作用,而在牛肉膏蛋白胨培养基中膨胀石墨的加入对金黄色葡萄球菌的生长有抑制作用。     

高产复合酶益生菌的氮离子注入诱变选育

以产复合酶益生菌黑曲霉ANO1为出发菌株,经多次N 注入诱变处理,结合平板透明圈法定向选育,得到高产变异菌株ANO2。结果显示,出发菌株ANO1酸性蛋白酶、纤维素酶和果胶酶的酶活显著提高,分别由71.6IU/g、141.7IU/g和264.8IU/g提高到996.5IU/g、940.4IU/g和906.5IU/g。变异菌株ANO2经传5代培养,产酶特性稳定。同时对原菌株和变异菌株的生物学特性进行了相关的研究,结果表明变异菌株的生物量和产酶量成正相关。     

木聚糖酶高产菌株的诱变选育及产酶条件的研究

试验对黑曲霉进行紫外诱变,结合透明圈法和DNS法从中筛选出一株酶活较高的突变株N86,并对其液体发酵培养基组分进行研究。结果表明,突变株N86的液体发酵培养基最优成分为:麸皮2g,硫酸铵1.0%,葡萄糖0.1%,磷酸二氢钾0.2%,七水合硫酸镁0.05%,吐温-80为0.1%,培养基pH6,250mL三角瓶装液50mL,突变株酶活最高达139IU·mL-1,产酶高峰在72h左右。